專利名稱：一種用于抗氧化藥物篩選的細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物篩選模型，具體的說，涉及一種用于抗氧化藥物篩選的細(xì)胞模型及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
氧化損傷是常見的病理現(xiàn)象。人類衰老、腫瘤發(fā)生過程中氧化損傷是原因之一?？寡趸幬镏饕峭ㄟ^清除活性氧自由基，預(yù)防脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)生和阻斷脂質(zhì)過氧化的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來發(fā)揮其作用[1]。
藥物篩選模型是尋找和發(fā)現(xiàn)新藥的重要條件之一。以往經(jīng)典的抗氧化模型如過氧化氫等的檢測(cè)方法比較復(fù)雜且有著明顯的缺陷，因?yàn)樗鼈儾荒芊从郴衔锏目寡趸瘷C(jī)制(如抗氧化蛋白之間的相互作用)、不能高通量和微量化檢測(cè)。分子與細(xì)胞水平的篩選模型具有材料用量少，藥物作用機(jī)制明確，可進(jìn)行大規(guī)模篩選等特點(diǎn)，已成為目前藥物篩選的主要方法。在03109791.X專利申請(qǐng)中，發(fā)明人提供了一種采用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和活化因子(STAT)作為藥物篩選靶點(diǎn)并包括熒光酶報(bào)告基因的細(xì)胞篩選模型，可用于抗腫瘤藥物和及抗過敏藥物的篩選。
抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant Response Element，ARE)的基本概念是順式作用的DNA序列與反式作用因子如何協(xié)調(diào)控制真核基因的表達(dá)。這些相互作用是由轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物特異結(jié)合到增強(qiáng)子或啟動(dòng)子元件上介導(dǎo)的。這些元件即通常所說的調(diào)控序列，它一般見于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游。調(diào)控序列(抗氧化元件)確定后，將所研究的基因中推測(cè)的順式作用序列與一個(gè)易于檢測(cè)其產(chǎn)物的報(bào)告基因編碼序列相連，通過對(duì)報(bào)告基因表達(dá)產(chǎn)物的測(cè)定來測(cè)出完整的調(diào)控序列。
轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在中心蛋白內(nèi)部結(jié)合到抗氧化蛋白基因5’調(diào)控區(qū)的抗氧化反應(yīng)元件上，介導(dǎo)抗氧化應(yīng)激的蛋白的表達(dá)。由于在研究基因方面，ARE可誘導(dǎo)單氧化物酶和擁有順式增強(qiáng)元件，包括鼠Gsta1亞基因增強(qiáng)作用和鼠與人的NQO1基因等，使它在轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)通路方面有著重要的增強(qiáng)作用[2]。
建立基于抗氧化元件的抗氧化藥物細(xì)胞篩選模型有利于該類藥物的高通量篩選，為發(fā)現(xiàn)和尋找新藥提供了一種簡(jiǎn)便快速的方法[3]。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便、快速的篩選抗氧化藥物的細(xì)胞模型。
本發(fā)明提供的藥物模型是克隆了報(bào)告基因表達(dá)載體，并在載體啟動(dòng)子上游位點(diǎn)插入一個(gè)或一個(gè)以上串連的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)的體外培養(yǎng)細(xì)胞。
其中，報(bào)告基因優(yōu)選pTAL-SEAP載體。當(dāng)幾個(gè)ARE序列串連時(shí)，優(yōu)選的數(shù)量是2～20個(gè)，在每個(gè)ARE序列間可插入連接堿基。體外培養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選293細(xì)胞。
本發(fā)明中的抗氧化元件，不僅能闡述抗氧化介導(dǎo)的調(diào)控基因的表達(dá)機(jī)制及規(guī)律，還可誘導(dǎo)細(xì)胞表面親電子的化合物和酚基抗氧化作用；可進(jìn)行微量檢測(cè)；高通量；直接定位在靶位點(diǎn)(靶標(biāo))，準(zhǔn)確可靠。把靶基因如(病毒感染、腫瘤、炎癥、免疫系統(tǒng)疾病等)表達(dá)的調(diào)控序列與編碼某種酶活性的基因相連，輸入細(xì)胞內(nèi)，通過簡(jiǎn)單地檢測(cè)酶活性變化，就可以反映化合物對(duì)轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)作用性和程度。
本發(fā)明的另一目的是提供細(xì)胞模型的構(gòu)建方法(1)合成抗氧化反應(yīng)元件調(diào)控序列ARE片段，在ARE片段的5′末端和3′末端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，以便于和載體連接；(2)ARE片段和報(bào)告基因表達(dá)載體由連接酶催化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA，測(cè)序以鑒定陽性克??；(3)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，培養(yǎng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，制成氧化損傷模型。
其中步驟(1)ARE片段串連的抗氧化反應(yīng)元件的個(gè)數(shù)優(yōu)選在2～20之間，每個(gè)元件間以堿基連接；步驟(2)中報(bào)告基因表達(dá)載體優(yōu)選pTAL-SEAP載體；步驟(3)中體外培養(yǎng)細(xì)胞優(yōu)選293細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種最佳的方案，其中步驟(1)所述ARE片段串連的抗氧化反應(yīng)元件的個(gè)數(shù)是6個(gè)，每個(gè)元件間以2個(gè)堿基TA連接。
本發(fā)明提供的細(xì)胞模型具有活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜功能，易于操作。利用細(xì)胞體系易于推斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并且能闡明關(guān)鍵的細(xì)胞功能，提高了篩選活性化合物的能力，能更好地反映其作用機(jī)制。細(xì)胞模型簡(jiǎn)單、靈敏，可在微孔中操作的熒光檢測(cè)，尤其適用于高通量藥物篩選。
圖1、重組報(bào)告基因載體pARE-TAL-SEAP構(gòu)建流程圖2、重組報(bào)告基因載體pARE-TAL-SEAP酶切鑒定，A為Marker DL-2000，B、C為XHo I、Kpn I雙酶切片段圖3、H2O2氧化損傷后25μmol/L濃度的樣品對(duì)293細(xì)胞的保護(hù)作用圖4、H2O2氧化損傷后100μmol/L濃度的樣品對(duì)293細(xì)胞的保護(hù)作用
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例是為了進(jìn)一步說明本發(fā)明提供的抗氧化藥物篩選細(xì)胞模型的實(shí)施方式和用途。實(shí)施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍，本領(lǐng)域技術(shù)人員在權(quán)利要求的范圍內(nèi)所做出的某些改變和調(diào)整也應(yīng)認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例一、重組質(zhì)粒的建立1、材料1.1細(xì)胞株、質(zhì)粒與菌株HEK-293細(xì)胞為本室保存。SEAP報(bào)告基因載體pTAL-SEAP、β-半乳糖苷酶(β-galactosiase，β-gal)表達(dá)質(zhì)粒由呂秋軍研究員提供。大腸桿菌DH5α為本室保存。
1.2工具酶及其他試劑Kpn I Xho I限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、T4Polynucleotide Kinase、ATP酶購(gòu)自寶生物公司；PRMI 1640培養(yǎng)基、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Promege公司；SEAP熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自CLONTECH公司；脂質(zhì)體LIPOFECTAMINETM2000 Reagent購(gòu)自Gibco InvitrogenCorporation公司。
1.3主要儀器二氧化碳培氧箱(Nuaire)；倒置生物顯微鏡(XSZ-D2)、臺(tái)式高速離心機(jī)(D-37520，OsterodeLabfuge400R)；核酸蛋白分析儀(UD-640)；微孔板熒光讀數(shù)儀(POLARstar talaxy)。
2、方法2.1調(diào)控序列的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)抗氧化反應(yīng)元件特異(ARE)序列為TGACTCAGC，每個(gè)元件間以2個(gè)堿基TA連接，本研究設(shè)計(jì)的重組報(bào)告基因載體的調(diào)控序列為ARE片段6×ARE，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)pTAL-SEAP載體啟動(dòng)子上游多克隆位點(diǎn)酶切圖譜在6×ARE片段的5′末端和3′末端分別設(shè)計(jì)了Kpn I和Xho I酶切位點(diǎn)，以便于和載體連接。50μl體系中T4多核苷酸激酶20(U)；1mmATP；加上引物100pmol，37℃反應(yīng)1h，然后68℃ 20min滅活T4多核苷酸激酶，以上反應(yīng)95℃ 5min后逐漸降至50℃，維持20℃約1-2h完成退火。
2.2片段的回收和純化根據(jù)基因載體pTAL-SEAP和6×ARE正義、反義經(jīng)退火處理形成的雙鏈DNA，載體用Kpn I和Xho I雙酶切回收并純化。
2.3重組報(bào)告基因載體的構(gòu)建、篩選及鑒定雙鏈6×ARE片段和pTAL-SEAP載體由T4DNA連接酶催化，于16℃反應(yīng)4h，6×ARE與載體的摩爾比為9∶1。將連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取10個(gè)單菌落，小量擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切后用2％agase瓊脂糖電泳鑒定及送往北京華大中生科技有限公司進(jìn)行測(cè)序以鑒定陽性克隆。重組報(bào)告基因載體pARE-TAL-SEAP構(gòu)建流程如圖1。
實(shí)施例二、抗氧化藥物的篩選在含5％新生小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基5％CO2條件下培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞。收細(xì)胞接種于24孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為5×104待細(xì)胞達(dá)90％時(shí)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒。每孔加入pARE-TAL-SEAP 1μg，β-gal 0.1μg脂質(zhì)體2μl，轉(zhuǎn)染6h后每孔補(bǔ)充0.5ml完全培養(yǎng)液，同時(shí)加入25μmol/L H2O2于每孔中，以制成氧化損傷模型。
用25μmol/L H2O2氧化損傷293細(xì)胞后加入25μmol/L及100μmol/L的1#、2#、3#、4#樣品。其中5#樣品為一不具有抗氧化作用的陰性對(duì)照，6#樣品為已知的具有抗氧化活性的物質(zhì)其他為待測(cè)樣品。
在上述的四種化合物中1#的抗氧化活性在100μmol/L時(shí)的作用最強(qiáng)(SEAP值是最高的)，而在25μmol/L時(shí)的作用不明顯。1#的抗氧化活性在100μmol/L時(shí)誘導(dǎo)SEAP的最大表達(dá)水平較對(duì)照孔可升高1.14倍(見圖3、圖4)，說明其可抑制H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。而6#樣品無此功能。
參考文獻(xiàn)1、M itchell JH et al.Arch Biochem Biophys，1998，360(1)142-1482、Truyen Nguyen，Philip J.et al.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2003.43233-603、劉瓊、呂秋軍、溫利清等。基于報(bào)告基因的雌激素受體α亞型配體篩選模型的建立和應(yīng)用.藥學(xué)學(xué)報(bào).2000.35(10)747。
權(quán)利要求
1.一種用于抗氧化藥物篩選的細(xì)胞模型，是克隆了報(bào)告基因表達(dá)載體，并在載體啟動(dòng)子上游位點(diǎn)插入一個(gè)或一個(gè)以上串連的抗氧化反應(yīng)元件的體外培養(yǎng)細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞模型，其特征是所述報(bào)告基因表達(dá)載體選自pTAL-SEAP載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細(xì)胞模型，其特征是串連的抗氧化反應(yīng)元件的個(gè)數(shù)在2～20之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細(xì)胞模型，其特征是串連的抗氧化反應(yīng)元件的個(gè)數(shù)是6個(gè)，每個(gè)元件間以2個(gè)堿基TA連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞模型，其特征是所述體外培養(yǎng)細(xì)胞選自293細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1所述細(xì)胞模型的構(gòu)建方法，其特征是包含以下步驟(1)合成抗氧化反應(yīng)元件ARE片段，在ARE片段的5’末端和3’末端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)，以便于和載體連接；(2)ARE片段和報(bào)告基因表達(dá)載體由連接酶催化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌；擴(kuò)增，提取質(zhì)粒DNA，測(cè)序以鑒定陽性克??；(3)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，培養(yǎng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，制成細(xì)胞模型。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征是步驟(1)中ARE片段串連的抗氧化反應(yīng)元件的個(gè)數(shù)在2～20之間，每個(gè)元件間以堿基連接。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征是步驟(2)中報(bào)告基因表達(dá)載體選自pTAL-SEAP載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的構(gòu)建方法，其特征是步驟(3)中所述體外培養(yǎng)細(xì)胞選自293細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于抗氧化藥物篩選的細(xì)胞模型，該模型是克隆了報(bào)告基因表達(dá)載體，并在載體啟動(dòng)子上游位點(diǎn)插入一個(gè)或一個(gè)以上串連的抗氧化反應(yīng)元件的體外培養(yǎng)細(xì)胞。本發(fā)明還提供了模型的構(gòu)建方法。細(xì)胞模型易于推斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果，能闡明關(guān)鍵的細(xì)胞功能，能更好地反映藥物作用機(jī)制，可在微孔中進(jìn)行熒光檢測(cè)，尤其適用于高通量藥物篩選。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1958791SQ200510118390
公開日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2005年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月31日
發(fā)明者謝玲, 黃海瀟, 張 浩, 熊國(guó)林, 邢爽, 呂秋軍, 從玉文, 羅慶良 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所