專利名稱：：作為細胞核轉移胞質體受體的未激活卵母細胞的制作方法
技術領域：
：本發明涉及包括(但不限于)遺傳選擇和/或遺傳修飾動物在內的動物的產生，涉及可用于產生這些動物的細胞。
背景技術：
：通過將供體細胞核轉移至一個去核卵母細胞或一個細胞合子中重組哺乳動物胚，使生產遺傳相同的個體。這顯然既有利于研究(即作為生物學控制)，也有利于商業應用(即有遺傳價值的家畜的繁殖、肉產品的均一性、動物管理)。首先計劃通過細胞核轉移重組胚(Spemann，EmbryonicDevelopmentandInduction210-211HofnerPublishingCo.，NewYork(1938))，目的是為了回答核等值或‘核在發育期間改變嗎？’的問題。設計這些實驗通過轉移來自不斷發育的胚胎期的核以確定核在什么時候其發育潛能變為受限制。由于技術上的限制以及Spemann的不幸去世，直至1952年才完成這些研究，這時證明在青蛙中，某些核可以指導青蛙發育為性成熟的成體(Briggs和King，Proc.NatlAcad.Sci.USA38455-461(1952))。他們的發現產生目前的概念當來自單一個體的同等全能核轉移至去核卵時，產生“遺傳上相同”的個體。其真正含義是，由于每個個體中未知的胞質對核轉移的影響不同，這些個體不是克隆，并且也必須證明不存在任何染色體重排。自從證明兩棲類動物中的胚克隆，相似的技術已被用于哺乳動物物種中。這些技術分為兩類1)將供體核轉移至已經除去染色體DNA的成熟的中期II卵母細胞中，以及2)將供體核轉移至一個已除去兩個原核的受精細胞合子中。在有蹄類動物中，采用前一方法，因為已經報道不在交換原核時采用后一方法細胞合子不發育。一般通過誘導細胞融合，將供體核轉移到卵母細胞的胞質中。在有蹄類動物中，通過在該對細胞(couplet)的接觸/融合平面上施加直流電脈沖誘導融合。誘導細胞融合的同樣脈沖也激活受體卵母細胞。胚重組后的進一步發育取決于多種因素，包括該核指導發育的能力-即全能性、受體胞質體的發育感受態(即卵母細胞的成熟)、卵母細胞激活、胚培養(Campbell和Wilmut在VthWorldCongressonGeneticsasAppliedtoLivestock20180-187(1994)中的綜述)。除上述因素外，我們已經表明在重組胚的第一細胞周期維持正確的倍性是至關重要的(Campbell等，Biol.Reprod.49933-942(1993)；Campbell等，Biol.Reprod.501385-1393(1994))。在單個細胞周期中，在有絲分裂前所有基因組DNA必須復制一次并且只復制一次。如果任何DNA或者不能復制，或者復制多于一次，那么在有絲分裂時該核的倍性將不正確。在每個細胞周期中復制限于一個循環的機制尚不清楚，然而，幾種證據的跡象表明，完整的核膜對于這一控制是決定性的。已經在包括小鼠(Czolowiska等，J.CellSci.6919-34(1984))、兔(Collas和Robl，Biol.Reprod.45455-465(1991))、豬(Prather等，J.Exp.Zool.225355-358(1990))、母牛(Kanka等，Mol.Reprod.Dev.29110-116(1991))在內的多個物種中研究了在供體核轉移到去核中期II卵母細胞后發生在供體核中的形態學現象。恰好在融合時，供體核膜破裂(NEBD)，染色體早熟濃縮(PCC)。這些作用是由稱為成熟/有絲分裂/減數分裂啟動因子(MPF)的胞質活性催化。在所有有絲分裂和減數分裂的細胞中都發現了該活性，在中期達到最大活性。成熟的哺乳動物卵母細胞停頓在第二成熟分裂的中期(中期II)并具有高MPF活性。受精時或激活時，MPF活性下降，完成第二成熟分裂并擠出第二極體，然后染色質去濃縮，發生原核形成。在核轉移重組胚中，當MPF水平高時，發生NEBD和PCC；當MPF活性下降時，在這些現象發生后，染色質去濃縮，再形成核，隨后進行DNA復制。在重組胚中，可以用兩種方法中的一種維持正確的倍性；第一種方法是在激活時，將限定的細胞周期階段的核(例如G1期細胞的二倍體核)轉移到中期II卵母細胞中；或第二種方法是激活受體卵母細胞，在MPF活性消失后轉移供體核。在羊中，采用16個細胞胚的分裂球作為核供體時，這后一方法已經將發育至胚囊期的頻率由重組胚的21％提高至55％(Campbell等，Biol.Reprod.501385-1393(1994))。這些重組胚發育頻率的提高尚未回答核重編程序的問題。在發育期間，某些基因變為“刻上記號”，即發生改變，使得他們不再轉錄。對印痕的研究已經表明，在生殖細胞形成期間除去該“印痕”(即重編程序)。一個可能性是，這種重編程序受染色質暴露于經歷減數分裂細胞中存在的胞質因子的影響。這產生一個問題在通過核轉移重組胚期間，我們如何模擬這一情形以便重編供體核發育鐘的程序。現已發現，如果維持正常倍性(即二倍性)并且該胚在核轉移時不激活，那么將核轉移到停頓在中期II的卵母細胞中可以產生能活胚。激活的延遲使得該核一直暴露于受體胞質中。
發明內容按照本發明的第一個方面，提供一個重組動物胚的方法，該方法包括將二倍體核轉移到停頓在第二成熟分裂中期的卵母細胞中，同時不激活卵母細胞，保持該核暴露于受體胞質中，暴露時間足以使重組胚變得能夠產生活體分娩，隨后激活重組胚，同時維持正確的倍性。在該階段，重組胚為單細胞。原則上，本發明可應用于所有動物，包括諸如家禽之類的鳥、兩棲類物種和魚物種。然而實際上，對于非人類動物，尤其是非人類哺乳動物，特別是有胎盤哺乳動物而言，它是目前想象的最具有商業用途的應用。對于有蹄類動物，特別是經濟上重要的有蹄類動物，諸如牛、羊、山羊、水牛、駱駝和豬等，本發明作為克隆動物的方法和作為產生轉基因動物的方法，都可能是最有用的。大家也應該注意到，本發明也可以應用于其它經濟上重要的動物物種，諸如馬、駝羊或嚙齒動物，例如大鼠和小鼠或兔。本發明同樣可應用于轉基因以及非轉基因動物的生產中。可以由遺傳改變的供體細胞生產轉基因動物。與常規生產轉基因(即遺傳修飾的)動物的方法相比，整個方法有幾個優點，可以總結如下(1)需要較少的受體；(2)可以采用克隆的供體細胞產生多個同系基因建立者；(3)允許通過基因靶進行精細的遺傳改變；(4)由于每個動物都得自單個核，因此由通過本發明制備的胚生產的所有動物都應該通過種系傳遞相關的遺傳修飾；相反，在通過胚囊注射包含修飾的干細胞種群后，通過原核注射或嵌合現象生產轉基因動物，產生一部分嵌合動物，在后者中，不是所有的細胞都含有該修飾，可能不通過種系傳遞該修飾；(5)在產生整個動物之前，可以選擇具有遺傳修飾(例如整合)位點的細胞。大家應該注意，與動物有關的術語“轉基因”不應該有限地用來指種系中含有一個或多個另一物種基因的動物，盡管許多轉基因動物含有這樣的一個或多個基因。相反地，更廣義地講，該術語是指其種系為重組DNA技術進行技術介入的對象的任何動物。因此，本發明目的的轉基因動物既是例如種系中缺失、復制、激活或修飾一個內源基因的動物，也是種系中加入外源DNA序列的動物。在該動物為轉基因的本發明實施方案中，對供體核進行遺傳修飾。供體核可以含有一個或多個轉基因，可以在核轉移和胚重組之前進行遺傳修飾。盡管與注射到合子的雄性原核或雌性原核類似的微注射可以用作遺傳修飾的方法，但本發明不限于該方法也可以使用物質轉化或轉染技術，例如電穿孔、病毒轉染或脂染(1ipofection)。在上述本發明方法中，二倍體核由供體轉移至去核受體卵母細胞中。供體在轉移時必需為二倍體，以便維持重組胚的正確倍性；因此，供體可以或者處于G1期，或者最好為我們今天申請的共同未決的PCT專利申請PCT/GB96/02099(由GB9517780.4要求優先權)的對象-處于細胞周期的G0期。有絲分裂細胞周期有四個不同的時期，為G、S、G2和M期。在細胞周期中稱為起始(start)的開始現象發生在G1期，具有獨特的功能。在起始時作出進行另一細胞周期的決定或保證。一旦細胞通過起始，則細胞通過余下的G1期，這是前DNA合成期。DNA合成時，為第二階段S期。隨后為G2期，為DNA合成與有絲分裂之間的時期。有絲分裂本身發生在M期。一般認為靜止細胞(包括已經誘導靜止的細胞以及天然靜止的細胞，諸如某些完全分化的細胞)不處于該周期四個時期中的任一期內；通常描述它們處于G0狀態，以便表示它們不能正常地通過該周期進行。同G1細胞的核一樣，靜止G0細胞的核具有二倍體DNA含量；這兩種二倍體核都可以用于本發明中。根據上述描述，我們相信對于可以用于核供體的細胞沒有明顯的限制如細胞可以體外培養或體外(exvivo)提煉一樣，可以使用完分化或部分分化的細胞或未分化細胞。唯一的限制是，供體細胞具有正常的DNA含量并且核型正常。在我們共同未決的專利申請PCT專利申請PCT/GB95/02095(以WO96/07732公開)中公開了推薦的細胞源。我們相信所有這類正常細胞都含有產生成年動物所需的所有遺傳信息。本發明通過改變染色質結構，允許為發育中的胚提供該信息，使得遺傳物質可以重新指導發育。可用于本發明的受體細胞為停頓在第二成熟分裂中期的去核卵母細胞。在大多數脊椎動物中，卵母細胞的成熟在體內進行至這一卵成熟過程的相當晚的時期，然后停頓。排卵時，停頓的卵母細胞從卵巢中排出(如果發生受精，那么自然刺激卵母細胞完成減數分裂)。在本發明的實施中，卵細胞可以或者體外成熟，或者體內成熟，分別在出現第一極體時，或在排卵后盡可能快地收集卵母細胞。受體最好去核。盡管一般假定在核轉移方法中受體卵母細胞的去核是必需的，但該判斷沒有公開的實驗證實。最初描述用于有蹄類動物的方法涉及將該細胞分裂為兩半，其中一半可以去核(WilladsenNature320(6)63-65(1986))。該方法的缺點是，未知的另一半仍具有中期器，并且胞質體積減小將促進新胚的分化模式(Eviskov等，Development109322-328(1990))。新近，已經使用不同的方法試圖除去染色質，同時除去最小量的胞質。我們發現吸出第一極體和相鄰的胞質除去67％羊卵母細胞中的中期II器(Smith&WilmutBiol.Reprod.401027-1035(1989))。只有使用DNA特異性熒光染料(Hoechst33342)提供的一個方法，用該方法去核可以保證最小限度地減少胞質體積(Tsunoda等，J.Rprod.Fertil.82173(1988))。在家畜物種中，這可能是一個目前常規使用的方法(Prather&FirstJ.Rprod.Fertil.Suppl.41125(1990))；Westhusin等，Biol.Reprod.(Suppl.)42176(1990))。在哺乳動物中很少有非侵入性去核方法，而在兩棲類動物中，將用紫外光輻射用作常規方法(GurdonQ.J.Microsc.Soc.101299-311(1960))。盡管在使用DNA特異性熒光染料期間，注意到小鼠卵母細胞暴露于紫外光超過30秒，將減小該細胞發育的潛力(Tsunoda等，J.Rprod.Fertil.82173(1988))，但在哺乳動物中沒有使用該方法的詳細報道。如上所述，可以通過實際除去核、原核或中期板(取決于受體細胞)進行物理性去核，或者諸如通過應用紫外光輻射或另一種去核影響，進行功能性去核。去核后，或者在不誘導卵母細胞激活的條件下與供體細胞融合，或者通過在非激活條件下進行注射導入供體核。為維持重組胚的正確倍性，供體核融合時必須為二倍體(即為細胞周期的G0或G1期)。一旦已經制備出適當的供體細胞和受體細胞，那么前者的核必需轉移到后者中。更好是通過融合進行核轉移。不應該在融合時進行激活。已經建立的用來誘導融合的三個方法為(1)將細胞暴露于促進融合的化學藥品，諸如聚乙二醇；(2)使用失活病毒，諸如仙臺病毒；(3)使用電刺激。將細胞暴露于促進融合的化學藥品(諸如聚乙二醇或其它二醇)為體細胞融合的常規方法，但它尚未廣泛地用于胚。由于聚乙二醇有毒，必需將細胞進行最短時間的暴露，需要能夠快速除去化學藥品迫使除去透明帶(Kanka等，Mol.Rprod.Dev.29110-116(1991))。在用小鼠胚的實驗中，失活仙臺病毒提供一個融合卵裂期胚的細胞的有效方法(GrahamWistarInst.Symp.Monogr.919(1969))，其另一實驗優點是不誘導激活。在有蹄類動物中，通常使用與誘導單性生殖激活相同的電刺激達到融合(WilladsenNature320(6)63-65(1986)；Prather等，Biol.Rprod.37859-866(1987))。在這些物種中，仙臺病毒在一部分情況下誘導融合，但不能完全用于常規應用(WilladsenNature320(6)63-65(1986))。盡管細胞-細胞融合為進行核轉移的推薦方法，但它不是可以使用的唯一方法。其它適宜的技術包括微注射(Ritchie和Campbell，J.ReproductionandFertilityAbstractSeriesNo.15，第60頁)。在本發明的推薦實施方案中，在缺乏激活的情況下，通過在0.3M甘露醇溶液或0.27M蔗糖溶液中進行電脈沖處理，完成卵母細胞細胞核對(couplet)的融合；另一方法是，可以通過在無鈣培養基中進行注射導入該核。融合/注射時卵母細胞的年齡和融合/注射介質缺乏鈣離子，防止受體卵母細胞激活。實際上，最好在卵母細胞達到中期II后盡可能快地去核和進行轉移。該時間是在成熟開始(體內)或激素處理(體外)后，這取決于物種。對于牛或羊，核轉移應該最好在24小時內進行；對于豬，應該在48小時內進行；對于小鼠，在12小時內進行；而對于兔，最好在20-24小時內進行。盡管可以較遲進行轉移，但隨著卵母細胞年齡變得越來越難以達到轉移。需要高MPF活性。隨后，一般回到成熟培養基的融合重組胚維持不被激活，使得供體核暴露于受體胞質中，其時間足以使重組胚變得最終能夠產生活體分娩(最好為可育后代)。激活前的最適時間隨物種而變化，這可容易地通過實驗確定。對于牛，6-20小時的時間是合適的。該時間可能至少不低于允許染色體形成的時間，但該時間也不能長到融合對同時激活或者在極端情況下重組胚死亡。當應該激活時，可以使用任何常規的或其它適當的激活方案。最近的實驗已經表明，單性生殖激活的需求比想象的更復雜。已經假定，激活為全或無現象，能夠誘導原核形成的多種處理全都引起“激活”。然而，將兔卵母細胞暴露于重復的電脈沖表明，僅選擇適當系列的脈沖并控制Ca2+能夠促進二倍體化卵母細胞發育至妊娠中期(OzilDevelopment109117-127(1990))。在受精期間，胞內鈣濃度重復地瞬時提高(Cutbertson&CobboldNature316541-542(1985))，相信電脈沖引起類似的鈣濃度的增加。有證據表明，鈣的瞬變模式隨物種而變化，預期電脈沖的最佳模式以類似方式變化。在兔中，脈沖之間的間隔大約為4分鐘(OzilDevelopment109117-127(1990))，在小鼠中，為10-20分鐘(Cutbertson&CobboldNature316541-542(1985))，而在母牛中的初步觀察為20-30分鐘(Robl等，SymposiumonCloningMammalsbyNucleartransplantation(seideled.)，ColoradoStateUniversity，24-27(1992))。在大多數建立的實驗中，用單個電脈沖誘導激活，但新的觀察表明，通過暴露于幾個脈沖，將增加發育的重組胚比例(Collas&RoblBiol.Reprod.43877-884(1990))。在任一個別情況下，可以進行常規調整，以優化脈沖數、場強度和脈沖持續時間以及培養基的鈣濃度。在本發明的實施中，在激活期間必須維持正確的倍性。需要抑制或穩定微管聚合，以便防止產生多個原核，由此保持正確的倍性。通過應用有效濃度(諸如大約5μg/ml)的微管抑制劑(諸如nocodazole)可以做到這一點。另一方法是，可以使用微管穩定劑，諸如taxol。微管的分子組分(微管蛋白)處于聚合和非聚合狀態之間的動態平衡。微管抑制劑(諸如nocodazole)防止微管蛋白分子加入微管中，由此打破平衡并導致微管解聚和紡錘體分解。最好在激活前加入微管抑制劑并留有足夠的時間，以確保完成或幾乎完成微管的解聚。在大多數情況下20-30分鐘可能是足夠的。諸如taxol的微管抑制劑防止紡錘體分解，因此也可以防止產生多個原核。最好在與使用微管抑制劑的相似條件下使用微管穩定劑。在激活后應該保持微管抑制劑或穩定劑的存在，直至形成原核。此后以及在發生第一分裂前的任何活動中應將其除去。在本發明的推薦實施方案中，成熟開始后30-42小時(對于牛和羊，即核轉移后6-18小時)時，將重組卵母細胞置于含有nocodazole(5μg/ml)的培養基中，采用常規方法激活。在激活刺激后，可以在nocodazole中繼續培養4-6小時(取決于物種和卵母細胞的年齡)。按照本發明的第二個方面，提供用前述方法制備的活重組動物胚。按照本發明的第三個方面，提供制備動物的方法，該方法包括(a)按上述方法重組動物胚；(b)使動物由胚發育至足月；(c)可選地由如此形成的動物進行繁殖。上面已經深入地描述了步驟(a)。本發明該方面方法中的第二步-步驟(b)是使動物由胚發育至足月。這可以直接或間接進行。在直接發育中，簡單地讓步驟(a)的重組胚進行發育，除允許進行發育可能必需的介入外，不用進一步的介入。然而在間接發育中，該胚在完全發育前可以進一步進行操作。例如，為了增加產量，可以使胚分裂，克隆細胞增加。或者或另外，借助于本發明，通過克隆擴大培養供體和/或如果采用系列(核)轉移方法，可以增加能活胚的產量。由于大多數胚不“重編程序”(盡管可接受數量的胚“重編程序”)，可能引起目前得到的胚事囊形成速率的限制。如果是這樣，那么可以如下提高該速率。每個能自身發育的胚在32-64細胞階段可以用作核供體；另一方法是，可以使用胚囊期的內細胞群細胞。如果這些胚實際上確實反映出已經具有重編程序的基因表達并且那些核事實上發生重編程序(看上去可能是)，那么這樣每個發育中的胚的繁殖有賴于核轉移方法的效率。可能得到的增加程度取決于細胞類型。在羊中，通過將16細胞胚的單個分裂球轉移至預激活的“通用受體”卵母細胞中，可以容易地獲得55％的胚囊期胚。因此，可以這樣假設，由單個細胞發育的每個胚可以產生8個16細胞期的胚。盡管這些數字只是大致的指導原則，但很明顯，在較遲的發育階段時，收益程度取決于該階段時該方法的效率。除提高產量的權宜之計的問題外，重組胚還可以體內或體外培養至胚囊。經驗表明，通過核轉移得到的胚與正常胚不同，有時得益于體內培養條件或甚至需要體內培養條件，而不是胚通常培養的條件(至少在體內)。不知道其原因。在牛胚常規增殖中，已經將重組胚(一次多個胚)在羊輸卵管中培養5-6天(如Willadsen在MammalianEggTransfer(Adams，E.E.，ed.)185CRCPress，BocaRaton，Florida(1982)中所述)。但是在本發明實施中，為了保護該胚，在轉移前最好應該將該胚包埋在保護性培養基(諸如瓊脂)中，然后在從臨時受體回收后從瓊脂中解剖出來。保護性瓊脂或其它培養基的功能有兩個第一，它起該胚的結構輔助器的作用，使透明帶保持在一起；第二，它對受體動物的免疫系統細胞起屏障的作用。盡管該方法提高形成胚囊的胚的比例，但其缺點是可能損失大量的胚。如果使用體外培養條件，那么本領域采用的那些常規條件是相當可接受的。在胚囊期，可以篩選該胚發育至足月的適應性。通常，這在該胚為轉基因和進行篩選，并且已經選擇穩定的整合體時進行。在該階段也可以篩選非轉基因的遺傳標記。然而，因為本發明方法允許早期篩選供體，因此一般最好進行篩選。如果進行篩選，那么在篩選后，讓胚囊胚發育至足月。這一般在體內進行。如果在體外發育至胚囊，那么在該階段轉移到最終受體動物中。如果在體內進行胚囊發育，那么盡管原則上可以讓胚囊在胚囊前宿主中發育至足月，但實際上通常從(臨時)胚囊前受體中取出胚囊，在從保護性培養基中解剖出來后，將其轉移至(永久)胚囊后受體中。在本發明該方面的可選步驟(c)中，可以由用先前步驟制備的動物繁殖動物。這樣，可以用一個動物來建立具有所需遺傳特性的一群動物。通過轉移來自遺傳相同細胞的核生產的動物共享相同的核，但嚴格來講這些動物是不相同的，因為它們得自不同的卵母細胞。不清楚這種不同來源的重要性，但它可能影響商業品質。最近在IowaStateUniversityBreedHerd的奶牛中進行的線粒體DNA分析表明與牛奶和生殖性能有關(Freeman和Beitz，SymposiumonCloningMammalsbyNuclearTransplantation(Seidel，G.E.Jr.，ed.)17-20，ColoradoStateUniversity，Colorado(1992))。仍有待于證實在整個牛群體中存在相似的作用，并且考慮是否可能或必需在特定情況下考慮卵母細胞的選擇。在牛育種領域中，由高遺傳價值供體生產大量胚的能力在通過國家牧群傳播遺傳改良方面可能具有相當大的潛在價值。應用范圍取決于每個胚的成本和能夠發育至足月的轉移胚的比例。通過說明和概述，以下流程陳述了可以制備轉基因和非轉基因動物的一般方法。該方法包括5個步驟(1)分離二倍體供體細胞；(2)可選地，例如通過轉染適當的具有或不具有選擇標記的構建物進行轉基因；(2a)可選地篩選和選擇穩定的整合體(微注射越過此步驟)；(3)通過核轉移進行胚重組；(4)體內或體外培養至胚囊；(4a)可選地篩選和選擇穩定的整合體(如果在2a進行篩選，則省略此步驟)或其它所需的特性；(5)必要時轉移至最終受體中。與先前建立的核轉移方法相比，該方案具有多個優點1)供體核的染色質可以在缺乏激活的受體卵母細胞的減數分裂胞質中暴露適當的時間。這可以通過改變染色質的結構增加供體核的“重編程序”。2)當轉移G0/G1核時，維持重組胚的正確倍性。3)現有研究已經表明，牛/羊卵母細胞的激活反應性隨年齡而提高。先前觀察到的一個問題是，在未去核的老化卵母細胞中發生減數分裂紡錘體極體的復制，并觀察到多極紡錘體。然而我們報道，在重組并維持該MPF水平的胚中，盡管核膜破裂并且發生染色質濃縮，但沒有觀察到形成的紡錘體。早熟濃縮的染色質保持緊密集攏，因此我們可以利用老化過程，提高重組胚的激活反應，而對重組胚的倍性不產生消極影響。按照本發明的第四個方面，提供按上述方法制備的動物。本發明每個方面的推薦特征是對其它方面而言的，可予以必需的修改。現在參考所附的實施例描述本發明，這些實施例的提供是為了說明本發明，不要解釋為限制本發明。在以下描述中參考附圖，其中圖1表明牛卵母細胞的體外成熟速率。具體實施例方式實施例1采用鈉卵母細胞的“MAGIC”方法該實驗方法的對象-受體卵母細胞命名為MAGIC(中期停頓的G1/G0接納胞質體MetaphaseArrestedG1/G0AcceptIngCytoplast)受體。研究了體外卵母細胞成熟期間核和胞質的活動。此外，也研究了融合和激活在不同年齡重組的胚中的作用。研究已經表明，卵母細胞的成熟是不同步的；然而，可以從形態學上選擇18小時的成熟卵母細胞群體(圖1)。卵母細胞的形態學選擇在圖1中，由當地屠宰場獲得卵巢，在運輸至實驗室期間維持28-32℃。用皮下注射針(內徑為1.2mm)在直徑為3-10mm的卵泡中吸出丘卵卵母細胞復合體(COC’3)，將其置于無菌塑料通用容器中。將通用容器置于溫室(35℃)中，在倒出四分之三上清液之前，讓卵泡物質沉淀10-15分鐘。余下的卵泡材料用等體積添加10％牛血清的解剖培養基(具有Earles鹽(Gibco)的TCM199，75.0mg/l卡那霉素、30.0mMHepes，pH7.4、克分子滲透壓濃度為280mOsmols/KgH2O)稀釋，轉移至85mm陪替氏培養皿中，在解剖顯微鏡下尋找COC’s。選擇具有至少2-3個致密層的卵丘細胞的復合體，在解剖培養基中洗滌3次，轉移至成熟培養基(具有Earles鹽(Gibco)的TC培養基199，75mg/l卡那霉素、30.0mMHepes、7.69mMNaHCO3，pH7.8、克分子滲透壓濃度為280mOsmols/KgH2O)中，該培養基添加10％牛血清和1×106粒膜細胞/ml，于39℃在空氣中5％CO2的氛圍中培養在搖床(rockingtable)上。從成熟培養皿中取出卵母細胞，在乙醇清洗的玻片上濕裝片，在蓋玻片下用5％石油膠凍和95％蠟的混合物將其粘附。然后裝片的胚在新鮮制備的甲醇∶冰醋酸(3∶1)中固定24小時，用45％的乙酸地衣紅(Sigma)染色，用NikonMicrophot-SA相差DIC顯微鏡檢查，圖1中的圖表示MII卵母細胞的百分比以及具有可見極體的卵母細胞的百分比。牛卵泡卵母細胞的激活如果繼續成熟直至24小時，那么這些卵母細胞在含鈣甘露醇中的激活比率非常低(24％)(表1a)。然而，從電脈沖介質中除去鈣和鎂將防止激活。表1a表示在體外不同時間成熟的牛卵泡卵母細胞的激活。從成熟培養基中取出卵母細胞，在激活培養基中洗滌1次，將其置于激活室中，給予80μs的電脈沖1.25kV/cm。表1a*許多2個或多個原核假去核牛卵母細胞的激活反應表1b表示體外成熟的在成熟開始后大約22小時(hpm)時假去核的牛卵母細胞的激活反應。卵母細胞完全按去核的方法進行處理，吸出不含中期板的小體積胞質。操作后，給予卵母細胞1.25KV/cm的單個直流脈沖，放回成熟培養基中，在30hpm和42hpm時將卵母細胞組裝片、固定和用乙酸地衣紅染色。結果表明5個單獨實驗每個時間點時的卵母細胞數，按相對于細胞總數具有原核的細胞數計。表1bhpm＝開始成熟后的小時數在去核牛卵母細胞中形成原核表2表示在與初級牛成纖維細胞融合(24hpm)并隨后激活(42hpm)的去核卵母細胞中原核的形成。結果代表5個實驗。將卵母細胞分為兩組，A組在激活前在nocodazole中溫育1小時，激活后在nocodazole中溫育6小時。B組不用nocodazole處理。在激活后12小時固定激活的卵母細胞，并用乙酸地衣紅染色。然后在相差下記錄每個parthenote中的原核(PN)數。結果以含有1個或多個原核的激活卵母細胞百分比表示。表2缺乏形成的紡錘體和缺乏極體表示，為了維持重組胚的正確倍性，那么應該只將二倍體(即G0/G1)核轉移至該胞質環境中。激活的卵母細胞在激活刺激前后，在微管抑制劑nocodazole中溫育5小時、1小時，防止形成小核(表2)，因此當供體核處于細胞周期的G0/G1期時，維持重組胚的正確倍性。結果這些結果表明i)這些卵母細胞可以在成熟開始后18小時去核(圖1)；ii)去核卵母細胞可以在0.3M甘露醇中或者在0.27M蔗糖中與供體分裂球/供體細胞融合，也可以在缺乏任何激活反應的情況下，在無鈣介質中注射供體細胞或供體核；iii)重組胚或脈沖處理的去核卵母細胞可以在成熟培養基中培養，不進行同時激活；iv)觀察轉移的核經歷核膜破裂(NEBD)和染色體濃縮。無論在轉移核的任何細胞周期階段，都沒有觀察到形成的減數分裂/有絲分裂紡錘體；v)這類操作的融合對在30小時和42小時時激活，激活頻率等于未操作的對照卵母細胞；vi)無論在轉移核的任何細胞周期階段，在隨后激活后都沒有觀察到極體；viii)隨后激活時，每個重組合子形成1-5個小核(表2)。采用“MAGIC”方法重建牛胚在初步實驗中，使用通過血清饑餓5天在細胞周期G0期同步的初級成纖維細胞，已經將該技術應用于牛胚的重組。結果總結于表3中。表3表明通過將核由血清饑餓的(G0)牛初級成纖維細胞轉移至去核未激活MII卵母細胞中重組的牛胚的發育。在24hpm時重組胚，而在42hpm時該融合對激活。在激活前，融合對在含nocodazole(5μg/ml)的M2培養基中培養1小時，在激活后培養5小時。用80μs的單個直流脈沖1.25KV/cm激活融合對。表3實施例2采用羊卵母細胞的“MAGIC”方法我們也已經在在體內已成熟的羊卵母細胞中進行了與實施例1相似的觀察。可以通過在前列腺素處理后24小時，沖洗超刺激母羊的輸卵管，取出新排卵的卵母細胞。使用無鈣鎂的PBS/1.0％FCS作為沖洗介質，防止卵母細胞激活。卵母細胞可以在無鈣介質中去核，在缺乏激活的情況下按上述方法導入供體細胞。沒有觀察到形成的紡錘體，在隨后激活時形成多個核，這可以通過nocodazole處理抑制。結果在羊的初步實驗中，單次妊娠已經導致一個活羔羊出生。結果總結于表4和表5中。表4表示通過將得自建立的細胞系的胚轉移至未激活的體內成熟的去核羊卵母細胞中重組的羊胚的發育。由超刺激的蘇格蘭黑臉母羊獲得卵母細胞，由得自威爾士mountainewe獲得的9天大的胚的胚盤建立細胞系。重組胚在臨時受體母羊的結扎輸卵管中培養6天，然后取出，分析發育。表4表5表示將所有桑椹胚期/胚囊期重組的胚轉移至同步的最后受體黑臉母羊的子宮角后，誘導妊娠。該表表明，來自妊娠頻率的每個轉移組的胚總數，以母羊和胚計，在大多數情況下，每只母羊轉移2個胚。建立了導致單個活羔羊出生的單次雙妊娠。表5權利要求1.一個重組動物胚的方法，該方法包括將二倍體核轉移到停頓在第二成熟分裂中期的卵母細胞中，同時不激活卵母細胞，保持該核暴露于受體胞質中，暴露時間足以使該胚變得能夠產生活體分娩，隨后激活重組胚，同時維持正確的倍性。2.權利要求1中要求保護的一個方法，其中該動物為有蹄類動物。3.權利要求2中要求保護的一個方法，其中該動物為母牛或公牛、豬、山羊、羊、駱駝或水牛。4.權利要求1-3的任一項中要求保護的一個方法，其中對供體核進行遺傳修飾。5.權利要求1-4的任一項中要求保護的一個方法，其中由靜止期細胞貢獻二倍體核。6.權利要求1-5的任一項中要求保護的一個方法，其中將受體卵母細胞去核。7.權利要求1-6的任一項中要求保護的一個方法，其中通過細胞融合達到核轉移。8.權利要求1-7的任一項中要求保護的一個方法，其中該動物為母牛或公牛，而在激活前保持供體核暴露于受體胞質6-20小時。9.權利要求1-8的任一項中要求保護的一個方法，其中在激活期間，通過微管抑制維持正確的倍性。10.權利要求9中要求保護的一個方法，其中通過應用nocodazole達到微管抑制。11.權利要求1-8的任一項中要求保護的一個方法，其中在激活期間，通過微管穩定維持正確的倍性。12.權利要求11中要求保護的一個方法，其中通過應用taxol達到微管穩定。13.制備動物的方法，該方法包括(a)按任一前述權利要求要求保護的方法重組動物胚；(b)使動物由胚發育至足月；(c)可選地由如此形成的動物進行育種。14.權利要求13中要求保護的一個方法，其中該動物胚在完全發育之前進行進一步操作。15.權利要求14中要求保護的一個方法，其中由該胚得到不止1個動物。16.重組動物胚，它能夠產生活體分娩，并用權利要求1-12的任一項中要求保護的方法制備。17.用權利要求13-15的任一項中要求保護的方法制備的動物。18.由權利要求16中要求保護的胚發育的動物。全文摘要重組一個動物胚胎的方法涉及將二倍體核轉移至一個停滯在第二成熟分裂中期的卵母細胞中。卵母細胞在轉移時是未激活的，因此供體核保持暴露于受體細胞質一定時間。可以由轉移時為細胞周期G0或G1期的細胞提供二倍體核。隨后，激活重組胚胎。在激活期間，例如通過在諸如nocodazole等的微管抑制劑存在下培養重組胚胎，保持正確的倍性。然后重組胚胎導致一個或多個動物的誕生。本發明可用于轉基因動物的生產以及具有高遺傳價值的非轉基因動物。文檔編號C12N15/873GK1772891SQ20051012702公開日2006年5月17日申請日期1996年8月30日優先權日1995年8月31日發明者K·H·S·坎貝爾,I·維慕特申請人:羅斯林學院(愛丁堡),英國農漁業及食品部,生物技術及生物科學研究委員會