穩定化的磷酸酶制劑的制作方法

專利名稱：穩定化的磷酸酶制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有提高的穩定性(優選熱穩定性)的固體或液體磷酸酶制劑，所述穩定性的提高是通過添加穩定劑獲得的。
本發明涉及將磷酸酶(優選植酸酶)配制到含有碳水化合物(如淀粉)的顆粒和/或液體制劑中，并涉及制備這類含酶顆粒和液體制劑的方法。這些(可食用)顆粒和液體制劑可以用于動物飼料和/或人營養物。含酶顆粒和液體制劑表現出提高的儲存和加工穩定性。
背景技術：
在人營養物或動物(如家畜)飼料中使用磷酸酶已經幾乎成為普遍的作法。一般通過在工業酶生產者操作的大規模發酵罐中培養微生物來產生這些酶。在發酵的最后一般對得到的“發酵液”進行一系列的過濾步驟，以將生物質(微生物)與(溶液中)所需的酶分開。然后可將酶溶液以液體出售或加工成干制劑。
飼料業和食品業中以商業規模使用含有磷酸酶(優選植酸酶)的酶液體和干制劑。可以在造粒后將液體制劑加入飼料或食物中，以避免酶在造粒過程中可能出現的熱失活。然而最終飼料或食品制劑中的酶量一般很小，使酶很難在飼料或食品中勻質分布，而且眾所周知，液體甚至比干成分更難于混合。此外，在造粒后向食品中加入液體需要專門的(昂貴)設備，目前在多數食品制造廠中(由于額外的成本)并不具備。甚至在使用含有酶的液體制劑時，這些制劑的儲存穩定性也經常成為問題。
另一方面，磷酸酶(特別是植酸酶)的干制劑具有在造粒中酶熱失活的缺點。飼料和食品工業中優選的生產流程包括蒸汽造粒，其中在造粒前對飼料或食品進行蒸汽注射。在隨后的造粒步驟中將飼料或食品擠壓過基質或模具，并將得到的長條切成各種長度的合適小團。造粒前的含水量一般在10％和20％之間。在該方法中，溫度可能升至60-95℃。高含水量和高溫的組合效應對多數酶是有害的。在其他類型的形變熱處理(如擠壓和膨脹)中也要面對這些缺點。
許多酶生產商已經開發出了替代的制備方法，以嘗試提高干和液體酶產品在造粒和儲存中的穩定性。
EP 0 758 018 A1公開了通過加入無機鹽提高干酶制劑的加工和儲存穩定性的方法。
GB 2 167 758公開了粒化酶的方法和含有酶的顆粒組合物，所述顆粒組合物含有以重量計1％到35％的酶和以重量計從0.5％到30％的合成纖維片或漿。
EP 1 069 832 A1(WO 00/47060)公開了制備含酶顆粒的方法，其中將含有酶的水成液與固體載體和任選的添加劑成分混合并機械加工成顆粒、干燥然后用聚乙二醇包衣。
EP 858 266(WO 97/16076)公開了適合用于生產動物飼料組合物的含酶微粒制劑。
EP 862 623 A1(WO 97/12958)公開了平均顆粒大小從約20到400微米的微粒酶組合物。
所引用的參考文獻均未公開用本文描述的樹膠或動物蛋白質穩定的含有磷酸酶的制劑。
DE 1 958 104描述了制備適于洗滌劑和洗衣組合物的含酶顆粒的方法，其中使用無機或有機酸的堿鹽作為載體。
DE 2 137 043和DE 2 137 042公開了適于洗滌劑組合物的含酶組合物，其中載體由無機鹽組成。
EP 716 685公開了適于摻入洗滌劑和清潔組合物的多酶顆粒，所述顆粒含有酶和無機和/或有機載體材料。
WO 00/36927公開了產生含有酶并適于喂養動物的顆粒的方法。
WO 03/059087描述了制備含酶顆粒的方法，其中將含水液體、任選的添加物與固體載體和/或添加劑成分一起加工成顆粒、干燥并隨后用聚烯烴包被。
WO 03/059086描述了制備含酶顆粒的方法，其中將含水液體、任選的添加物和固體載體和/或添加劑成分一起加工成顆粒、干燥并隨后用含有疏水物質(優選聚烯烴)顆粒的分散系包被。
就飼料應用而言，為了避免在制備(如噴霧干燥、粒化)和飼料加工過程(如造粒、擠壓、膨脹)中可能出現的問題，穩定(優選熱穩定)的磷酸酶是引起廣泛關注的，在所述過程中瞬時高溫(高達80-120℃)、潮濕和剪切應力可能影響蛋白質的結構并引起不希望的活性喪失。
通常為了多種目的向飼料或食品制劑中加入磷酸酶。在食品應用中，在例如焙烤或釀酒過程中加入磷酸酶。在飼料應用中，磷酸酶(特別是植酸酶)的功能常常是(例如通過降低消化物粘度或降低某些飼料化合物的抗營養效應)提高飼料的轉換率。磷酸酶(優選植酸酶)還可用于例如降低糞肥中對環境有害化合物的量。
在所有這些各種應用中，這些酶經常會面臨熱攻擊(如暴露于熱、潮濕或溫度)，這可能引起酶的部分或完全失活。
盡管在飼料中以植酸鹽磷的形式存在大量的磷酸鹽，但是單胃動物(如豬和家禽)缺乏利用這種形式的磷酸鹽的能力。植酸的堿或無機堿鹽主要天然存在于谷類中。由于單胃動物不能利用這種形式的磷酸鹽，因此在動物飼料中加入無機磷酸鹽是一種普遍作法。
另一方面，已知在植物和一些微生物中存在稱為植酸酶(肌醇六磷酸磷酸水解酶)的酶。由于可以通過發酵產生植酸酶，因此在本領域已經了解使用植酸酶作為動物飼料添加劑以通過從植酸(肌醇六磷酸)中釋放無機磷酸鹽來提高植物材料的營養價值。由于動物能夠利用使用植酸酶從植酸中釋放的磷酸，因此通過在動物飼料中加入植酸酶可以降低環境中磷污染的水平。
Gist-Brocades的國際專利申請WO 93/16175(EP 626 010)描述了穩定的植酸酶液體制劑。其建議使用尿素和水溶性多元醇作為穩定劑，其中提到了山梨醇、甘油和分子量6000的聚乙二醇。
Hoffmann-La Roche的歐洲專利申請EP-A1 0 969 089描述了含有植酸酶和至少一種穩定劑的穩定的酶制劑，所述穩定劑選自a)含有5個碳原子的多元醇，優選C5糖，更優選木糖醇或核醣醇；b)分子量600-4000Da的聚乙二醇；c)丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二鈉鹽；d)羧甲基纖維素和e)海藻酸鈉。它還描述了通過與戊二醛的化學反應進行交聯或通過b)用高碘蛋白氧化并隨后加成己二酸二腙進行交聯來穩定植酸酶制劑。
WO 98/54980描述了含有植酸酶的顆粒，WO 98/55599描述了高活性植酸酶液和含有它們的飼料制品。
盡管本領域已有不同的方法，但是仍然需要適于人和/或動物營養物并在加工、造粒和儲存中表現增強的穩定性的穩定化的磷酸酶制劑。該制劑應該易于獲得，并易于與常見食品和/或飼料成分相容。此外，制劑(特別是固體制劑)應該易于加工(如提供低粉塵特性)，易于在所需基質中分散或混合。
提供替代的穩定劑以及改善磷酸酶特別是植酸酶的穩定性(優選熱穩定性)是本發明的目的，其中穩定性定義為在多種條件下保持活性的能力。穩定性的這一方面涉及酶的整個生存周期，包括產生(發酵、下游加工和配制)、分配(運輸和儲存)和最終應用(飼料和/或食品的產生和儲存)。對于具有商業價值的酶(如植酸酶)，能經受在多種飼料和/或食品加工(如造粒、擠壓和膨脹)中達到的高溫度(高達80-120℃)和高濕度并在加入飼料和/或食品后在儲存(特別是在長期儲存)中保持穩定是很重要的。由于最終制劑中穩定劑的量限制了可加入含酶制劑的其他成分，因此提供能以比本領域已知的穩定劑更少的量使用的穩定劑是本發明的另一目的。提供可以特別用于酶混合物的穩定劑是本發明的另一目的。如果從多于一種發酵液中制備酶制劑，那么可以加入到最終制劑中的穩定劑的量是有限的。如果在終產物中需要高的酶濃度并因此可以加入最終制劑中的稀釋劑的量有限時特別需要考慮這一點。在本發明的另一方面中，如果使用酶混合物，穩定劑也應優選不僅穩定一種酶，而是穩定混合物中的所有酶。
本發明中所使用的術語“穩定性”涉及工業酶的所有規格，包括活性、特異性、儲存期穩定性、機械穩定性、微生物穩定性、毒性等方面、化學組成和物理參數如密度、粘度、潮解性以及顏色、氣味和粉塵。本發明優選的方面涉及酶(優選磷酸酶和/或糖苷酶)在配制和飼料和/或食品處理方法(如造粒、擠壓和膨脹)中針對熱失活的穩定性。
廣泛使用磷酸酶特別是植酸酶的主要障礙是這些酶在飼料和/或食品處理方法中抵擋失活所需的熱穩定性(80-120℃)的限制。飼料和/或食品應用中目前可用的多數工業磷酸酶對熱失活的內在抗性不足。作為分子生物學方法的代替或補充，本發明通過加入不同的添加劑增強磷酸酶特別是植酸酶的穩定性(優選熱穩定性)。

發明內容
在本發明的第一個方面中提供了含有至少一種磷酸酶和至少一種穩定劑的穩定化的固體或液體酶制劑，所述穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物，條件是如果在作為固體制劑的顆粒中使用明膠作為唯一的穩定劑，則其后需包被顆粒。
術語“酶制劑”包括其中的磷酸酶(優選植酸酶)可商品化的所有液體和固體制劑。優選地，這些制劑中酶的來源為得自發酵液的粗液體制劑。為了制備本發明的液體酶制劑，可以直接向發酵液中加入所選的穩定劑，或者可通過例如過濾或超濾純化發酵液，然后在過濾步驟以后再加入穩定劑。
為得到穩定的(優選熱穩定的)固體制劑，可在所選定穩定劑的存在下使酶噴霧干燥或粒化。固體制劑優選含有少于15％(w/w)、優選少于10％(w/w)、特別是少于8％(w/w)的水。
在本發明優選的實施方案中，穩定的酶制劑為固體，優選為顆粒形式。
本發明的另一方面提供了制備含有磷酸酶的顆粒的方法，該方法包括加工至少一種磷酸酶、含有至少15％(w/w)可食用碳水化合物多聚體的固體載體和至少一種穩定劑，其中所述穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物，條件是如果在作為固體制劑的顆粒中使用明膠作為唯一的穩定劑，則其后需包被顆粒。本發明的另一方面提供了通過這類方法得到的含酶顆粒。
在本發明的另一方面中提供了包含至少一種磷酸酶、含有至少15％(w/w)可食用碳水化合物多聚體的固體載體和至少一種穩定劑的顆粒，其中所述穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gumkarya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物，條件是如果在作為固體制劑的顆粒中使用明膠作為唯一的穩定劑，則其后需包被顆粒。
在本發明的另一方面中提供了包含至少一種磷酸酶、含有至少15％(w/w)可食用碳水化合物多聚體的固體載體和至少一種穩定劑的顆粒，其中所述穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gumkarya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物，其中包被了顆粒。
通過本方法得到的含有磷酸酶的顆粒尋求解決或至少緩解本領域面臨的問題。因此本發明可提供制備顆粒形式的穩定酶制劑的方法，其中使用碳水化合物作為載體。載體可用為微粒或粉末形式。
固體載體的至少15％(w/w)由可食用碳水化合物多聚體(如淀粉)組成。然而，優選固體載體的至少30％(w/w)含有碳水化合物，最優為至少40％(w/w)。有利地，固體載體的主要組分為碳水化合物(如淀粉)，例如大于50％(w/w)，優選為至少60％(w/w)，適當地為至少70％(w/w)，且最優為至少80％(w/w)。這些重量百分比是基于最終干顆粒中非酶組分的總重量。
應該選擇可食用碳水化合物多聚體使其可被飼料或食品各自的預設動物或人食用，并優選至少可被部分消化。多聚體優選含有葡萄糖(如含有葡萄糖的多聚體)或(C6H10O5)n單位。碳水化合物多聚體優選含有α-D-吡喃葡萄糖單位、直鏈淀粉(線性(1→4)α-D-葡聚糖多聚體)和/或支鏈淀粉(帶有α-D-(1→4)和α-D-(1→6)鍵的分枝狀D-葡聚糖)。淀粉是優選的碳水化合物多聚體。可以作為淀粉的代替或補充使用的其他合適的含有葡萄糖的多聚體包括α-葡聚糖、β-葡聚糖、果膠(如原果膠)和糖原。還考慮了這些碳水化合物的衍生物(如醚和/或酯)，盡管凝膠淀粉最好避免并因此不包括在內。合適的是，碳水化合物多聚體是水溶性的。
合適的碳水化合物多聚體為玉米淀粉、馬鈴薯淀粉和大米淀粉。然而，也同樣可以使用得自其他(例如植物，如蔬菜或作物)來源的淀粉，如樹薯粉、木薯、小麥、小黑麥、玉米、西米、黑麥、燕麥、大麥、甘薯、高粱或竹芋的淀粉。類似的，本發明可以使用天然或修飾(如糊精)類型的淀粉。碳水化合物(如淀粉)優選含有很少或不含蛋白質，如少于5％(w/w)，如少于2％(w/w)，優選少于1％(w/w)。不管哪種類型的淀粉(或其他碳水化合物多聚體)，其都應該是可用于動物飼料的形式，換言之即可食用或至少可部分消化的形式。
可以在加工中加入水。在本發明的另一個實施方案中，在加工后接著干燥顆粒。應該理解，在一個實施方案中，不管在加工中是否加入了水，都可以干燥顆粒。
優選以含酶(優選水成)液體的形式提供酶和水，如能與固體載體混合并吸收到載體上的溶液或漿。將含酶液體和載體在混合時或混合后加工成顆粒，然后可以干燥所述顆粒。使用碳水化合物載體可以吸收大量的含酶液體(從而吸收大量的酶)。可以使用該混合物形成易于加工成顆粒(如可被擠壓)的可塑糊劑或無彈性生面團。
在本發明的方法中，酶和水可以在接觸固體載體前存在于同一組合物中。在這一方面中可以提供含酶的水成液體。該液體可以是來自發酵方法的溶液或漿。該發酵方法一般是產生酶的方法。發酵方法可以得到含有(產生所需酶的)微生物和水溶液的發酵液。一但(如通過過濾)與微生物分離，水溶液就可以成為本發明中所使用的含酶水成液。因此在優選的實施方案中含酶水成液為濾液，特別是來自導致產生酶的發酵方法的濾液。取決于從發酵液中分離酶所使用的方法，酶也可以存在于滲余物中。
可以吸收到載體上的含酶液體的量(因此也是酶的量)通常受限于可以吸收的水量。加入固體載體的液體量優選為使(水成)液體中(基本)所有的水被固體載體中存在的碳水化合物吸收。
在提高的溫度下，淀粉和其他碳水化合物多聚體在膨脹中能吸收更大量的水。出于這個原因，需要碳水化合物多聚體能夠很好的吸收水(或含酶水成液)。例如，玉米淀粉在60℃下可吸收多達三倍于其重量的水，在70℃下則多達十倍。因此本發明考慮使用較高的溫度以吸收更大量的含酶液體，事實上在處理熱穩定酶時是特別優選的。因此對于這些酶可以在提高的溫度(如高于環境溫度)下混合固體載體和液體(或酶和水)和穩定劑，如高于30℃，優選高于40℃且最優為高于50℃。另外，可以在此溫度下提供液體。
然而，一般優選較低溫度(如室溫)下的非膨脹條件。這可以使在較高溫度下酶的(熱敏感)不穩定性引起的活性損失最小化。混合酶和水的合適溫度為從10到60℃，如10到50℃，優選20到40℃，優選20到25℃。
本發明中使酶、任選的水(如含酶液體)、穩定劑和固體載體的混合物成為顆粒的機械加工(換言之即粒化)可以使用食品、飼料和酶制劑方法中常用的已知技術。這可能包括膨脹、擠壓、滾圓、造粒、高剪力粒化、滾筒粒化、流化床團聚或其組合。一般通過輸入的機械能表征這些方法，如螺桿的驅動、混合機械的旋轉、造粒設備的滾動機制的壓力、通過旋轉流化床團聚器的底板的顆粒運動或通過蒸汽的顆粒運動或它們的組合。這些方法使(如粉末形式的)固體載體與酶和任選的水(如含水液體(水溶液或漿))、穩定劑混合并隨后粒化。
另外，可以將固體載體與酶(如粉末形式的)和穩定劑混合，然后可以加入(可作為粒化液的)任選的水，如液體(或漿)。
在本發明的另一個實施方案中，通過將含酶液體噴霧或包被到載體上形成顆粒(如團塊)，所述含酶液體事先與穩定劑(如在流化床團聚器中)混合。由此得到的顆粒可以包括如在流化床團聚器中產生的團塊。
含酶液體、固體載體和穩定劑的混合還優選地包括捏合混合物。這可以提高混合物的可塑性以便于粒化(如擠壓)。
在優選的實施方案中，通過擠壓(優選通過低壓下的擠壓)形成顆粒。該法的優點為被擠壓的混合物的溫度不會提高或僅輕微提高。低壓擠壓包括如在Fuji Paudal籠狀或球面擠壓機中的擠壓。擠壓可以自然產生顆粒(可以在通過模具后折斷顆粒)，或者可以使用切割器。
在干燥前，顆粒合適的含水量為從15％到50％，如20％到40％，如從25％到30％，優選33％到37％。在干燥前，顆粒的酶含量可以從1％到85％，特別是從1％到70％，如2％到60％，優選從1％到50％，優選2％到25％，如3％到15％，如5％到12％(如至少50,000ppm)(均以基于顆粒總重量的重量百分比計算)。
然后可以將得到的顆粒在如滾圓機(如MARUMERISERTM機)中修圓(如滾圓)和/或壓實。如果要干燥得到的顆粒，優選在干燥前進行滾圓。可以在干燥前滾圓顆粒，因為這可以減少在終顆粒中形成粉塵和/或可以利于顆粒的任何包衣。
可以接著在如流化床干燥器中干燥顆粒，或者在流化床團聚的情況下可立即(在團聚器中)干燥以得到(干燥的固體)顆粒。技術人員可以使用食品、飼料或酶工業中已知的其他干燥顆粒的方法。顆粒適當地為易流動的。優選在從25到60℃(如30到50℃)的溫度下進行干燥。干燥可以持續10分鐘到若干小時。所需的時長當然取決于待干燥的顆粒量。
干燥顆粒以后，得到的干燥顆粒優選具有以重量計從3％到10％(如5％到9％)的含水量。
在本發明優選的實施方案中提供了包括如下步驟的方法a)將含有酶的水成液與固體載體以及穩定劑混合；b)機械加工a)中得到的混合物以獲得含有酶的顆粒；和c)干燥b)中得到的含酶顆粒。
其中所述穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物，條件是如果在作為固體制劑的顆粒中使用明膠作為唯一的穩定劑，則其后需包被顆粒。
在本發明的另一實施方案中包被了顆粒。可以對顆粒使用包衣以賦予額外的(如有利的)特征或性質，如低含塵量、顏色、在外周環境中保護酶、在一種顆粒中具有不同的酶活性，或這些組合。可以經過或不經過預先干燥而包被顆粒。可以用脂肪、蠟、多聚體、鹽、油膏和/或軟膏或含有(另一種)酶的包衣(如液體)或它們的組合包被顆粒。顯然如果需要的話可以使用多層(不同的)包衣。可以用多種已知方法將包衣應用于顆粒，包括使用流化床、高剪力制粒機、混合制粒機或Nauta混合機。
在一個實施方案中，(優選在干燥后，如殘留水分以重量計小于10％)用適于飼料的有機多聚體包被顆粒，包括步驟a)在流化床中用有機多聚體的熔化物、溶液或分散系噴霧顆粒，或用有機多聚體在流化床中進行粉末包衣；或b)在混合機中通過熔化有機多聚體包被顆粒，或用有機多聚體的熔化物、溶液或分散系噴霧粗顆粒或用有機多聚體進行粉末包衣。
且必要時的后干燥、冷卻和/或從粗級分中釋放各自得到的多聚體包衣的顆粒。
根據本發明方法優選的實施方案，將顆粒置于流化床中，液化并通過噴霧有機多聚體的水或非水(優選水)溶液或分散系進行包衣。就該目的而言，使用盡可能高濃度并仍可噴霧的液體，如含有以重量計從10％到50％的至少一種多聚體的水或非水溶液或分散系，所述多聚體選自a)聚乙二醇，特別是平均分子量從約400到15000(如從約400到10000)的聚乙二醇；b)平均分子量從約4000到20000(如從約7700到14600)的聚烯烴氧化物多聚體或共聚物，特別是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物；c)平均分子量從約7000到1000000(如從約44000到54000)的聚乙烯吡咯烷酮；d)平均分子量從約30000到100000(如從約45000到70000)的乙烯替砒咯烷酮/乙酸乙烯共聚物；e)平均分子量從約10000到200000(如從約20000到100000)的聚乙烯醇；和f)平均分子量從約6000到80000(如從約12000到65000)的纖維素衍生物，如羥丙基甲基纖維素。
根據另一優選的方法變體，為了進行包衣，使用可噴霧的水或非水溶液或分散系，其含有重量百分比從10到40(優選重量百分比從約20到35)的至少一種選自以下的多聚體g)平均分子量從約100000到1000000的烷基(甲基)丙烯酸鹽多聚體和共聚物，特別是丙烯酸乙酯/異丁烯酸甲酯共聚物和丙烯酸甲酯/丙烯酸乙酯共聚物；和
h)平均分子量從約250000到700000的聚乙酸乙烯酯，可以用聚乙烯吡咯烷酮穩定化。
一般基于以下原因優選水溶液或水分散系不需要使用特殊的措施或回收溶劑；一些包衣材料優選以水溶液或分散系提供。
然而，在特殊情況下，使用非水溶液或分散系也可能是有利的。包衣材料非常便于溶解或可以有利地分散大部分的包衣材料。以這種方式可以噴霧具有高固體含量的噴霧液，從而縮短加工時間。非水溶劑較低的蒸發焓也使加工時間縮短。
將(含有或不含有慣用的分散劑的)上述多聚體分散到水或非水(優選水)液相中得到可根據本發明使用的分散系。優選以以下方式噴霧多聚體溶液或分散系將顆粒裝入流化床裝置或混合器中，并在加熱裝料的同時將噴霧材料噴霧。在流化床裝置中通過與加熱的干燥氣體(常為空氣)接觸提供能量，在混合器中則通過與加熱的壁和適當時加熱的混合工具接觸提供能量。如果能使噴霧材料以高干物質含量噴霧，則預熱溶液或分散系可能是有利的。使用有機液相時，回收溶劑是有利的。包衣過程中產物的溫度應該在從約35℃到50℃的范圍內。原則上可以在流化床裝置中以底部噴霧方法(噴嘴在氣體分布器板上并向上噴霧)或頂端噴霧方法(從頂部向流化床噴霧包衣)進行包衣。
合適的聚亞烷基二醇a)的實例為聚丙二醇，特別是不同摩爾質量的聚乙二醇，例如可以商品名Lutrol E 4000和Lutrol E 6000從BASF AG獲得的PEG 4000活PEG 6000。
在優選的實施方案中，如本文引入作為參考文獻的WO 00/47060中第4頁第11到14行和第10頁28行到第11頁第9行中所述進行聚亞烷基二醇包衣。
上述多聚體b)的實例為聚環氧乙烷和聚環氧丙烷、環氧乙烷/環氧丙烷混合多聚體和由聚環氧乙烷和聚環氧丙烷嵌段組成的嵌段共聚物，如可以商品名Lutrol F68和Lutrol F127從BASF AG獲得的多聚體。對于a)和b)的多聚體，優選有利地使用上至以基于溶液總重量約50％(如從約30％到50％)的高濃度溶液。
上述多聚體c)的實例為聚乙烯吡咯烷酮，如BASF AG以商品名Kollidon或Luviskol所銷售的。對于這些多聚體，優選有利地使用固體含量基于溶液總重量從約30％到50％的高濃度溶液。
上述多聚體d)的實例為BASF AG以商品名Kollidon VA64銷售的乙烯替吡咯烷酮/乙酸乙酯共聚物。可以特別有利地使用基于溶液總重量從約30％到40％的這些共聚物的高濃度溶液。
上述多聚體e)的實例為如Hoechst以商品名Mowiol銷售的產品。可以有利地使用固體含量以重量計從約8％到20％范圍內的這些多聚體的溶液。
合適的多聚體f)的實例為羥丙基甲基纖維素，如Shin Etsu以商品名Pharmacoat銷售的。
上述多聚體g)的實例為烷基(甲基)丙烯酸多聚體和共聚物，其中烷基基團含有1到4個碳原子。合適的共聚物的具體實例為丙烯酸乙酯/丙烯酸甲酯共聚物，如以BASF AG以商品名Kollicoat EMM 30D所銷售的或Rohm以商品名Eutragit NE 30D所銷售的；還有異丁烯酸/丙烯酸乙酯共聚物，如BASF AG以商品名Kollicoat MAE 30DP或Rohm以商品名Eutragit 30/55銷售的。可以根據本發明加工這種類型的共聚物，如重量百分比從10到40的分散系。
上述多聚體h)的實例為用聚乙烯吡咯烷酮穩定的聚乙酸乙烯酯分散系，如BASF AG以Kollicoat SR 30D銷售的(分散系的固體含量以重量計從約20％到30％)。
根據本發明方法另一優選的實施方案，可以將顆粒裝入流化床中并進行粉末包衣。優選使用選自平均分子量從約6000到80000的羥丙基甲基纖維素(HPMC)粉末與增塑劑的混合物進行粉末包衣。適合粉末包衣的材料還有可以以粉狀形式存在并且不能以熔化物或高濃度溶液使用的所有其他包衣材料(如HPMC的情況)。
優選以向裝入流化床的顆粒中連續加入包衣材料的方式進行粉末包衣。包衣材料的細微粒(微粒大小在從約10到100μm范圍內)位于粗顆粒相對粗糙的表面上。通過噴入增塑劑溶液將包衣材料微粒粘在一起。合適的增塑劑的實例為聚乙二醇溶液、檸檬酸三乙酯、山梨醇溶液、石蠟油等。為了去除溶劑，優選在輕微加熱下進行包衣。在這種情況下產物溫度低于約60℃，例如從約40℃到50℃。原則上也可以在混合器中進行粉末包衣。在這種情況下，加入粉末混合物并將增塑劑也通過噴嘴注入。通過混合器的壁和適當時通過混合工具提供能量進行干燥。同在流化床中包衣和干燥一樣，這時也必須保持低的產物溫度。
根據本發明方法另一個優選的實施方案，將顆粒裝入流化床或混合器并用至少一種選自以下的多聚體的熔化物進行包衣a)聚亞烷基二醇，特別是平均分子量從約1000到15000的聚乙二醇；和b)平均分子量從約4000到20000的聚亞烷基氧化物多聚體或共聚物，特別是聚氧乙烯和聚氧丙烯的嵌段共聚物。
優選以將待包衣的顆粒裝入流化床裝置的方式在流化床中進行熔化物包衣。在外部容器中熔化包衣材料并(例如通過可加熱管)泵入噴霧嘴。加熱噴嘴氣體是有利的。必須以能使包衣材料容易分布到顆粒表面并使其均勻包衣的方式設定噴霧率和熔化物注入的溫度。可以在噴霧熔化物之前預熱顆粒。對于包衣材料具有高熔點的情況，必須注意不能將產物的溫度設定得太高，以使酶活性的損失減到最少。產物的溫度應該在約35℃到50℃的范圍內。原則上也可以通過底部噴霧方法或頂部噴霧方法進行熔化物包衣。可以用兩種不同方法在混合器中進行熔化物包衣。將待包衣的顆粒裝入合適的混合器并將包衣材料的熔化物噴入混合器中，或者也可以將固體形式的包衣材料與產物混合。通過由管壁或混合工具提供的能量將包衣材料熔化并覆蓋粗顆粒。必要時，可以間或加入一些脫模劑。合適的脫模劑為例如水楊酸、滑石粉、硬脂酸鹽和磷酸三鈣。
用于包衣的多聚體溶液、多聚體分散系或多聚體熔化物可以含有其他添加物，如微晶纖維素、滑石粉或高嶺土。
在本發明的另一實施方案中，可以如WO 03/059087中第2頁第19行到第4頁第15行中所述用聚烯烴包衣顆粒。
在本發明的另一實施方案中，可以如WO 03/059086中第2頁第18行到第4頁第8行中所述用含有分散于適當溶劑中的疏水物質微粒的分散系對顆粒進行包衣。在這種包衣的優選實施方案中使用聚烯烴，特別優選聚乙烯和/或聚丙烯。
顆粒優選具有相對狹窄的粒徑分布(如為單分散的)。這可以便于使動物飼料中顆粒內的酶勻質分布。本發明的方法旨在產生具有窄粒徑分布的顆粒。然而，必要時可以在方法中包括額外的步驟(如篩選)以進一步縮小粒徑分布。合適的顆粒的平均粒徑分布在100μm和2000μm之間，優選在200μm和1800μm之間，優選在300μm和1600μm之間。微粒可以是不規則的(但優選規則的)形狀，如近似為球形。在優選的實施方案中顆粒的平均粒徑分布在500和2000μm之間，優選在500和1800μm之間，優選在600和1000μm之間。可以使用Mastersizer S(MalvernInstruments GmbH的機器，序列號32734-08)測定平均粒徑分布。通過D(V，0.1)，D(v，0.5)和D(v，0.9)以及分布D(4，3)的平均粒徑值來表征平均粒徑分布。可以通過篩選(例如用Fa.Retsch的Typ Vibro VS 1000篩選機)測定平均粒徑分布。
因此本發明優選的方法包括a)混合(任選的)水、酶、穩定劑和含有至少15％(w/w)可食用碳水化合物多聚體的固體載體，如將固體載體與至少一種穩定劑和含酶的水成液混合；b)任選地捏合得到的混合物；c)(如通過機械加工)粒化混合物以得到含酶顆粒，如使用粒化機或通過擠壓；d)任選地滾圓顆粒；e)干燥得到的顆粒以得到含酶顆粒。
其中所述穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物，條件是如果在作為固體制劑的顆粒中使用明膠作為唯一的穩定劑，則其后需包被顆粒。
在優選的實施方案中進一步包被步驟e)中得到的含酶顆粒。
在優選的實施方案中，在整個過程中需要使酶所暴露的最高溫度保持低于80℃。
水或含酶液體可以含有除磷酸酶之外的一種或多種酶。酶(包括磷酸酶)通常為微生物來源，如從微生物發酵獲得。通常酶為活性形式(如具有催化或生理活性)。液體優選為能產生具有所需活性水平的顆粒的濃縮形式，如超濾液(UF)或滲余物。
在本發明的另一個方面中提供了含有至少一種磷酸酶和至少一種穩定劑的液體制劑，其中穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物。
可以使用食品、飼料和酶制劑方法中普遍使用的技術制備液體制劑。在一個實施方案中，可以向酶所溶解或分散的液體中直接加入穩定劑。在本發明的另一個實施方案中，首先將穩定劑溶于額外的水中，任選地可調整所得溶液的pH，然后將如此得到的溶液與酶或酶濃縮物或液體酶制劑混合。任選調整如此得到的混合物的pH。可以用有機或無機鹽和/或酸調整pH。
在優選的實施方案中，液體制劑含有至少一種磷酸酶或植酸酶。
穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gumkarya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物。應該理解，穩定劑可以選自一種試劑(如僅一種樹膠，如半乳甘露聚糖)或者由混合物如動物蛋白質(如白蛋白)和一種樹膠(如黃蓍膠)的混合物或兩種或三種或更多不同動物蛋白質或樹膠的混合物組成。
在優選的實施方案中，穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)或它們的混合物。
在優選的實施方案中，穩定劑選自黃蓍膠、半乳甘露聚糖、黃素和/或豆角膠。
在一個實施方案中穩定劑為瓊脂。瓊脂(或瓊脂-瓊脂)為來自紅藻(Rhodophyceae)的雜多糖。其注冊為CAS No.9002-18-0。瓊脂-瓊脂以E 406注冊為食品添加劑。
在一個實施方案中穩定劑為藻膠。術語“藻膠”包括海藻酸(CAS No.9005-32-7)和海藻酸鹽(海藻酸的鹽)。藻膠是來自褐藻(Phaeophyceae)的多糖。海藻酸以E 400注冊；海藻酸鈉注冊為CAS No.9005-38-5、E 401，海藻酸鉀為E 402，海藻酸銨為E 304，海藻酸鈣為E 404，glykolalginate為E 405。
在一個實施方案中穩定劑為角叉菜膠。角叉菜膠是來自紅藻(Rhodophyceae)的多糖。
在一個實施方案中穩定劑為紅藻膠(＝丹麥瓊脂)。紅藻膠是來自紅藻(Furcellaria fastigiata)的多糖(CAS No.9000-21-9)。
在一個實施方案中穩定劑為印度膠。印度膠是來自Anogeissus latifolia樹(使君子科，Combretaceae)樹皮滲出物的多糖。其注冊為CAS No.9000-28-6。
在一個實施方案中穩定劑為黃蓍膠。黃蓍膠是來自黃芪(Astragalus)科(Fabaceae科)(特別是來自Astragalus gummifer)的莖和灌木枝的滲出物的名稱。其注冊為CAS No.9000-65-1，以E 413注冊為食品添加劑。
在一個實施方案中穩定劑為gum karya(＝gum sterculia)。gum karya是Sterculia urens樹滲出物的名稱。
在一個實施方案中穩定劑為半乳甘露聚糖。半乳甘露聚糖是來自guar豆(Cyamopsis tetragonobolus)的多糖。
在一個實施方案中穩定劑為豆角膠(＝角豆膠、carubin)。豆角膠是提取自角豆樹(Ceratonia siliqua)種子的多糖。其以E 410注冊為食品添加劑。
在一個實施方案中穩定劑為羅晃子膠。羅晃子膠是提取自羅晃子樹(Tamarindus indica L.)果實的接地種子的多糖。
在一個實施方案中穩定劑為阿拉伯半乳聚糖。阿拉伯半乳聚糖是來自L-阿拉伯糖和D-半乳糖的多糖。其注冊為CAS No.9036-66-2。
在一個實施方案中穩定劑為黃素(膠)。黃素是野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)分泌的微生物陰離子多糖，CAS No.11138-66-2。其以E 415注冊為食品添加劑。
在一個實施方案中穩定劑為至少一種動物蛋白質。在優選的實施方案中穩定劑為至少一種選自家禽、牛、豬、魚的蛋白質的動物蛋白質或其混合物。
本發明的動物蛋白質可以得自任何動物(如從家禽、牛、豬或魚)。動物包括非反芻動物或單胃動物(豬、飛禽、家禽、水生動物，如魚)、反芻動物(牛或羊，如奶牛、綿羊、山羊、鹿、小牛、羔羊)。家禽包括小雞、母雞、火雞、鴨和鵝。
可以從動物的任何部分(如也可以從乳)分離動物蛋白質。由于動物蛋白質總是分離自動物，其可以含有以重量計多至20％的非蛋白質組分，優選多至15％，優選多至10％，特別是多至5％。本發明的動物蛋白質也可以是來自動物蛋白質的完全或部分水解產物。
在優選的實施方案中，動物蛋白質選自明膠、酪蛋白、白蛋白及其混合物。
適合作為穩定劑的動物蛋白質包括但不僅限于酪蛋白、白蛋白、乳蛋白質、明膠。
明膠(CAS No 9000-70-8，EINECS 232-554-6)可以例如從Stoess以100BL A的名稱得到。
酪蛋白(CAS No.900-71-9，EG-Nr.232-555-1)可以例如從Merck得到。
白蛋白是包括來自多種來源的血清蛋白質的術語。其包括乳白蛋白(來自乳)、卵白蛋白(來自卵)、血清白蛋白，特別是牛血清白蛋白。
通常以基于待加工的混合物(對于固體制劑)或基于終液體制劑總重量0.01％到50％的量，如1％到30％、如1％到20％，如3％到10％的量加入穩定劑。可以將穩定劑與載體或酶混合或直接將它們加入液體制劑中。
在其他實施方案中可以向酶制劑中摻入額外成分(如作為加工助劑)，以進一步提高造粒穩定性和/或儲存穩定性。下文討論了大量的這些優選的添加劑。
穩定化的固體或液體酶制劑中可以包含鹽，例如與固體載體或水一起。優選地(如EP-A-0,758,018中所建議的)，可以加入能提高加工和儲存穩定性的無機鹽。優選的無機鹽為水溶性的。它們可以包括二價陽離子如(特別是)鋅、鎂和鈣或一價陽離子，如鈉或鉀。盡管可以使用導致水溶性的其他陰離子(如碳酸根)，但是硫酸根是最常用的陰離子。鹽可以以固體形式(如向混合物中)加入。然而，也可以在與固體載體混合前先將鹽溶于水或含酶液體中。
對于液體制劑，可以直接向液體酶制劑中加入鹽。適合以0.1到40、優選0.5到30、特別是1到25，優選1到20的重量百分比的量提供鹽。
因此固體制劑(如顆粒)可以含有少于25％(w/w)的鹽，優選小于12％，例如2.5％到7.5％，例如4％到6％(重量百分比基于最終的固體制劑)。
另外還考慮可以向固體和/或液體酶制劑中加入已知的穩定劑，如尿素、甘油、聚乙二醇，優選為分子量6000Da的聚乙二醇或它們的混合物。可以加入固體或液體制劑的合適的穩定劑的另一實例為C5糖，優選木糖醇或核醣醇，或山梨醇、分子量600到4000Da(優選1000到3350Da)的聚乙二醇，丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二鈉鹽以及羧甲基纖維素。
可以通過摻入疏水、成膠或緩溶(如在水中)化合物進一步提高造粒穩定性。可以按基于水和固體制劑中固體載體成分重量的1％到10％、或基于液體制劑重量的1％到20％提供這些化合物。合適的物質包括衍生的纖維素如HPMC(羥丙基甲基纖維素)、CMC(羧甲基纖維素)、HEC(羥乙基纖維素)、微晶纖維素、聚乙烯醇(PVA)；和/或食用油。可以(例如向待粒化的混合物中)加入食用油(如大豆油或蕓苔油)作為加工助劑。
本文所使用的術語“酶”包括單個酶以及不同酶(如植酸酶和酸性磷酸酶)的混合物和不同來源的同一種酶(如真菌植酸酶和細菌植酸酶)的混合物。
本發明的酶制劑含有至少一種磷酸酶。磷酸酶包括植酸酶(3-植酸酶和6-植酸酶)和/或酸性磷酸酶。
在優選是實施方案中磷酸酶為至少一種植酸酶。
術語“植酸酶”不僅指天然存在的植酸酶，還指任何具有植酸酶活性(如能催化涉及從磷酸肌醇中移去或釋放無機磷(磷酸)的反應)的酶。優選植酸酶屬于EC 3.1.3.8類別。植酸酶可以是3-植酸酶和/或6-植酸酶。
一個植酸酶活性單位(＝FTU)定義為在pH 5.5和37℃下每分鐘從0.0051mol/l植酸鈉中釋放1微摩爾無機磷的酶量。
該分析方法基于從過量加入的植酸鈉中釋放無機磷。孵育時間為pH5.5下60分鐘。通過黃色鉬-釩復合物測定釋放的磷并在波長415nm處評估光度值。平行操作已知活性的植酸酶標準品用于比較。用與標準品的比率表示測出的產物樣品中吸收的提高(相對方法，AOAC官方方法)。
可以根據“Determination of Phytase Activity in Feed by aColorimetric Enzymatic Method″Collaborative Interlaboratory Study”Engelen等Journal of AOAC International第84卷，No.3，2001測定植酸酶的活性。
本發明的植酸酶可以是微生物來源和/或得自對天然存在的植酸酶的遺傳修飾和/或從新構建(遺傳工程)。
在優選的實施方案中植酸酶為植物植酸酶、真菌植酸酶、細菌植酸酶或可由酵母產生的植酸酶。
植酸酶優選來自微生物來源，如細菌、真菌和酵母，但也可以是植物來源。在優選的實施方案中，植酸酶來自真菌菌株，特別是曲霉(Aspergillus)菌株，如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、無花果曲霉(Aspergillus ficuum)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、構巢曲霉(Aspergillus nidulans)和土曲霉(Aspergillus terreus)。多數優選的植酸酶來自黑曲霉菌株或米曲霉菌株。
在另一優選的實施方案中，植酸酶來自細菌菌株特別是芽孢桿菌(Bacillus)菌株或假單胞菌(Pseudomonas)菌株。優選地，植酸酶來自枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)菌株。
在另一優選的實施方案中，植酸酶來自細菌菌株特別是大腸桿菌菌株。
在另一優選的實施方案中，植酸酶來自酵母，特別是克魯弗氏酵母屬(Kluveromyces)菌株或酵母屬(Saccharomyces)菌株。優選地，植酸酶來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。
在本發明上下文中，“來自于…的酶”包括特定菌株天然產生的酶，所述酶回收自該菌株或由從該菌株中分離的DNA序列編碼并在用所述DNA序列轉化的宿主生物中產生。
可以使用任何合適的技術從目的微生物中獲得植酸酶。具體而言，可以通過在合適的營養培養基中發酵產生植酸酶的微生物并通過本領域已知的方法分離酶來獲得植酸酶。
培養所使用的發酵液或培養基可以是適合目的宿主細胞生長的任何常規培養基，并可根據現有技術的原則配制。培養基優選含有碳源和氮源和其他無機鹽。合適的培養基(如基本培養基或復合培養基)可從生產商獲得，或者可以根據發表的配方制備(如美國典型培養物保藏中心(ATCC)菌株目錄)。
在培養后，通過從培養液中分離和純化蛋白質的常規方法回收植酸酶。熟知的純化操作包括通過離心或過濾將細胞與培養基分開，通過鹽(如硫酸銨)沉淀培養基中的蛋白質組分，以及層析方法，如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
另外，優選使用重組DNA技術(如本文引入作為參考的出版物EP-A1-0 420 358所述)大量產生植酸酶。
優選地，如EP-A1-0 420 358所述，在有助于表達編碼植酸酶的基因的條件下培養用得自無花果曲霉或黑曲霉物種的植酸酶編碼基因轉化的曲霉種真菌。
優選在用于本發明的制劑以前通過過濾和超濾處理含有植酸酶的發酵液。
在本發明的另一實施方案中使用來自分子工程的植酸酶，如WO94/03072(Rohm)、WO 99/49022(Novozymes)、WO 00/43503(Novozymes)或WO 03/102174(BASF AG)中所述的遺傳修飾的植酸酶。
本發明優選使用的另一種植酸酶是所謂的共有植酸酶。它是根據理論分子生物學方法研發的植酸酶，其與曲霉植酸酶相比具有更高的內在穩定性，參閱歐洲專利申請出版物No.897 985。在本發明的實踐中還可使用實施例3-13中具體描述的共有植酸酶。
還可以通過遺傳工程產生這些植酸酶，其中將得自真菌的基因轉移到宿主生物如細菌(如大腸桿菌)、酵母或另一種真菌中，其他細節參閱如歐洲專利申請出版物No.68431 3和歐洲專利申請出版物No.897 010。
在本發明優選的實施方案中可以使用EP-B1 420 358的植酸酶。
在本發明優選的實施方案中，本發明的酶制劑還含有其他酶。
本發明的制劑優選的其他酶包括用于食品(包括焙烤)和飼料工業的酶。
這些酶包括但不僅限于蛋白酶(細菌、真菌、酸性、中性或堿性)，優選具有中性和/或酸性最適pH。
蛋白酶(蛋白水解酶)可以是微生物酶，優選蛋白酶來自細菌或真菌菌株或者蛋白酶可以是胰蛋白酶或胃蛋白酶。在優選的實施方案中，蛋白水解酶為來自芽孢桿菌菌株(優選枯草芽孢桿菌菌株或地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)菌株)的細菌蛋白酶。市售的芽孢桿菌蛋白酶為AlcaseTM和NeutraseTM(Novozymes，丹麥)。在另一優選的實施方案中，蛋白水解酶為來自曲霉菌株(優選刺孢曲霉(Aspergillus aculeatus)菌株、黑曲霉菌株、米曲霉菌株)的真菌蛋白酶。市售的曲霉蛋白酶為FlavourzymeTM(Novozymes，丹麥)。
這些酶包括但不僅限于脂肪酶(真菌、細菌、哺乳動物)，優選如哺乳動物胰磷脂酶A2的磷脂酶或任何三酰甘油酯酶(E.C.3.1.1.3)。
這些酶包括但不僅限于葡萄糖氧化酶。
這些酶包括但不僅限于糖苷酶(E.C.3.2，也稱為糖酶)，如淀粉酶(α或β)、纖維素酶(完整纖維素酶或其功能性組分)，特別是木聚糖酶、葡聚糖酶，優選β-葡聚糖酶、半乳糖苷酶、果膠酶和半乳糖苷酶，如α-或β-半乳糖苷酶。
糖苷酶可以是任何糖苷酶(EC 3.2.1，也稱為糖酶)。優選地，糖苷酶為淀粉酶(特別是α-淀粉酶或β-淀粉酶)、纖維素酶、葡聚糖酶(特別是內切-1，4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)或內切-1，3-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.6))、木聚糖酶(特別是內切-1，4-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8)或木聚糖-內切-1，3-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.32))、α-半乳糖苷酶(E.C.3.2.1.22)、多聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15，也稱為果膠酶)、纖維素-1，4-β-纖維二糖酶(E.C.3.2.1.91，也稱為纖維二糖水解酶)、內切葡聚糖酶(特別是內切-1，6-δ-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.75)、內切-1，2-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.71)、內切-1，3-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.39)或內切-1，3-α-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.59))。它們還包括甘露聚糖酶，如β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.25)和甘露聚糖-內切-1，4-β-甘露聚糖酶(E.C.3.2.1.78)。
本發明優選的內切-1，4-β-葡聚糖酶(E.C.3.2.1.4)為本文引入作為參考文獻的WO 01/70998(BASF AG)中描述的內切-1，4-β-葡聚糖酶。
在優選的實施方案中，其他酶選自糖苷酶、磷脂酶和葡萄糖氧化酶。
在優選的實施方案中其他酶選自糖苷酶。
在優選的實施方案中其他酶選自木聚糖酶、葡聚糖酶及其混合物。
在本發明優選的實施方案中，其他酶為至少一種木聚糖酶。木聚糖酶可以得自微生物來源，如黑曲霉、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)以及芽孢桿菌和鏈霉菌物種。還可以通過重組表達獲得木聚糖酶，例如EP 121138中所述。在優選的實施方案中，可以根據本發明使用如EP 0 463 706 B1(BASF AG)和/或WO 02/24926 A1(BASF AG)中所述的木聚糖酶。
本發明合適的木聚糖酶可以是內切木聚糖酶和/或外切木聚糖酶，優選內切木聚糖酶，特別是內切-β-木聚糖酶。
合適的其他酶是動物食品(包括寵物食品)和/或人營養物中所包含的酶。這些酶的功能常是(例如通過降低粘性或某些飼料化合物的抗營養效應)提高飼料的轉換率。還可以使用飼料酶，如為了降低糞肥中對環境有害的化合物的量。
將本發明的酶制劑用于食品應用時，酶必須為食品品質。
本發明的范圍內包括使用至少一種、優選兩種、優選三種或更多不同的酶。這些可以是同一類別的酶(如兩種不同的植酸酶)或者不同類別的酶(如植酸酶和木聚糖酶)。應該理解，無論何時，當涉及到酶時，這些術語中也包括酶混合物(無論這些混合物是否從單一發酵中直接得到或是通過混合來自不同發酵的酶而得到)，另外還包括通過發酵重組微生物得到的酶。
如果磷酸酶為植酸酶，優選該固體或液體酶制劑具有1000到80000，如2000到70000，如3000到60000，優選4000到50000，如5000到25000，如從5000到15000，如5000到10000，如6000到8000FTU/g的活性。
如果其他酶為植物細胞壁降解酶(如木聚糖酶)，則最終固體或液體制劑可以具有3000到500000，優選4000到250000，優選5000到100000，優選6000到80000，最優為8000到70000EXU/g范圍內的該酶活性。
如果其他酶為纖維素酶如葡聚糖酶(優選β-葡聚糖酶)，則固體或液體酶制劑可以具有100到150000，如500到100000，優選750到50000，優選從1000到10000，最優1500到7000BGU/g的該酶活性。
一個內切木聚糖酶活性(EXU)定義為在測試條件下(pH 3.5和55℃)每分鐘釋放1.00微摩爾以木聚糖等價物衡量的還原糖的酶量。
一個β-葡聚糖酶單位(BGU)定義為在測試條件下(pH 3.5和40℃)每分鐘釋放0.258微摩爾表達為葡聚糖等價物的還原糖的酶量。
可以根據Engelen等Journal 0f AOAC International第79卷，No.5，1019(1996)測定內切木聚糖酶活性(EXU)和β-葡聚糖酶活性(BGU)。
固體制劑(如顆粒)可以含有重量百分比從1到20，如從5到20，如從7到15的酶(磷酸酶加其他酶)。
液體制劑可以含有重量百分比從0.5到20，如5到15的酶(磷酸酶加其他酶)。
本發明的另一方面涉及制備動物飼料或動物飼料的預混合料或前體的方法，所述方法包括將權利要求1到10和/或權利要求26中任一項所定義的固體和/或液體酶制劑與一種或多種動物飼料物質(如種子)或成分混合。可隨后將其滅菌(如進行熱處理)。然后可以將得到的組合物適當地加工成型并任選地干燥。
補充了酶的飼料可以進行若干方法飼料加工方法，如擠壓、膨脹和造粒，其中可能出現暫時性的高溫，熱穩定是有利的。
本發明的穩定的酶制劑可以應用于如飼料固體。可以用自來水稀釋熱穩定的液體酶制劑以得到具有所需酶活性的溶液。如果磷酸酶為植酸酶，優選稀釋溶液以得到100到1000，優選200到700FTU/g，特別是300到500FTU/g活性的溶液。可以將飼料固體轉移到機械混合器中并在攪動時將稀釋的酶制劑噴到飼料固體上，以得到具有添加的酶活性的同質產物。含有植酸酶的飼料固體的實例優選為獲得約500FTU/g活性的飼料固體。
另外可以將固體或液體酶制劑直接與飼料糊混合，然后將混合物進行加工，如造粒、膨脹或擠壓。
本發明的另一方面涉及制備適于人營養物的組合物或預混合料或前體的方法，所述方法包括將權利要求1到10和/或權利要求26中任一項所定義的固體和/或液體酶制劑與一種或多種食品物質或成分混合。可隨后將其滅菌(如進行熱處理)。然后可以將得到的組合物適當地加工成型并任選地干燥。
優選以低于1g∶1kg，優選低于0.5g∶1kg，特別是低于0.1g∶1kg，優選低于0.05g∶1kg的比例將固體制劑(如顆粒)與飼料或食品物質或成分混合。
本發明的另一方面涉及權利要求1到10和/或權利要求26中任一項所定義的固體和/或液體酶制劑用于人體和/或動物營養的用途。因此本發明包括組合物，如動物飼料組合物或適于人營養物的組合物。這些組合物優選為片劑(pellet)的形式(每片可以含有1-5、如2-4個干燥顆粒)。這些組合物可以具有8％到20％、如12％到15％的含水量。酶量可以從重量百分比0.0001到0.005，適當的為重量百分比從0.0005到0.0012，如至少5ppm。
本發明的另一方面涉及提供滿足單胃動物食物磷需求的方法，其中用根據本發明的飼料喂養動物并在飼料中不加入額外的磷酸鹽。
另一方面涉及促進動物生長和/或改善飼料轉換率的方法，所述方法包括用含有權利要求1到10和/或權利要求26中任一項所定義的固體和/或液體酶制劑的食物喂養動物。
合適的組合物含有從0.05到2.0，如0.3到1.0，最優為0.4到0.6FTU/g的磷酸酶(如植酸酶)。可以存在0.5到50EXU/g，例如1到40EXU/g，優選2到25，特別是2到15EXU/g的木聚糖酶。另外，可以存在0.05到1.5，如0.1到1.0，如0.2到0.6BGU/g的纖維素酶。
本發明的另一方面涉及權利要求1到10和/或權利要求26中任一項所定義的固體和/或液體酶制劑在動物飼料或動物食物中的用途或作為動物飼料或動物食物的成分的用途。
在被動物和/或人食用時，權利要求1到10和/或權利要求26中任一項所定義的固體和/或液體酶制劑降低了環境污染。此外，在被動物食用時，它們還會提高動物產品(如肉、蛋)的質量，所述動物產品得自用權利要求1到10和/或權利要求26中任一項所定義的固體和/或液體酶制劑喂養的動物。
合適的動物包括農業動物(豬、家禽、家畜)、非反芻或單胃動物(豬、飛禽、家禽、水生動物，如魚)、反芻動物(牛或羊，如奶牛、綿羊、山羊、鹿、小牛、羔羊)。家禽包括小雞、母雞、火雞、鵝和鴨。
本發明的另一方面涉及在含磷酸酶的組合物中使用至少一種穩定劑以提高酶的粒化穩定性，所述穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物。
本發明的另一方面涉及用至少一種穩定劑作為添加劑用于生產固體和/或液體酶制劑(優選固體酶制劑)的用途，所述穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物。在本發明的該實施方案中，優選以固體化合物將穩定劑加入標準粒化混合物中。這些制劑可以在高剪力粒化加工后得到提高的(如所測定的磷酸酶活性的)回收率(多至20％)，所述高剪力粒化加工包括在流化床干燥器上45℃15分鐘的顆粒干燥步驟。另外，在與飼料和/或食品混合時，這些含有本發明穩定劑的顆粒在飼料和/或食品處理(如85℃的造粒過程)后可以表現出與不含這些添加劑的顆粒相比提高的回收率。
本發明一個方面的優選特征和特性可經必要的變更后同等效應用于另一方面。
實施例除非另有說明，所有的百分比均為w/w。
實施例V1(比較)通過捏合、擠壓、滾圓和干燥制備基于玉米淀粉的酶顆粒。
第一步將玉米淀粉裝入實驗室混合器(Loedige Typ M5 RMK)中并緩慢攪動。將含有植酸酶的超濾液、ZnSO4×6H2O、PVA(聚乙烯醇)和額外的水的混合物倒入燒杯中并溶解/分散。將該混合物倒到Loedige混合器中的玉米淀粉上。
在Loedige混合器中以100-250rpm混合并捏合66％(w/w)的玉米淀粉、20％(w/w)的含有植酸酶的超濾液、1％(w/w)的PVA、0.3％(w/w)的ZnSO4×6H2O和12.7％(w/w)的額外的水，從而得到含酶的生面團。
第二步用Fuji Paudal實驗室擠壓機(型號DG-L1)擠壓含酶的生面團，以得到濕的擠出物，然后在實驗室滾圓器中滾圓，以得到平均直徑500-800μm的圓形微粒。
然后在流化床(Niro-Aeromatic，型號MP-1)中在約40℃的床溫下將這些微粒干燥60-90分鐘。干燥并接著冷卻約1.5kg的濕顆粒。得到的干燥酶顆粒具有8920FTU/g的活性。

實施例1酪蛋白作為穩定劑第一步 將玉米淀粉和酪蛋白(得自Merck，Darmstadt，CAS No.900-71-9)裝入實驗室混合器(Loedige Typ M5 RMK)中并緩慢攪動。將含有植酸酶的超濾液、ZnSO4×6H2O和額外的水的混合物倒入燒杯中并溶解/分散。將該混合物倒到Loedige混合器中的玉米淀粉和酪蛋白上。從而通過在Loedige混合器中以100-250rpm混合并捏合所述成分得到含有植酸酶的生面團。
如實施例V1所述通過擠壓生面團、滾圓、干燥和冷卻得到含酶的顆粒。得到的干燥酶顆粒具有7690FTU/g的活性。


實施例2酪蛋白作為穩定劑根據實施例1獲得含酶(植酸酶)的顆粒。得到的干燥酶顆粒具有7580FTU/g的活性。

造粒穩定性比較對本發明的植酸酶顆粒進行造粒試驗，并將其造粒穩定性與根據標準配方(＝實施例V1)產生的顆粒進行比較。造粒試驗由將不同的酶顆粒與標準肉雞食品以1g/kg飼料的水平混合而組成。通過在調溫器中注射蒸汽處理含酶飼料并緊接著在壓片器中造粒以獲得飼料片劑，隨后冷卻。在壓片器之后直接測得的粒溫度為78℃。這種類型的加工一般在飼料業中使用以得到飼料片劑。實施例1以及實施例2與實施例V1相比表現出至少10％的造粒穩定性提高。
權利要求
1.含有至少一種磷酸酶和至少一種穩定劑的穩定化的固體或液體酶制劑，所述穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物，條件是如果在作為固體制劑的顆粒中使用明膠作為唯一的穩定劑，則其后需包被顆粒。
2.根據權利要求1的酶制劑，其中磷酸酶為植酸酶。
3.根據任一前述權利要求的酶制劑，其中植酸酶為植物植酸酶、真菌植酸酶、細菌植酸酶、可由酵母產生的植酸酶或共有植酸酶。
4.根據任一前述權利要求的酶制劑，其中動物蛋白質選自來自家禽、牛、豬、魚的蛋白質及其混合物。
5.根據任一前述權利要求的酶制劑，其中動物蛋白質選自明膠、酪蛋白、白蛋白及其混合物。
6.根據權利要求1至5中任一項的酶制劑，其特征在于制劑為液體。
7.根據權利要求1至5中任一項的酶制劑，其特征在于制劑為固體。
8.根據權利要求7的酶制劑，其特征在于固體制劑為顆粒形式。
9.根據權利要求8的酶制劑，其中顆粒包含至少一種磷酸酶、含有至少w/w 15％可食用碳水化合物多聚體的固體載體和至少一種穩定劑，其中穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gumkarya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物，條件是如果在作為固體制劑的顆粒中使用明膠作為唯一的穩定劑，則其后需包被顆粒。
10.根據權利要求9的酶制劑，其中包被了顆粒。
11.制備含有磷酸酶的顆粒的方法，所述方法包括加工(i)至少一種磷酸酶，(ii)含有至少w/w 15％可食用碳水化合物多聚體的固體載體，和(iii)至少一種穩定劑，其中穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物，條件是如果在作為固體制劑的顆粒中使用明膠作為唯一的穩定劑，則其后需包被顆粒。
12.根據權利要求11的方法，其中在加工中加入了水。
13.根據權利要求11或12中任一項的方法，其中以含酶水成液提供水和磷酸酶。
14.根據權利要求13的方法，其中液體是來自產生磷酸酶的發酵方法的濾液。
15.根據權利要求11到14中任一項的方法，其中在加工后干燥顆粒。
16.根據權利要求11到15中任一項的方法，其中動物蛋白質選自來自家禽、牛、豬、魚的蛋白質及其混合物。
17.根據權利要求11到16中任一項的方法，其中動物蛋白質選自膠原、酪蛋白、白蛋白及其混合物。
18.根據權利要求11到17中任一項的方法，其中所述方法包括a)將含有酶的水成液與固體載體和穩定劑混合；b)機械加工a)中得到的混合物，以獲得含酶顆粒；并c)干燥b)中獲得的含酶顆粒。
19.根據權利要求11到18中任一項的方法，其中加工為機械加工，包括擠壓、造粒、高剪力粒化、膨脹、流化床團聚、滾圓、滾筒粒化或其組合。
20.根據權利要求11到19中任一項的方法，其中混合了含酶水成液、固體載體和穩定劑，并在粒化前捏合得到的混合物。
21.根據權利要求11到20中任一項的方法，其中加工為低壓下和/或在籠狀或圓頂擠出機中進行的擠壓。
22.根據權利要求11到21中任一項的方法，其中滾圓了顆粒。
23.根據權利要求11到22中任一項的方法，其中包被了顆粒。
24.根據權利要求11到23中任一項的方法，其中磷酸酶為植酸酶，優選為植物植酸酶、真菌植酸酶、細菌植酸酶、可由酵母產生的植酸酶或共有植酸酶。
25.根據權利要求11到24中任一項的方法，其中顆粒具有1000到80000FTU/g，優選2000到70000FTU/g，優選3000到60000FTU/g，更優選4000到50000FTU/g并更優選5000到15000FTU/g范圍內的植酸酶活性。
26.通過權利要求11到25中任一項所限定的方法得到的含酶顆粒。
27.制備動物飼料或動物飼料的預混合物或前體的方法，所述方法包括將根據權利要求1到10和/或權利要求26中任一項的穩定化的固體和/或液體制劑與一種或多種動物飼料物質或成分混合。
28.制備適于人營養物的組合物或預混合物或前體的方法，所述方法包括將根據權利要求1到10和/或權利要求26中任一項的穩定化的固體和/或液體制劑與一種或多種食品物質或成分混合。
29.根據權利要求27或28中任一項的方法，其中對飼料或食品物質與穩定化的固體和/或液體制劑的混合物進行滅菌或用蒸汽處理、造粒并任選地干燥，所述穩定化的固體和/或液體制劑為根據權利要求1到10和/或權利要求26中任一項的固體和/或液體制劑。
30.根據權利要求1到10和/或權利要求26中任一項的穩定化固體和/或液體制劑用于人和/或動物營養物的用途。
31.促進動物生長和/或提高飼料轉換率的方法，所述方法包括用含有根據權利要求1到10和/或權利要求26中任一項的穩定化固體和/或液體制劑的食物喂養動物。
全文摘要
本發明涉及含有至少一種磷酸酶和至少一種穩定劑的穩定化固體或液體酶制劑，所述穩定劑選自瓊脂、藻膠、角叉菜膠、紅藻膠、印度膠、黃蓍膠、gum karya、半乳甘露聚糖、豆角膠(＝角豆膠)、羅晃子膠、阿拉伯半乳聚糖、黃素(膠)、至少一種動物蛋白質及它們的混合物，條件是如果在作為固體制劑的顆粒中使用明膠作為唯一的穩定劑，則其后需包被顆粒。本發明還涉及生產這些制劑(特別是固體制劑如顆粒)的方法以及它們在動物和/或人營養物中的用途。
文檔編號C12N9/14GK1909796SQ200580002895
公開日2007年2月7日 申請日期2005年1月28日 優先權日2004年1月30日
發明者A·哈比希, J·布勞恩 申請人:巴斯福股份公司