菌根真菌在金線蓮大面積栽培中的應用的制作方法

專利名稱：菌根真菌在金線蓮大面積栽培中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體地說涉及一項在金線蓮大面積栽培中應用菌根真菌以縮短金線蓮生產周期，提高金線蓮產量和質量的技術方法。

背景技術：
金線蓮是一種名貴珍稀的中草藥，為蘭科開唇蘭屬(金線蓮屬)(Anoectochilus Blume)多年生草本植物，在我國主要分布于浙江、福建、江西、廣東、廣西、海南、貴州、云南、西藏、臺灣等省區。金線蓮是全草入藥，具有清熱涼血、祛風利濕、強心、降血壓、解毒、止痛、鎮咳等功效，民間多用于消炎、鎮痛，治療肺結核、肺熱咳嗽，風濕性關節炎、小兒驚風、跌打損傷、蛇傷等多種疾病，均有很好療效。近年來，金線蓮又被用于治療高血壓、糖尿病、肝炎及腫瘤等疑難病癥，其功效日益引起醫藥界的重視。金線蓮在民間素有“金草”、“神藥”、“烏人參”等美稱，在臺灣更是被稱為“藥王”。經測定發現，金線蓮中氨基酸類成分的組成和含量，以及具有抗衰老活性的微量元素的含量均高于西洋參。
金線蓮生于海拔400-1200米之間的闊葉林或針闊葉混交林中，一般生長在通風良好、濕度高、光線較弱的山澗常綠闊葉林下，石壁、溝邊、巖縫等陰濕地帶也常有分布。金線蓮的分布范圍較窄，生長的生態條件獨特，自然繁殖率低，生長緩慢，加上鳥類嗜食，使金線蓮自然資源儲量極其有限。近年來對該植物的需求量猛增，產區人們過度采挖，導致金線蓮野生資源日漸枯竭。由于金線蓮資源緊缺、價格昂貴，對金線蓮的研究多涉及文獻考證、組培及商品調查等方面。從1990年開始，福建省科委、教委和林業廳陸續設立專項基金進行金線蓮的組織培養及栽培技術研究，目的是為提高金線蓮繁殖速度和進行金線蓮的人工栽培奠定基礎。在金線蓮菌根研究方面，江海燕等觀察到有真菌侵染金線蓮種子的現象；我們在野生金線蓮的根中也觀察到有真菌的存在，并從該類植物中分離出多種內生真菌。
金線蓮試管苗快速繁殖已經獲得了成功，但試管苗出瓶后成活率低，生長緩慢，生產周期長，有效成分含量低。到目前為止，由于這些問題的存在，使得金線蓮的生產還不能實現大面積的人工栽培。利用菌根技術將金線蓮與菌根真菌共生培養，篩選出能有效促進金線蓮生長發育的優良菌株，對保存金線蓮種質資源，提高藥效，開辟金線蓮大面積栽培生產的新途徑具有重大理論意義和應用價值。


發明內容
本發明的目的在于提供一種應用菌根真菌大面積栽培金線蓮的方法，該方法可以提高金線蓮的繁殖率和栽培成活率，可以縮短栽培金線蓮的生長周期，提高金線蓮的產量和質量，解決金線蓮資源短缺的問題。
為實現上述目的，本發明采用的技術是先分別培養菌根真菌和金線蓮苗，當金線蓮苗移栽到大田時加入菌根真菌共生栽培。本發明采用的4種小菇屬菌根真菌經培養鑒定，分別為分離自鐵皮石斛的石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)，分離自天麻的紫萁小菇MO-1(Mycenaosmundicola)，分離自墨蘭的蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)和分離自福建金線蓮(花葉開唇蘭)的開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)。這4種真菌于2002年1月14日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所，保藏編號分別為MD-1CGMCC No.0685；MO-1CGMCC No.0689；MO-2CGMCC No.0688；MA-1CGMCC No.0687；保藏和存活證明見附件。
具體地說，本發明所述技術的步驟方法如下(除有特殊說明外，本發明中所述的比例均為重量百分比) 1.菌根真菌的培養 將上述4種菌根真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，分別轉接于PDA平皿中，于22-28℃恒溫培養10-20天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養基中分別進行發酵培養制成種子菌種；種子菌種可以進一步接入液體或固體培養基進行放大培養。
真菌液體培養的培養基含有葡萄糖、無機鹽類成分和天然添加物，其中葡萄糖的加入量為1.5-4％；無機鹽類成分可以為硫酸鎂，磷酸二氫鉀，或磷酸氫二鉀，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀以任意比例混合的混合物，其加入量為硫酸鎂0.1-0.3％，磷酸二氫鉀0.1-0.5％，或磷酸氫二鉀0.1-0.5％，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以為麥麩(煮汁)，其加入量為2-5％。培養基pH 5.0-6.5。三角瓶或其他容器振蕩培養或發酵罐通氣培養，培養容器裝量10-60％。培養基滅菌后接入上述菌根真菌，種子菌種接種量為培養容器裝量的5-20％。菌根真菌液體培養的培養條件為振蕩轉速80-150轉/分鐘，18-28℃暗培養10-30天。培養結束后可直接使用或用勻漿機打碎培養產物備用。
菌根真菌固體培養的培養基中天然纖維性或淀粉性物質可以為闊葉樹鋸末、麥麩和碎玉米粒，這3種原料加入量之間的比例按重量計為闊葉樹鋸末∶麥麩∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5。固體培養基的加水量為以上3種原料總重量的1-4倍。培養基pH 5.0-6.5。試管、玻璃罐頭瓶或塑料袋等器皿靜置培養，培養容器裝量50-80％。培養基滅菌后接入液體培養的小菇屬真菌的種子菌種，種子菌種的接種量為培養容器裝量的5-15％。固體培養的培養條件為18-28℃暗培養，待菌絲從培養基頂部長入底部或長滿培養基時(2個月左右)取出備用。
2.金線蓮苗的培養 金線蓮帶有節的莖段經過芽分化、叢芽增殖、壯苗生根等步驟的培養，培育成苗。經壯苗生根培養后的金線蓮苗可以在繼代培養基上繼代培養。各步驟所用培養基及培養時間分別為 (1)用于芽分化的培養基是以MS培養基為基本培養基，附加6-芐基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，其加入量為每升(L)培養基加入6-BA0.5-3.0mg，NAA0.4-2.5mg。培養時間45-120天。
(2)用于叢芽增殖的培養基是以MS培養基為基本培養基，附加6-BA、吲哚丁酸(IBA)和玉米素(ZT)，其加入量為每升(L)培養基加入6-BA0.5-3.0mg，IBA0.3-1.5mg，ZT0.05-0.3mg。培養時間45-120天。
(3)用于壯苗生根的培養基使以MS培養基為基本培養基，附加NAA和IBA，其加入量為每升(L)培養基加入NAA0.5-3mg，IBA0.5-2mg。培養時間為45-120天。
(4)用于苗繼代的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入馬鈴薯(煮汁)100-300g。培養時間45-90天。
金線蓮芽分化、金線蓮叢芽增殖、壯苗生根和苗的繼代培養中，所用的每升(L)MS和1/2MS基本培養基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、瓊脂6-15g。壯苗生根和苗的繼代培養中，所用的每升(L)培養基中均要添加活性炭0.5-4g。培養基pH 5.0-6.5。用試管或玻璃瓶等器皿培養，培養容器裝量10-50％。苗的培養條件為15-26℃光照培養，光照強度1500-5000Lux，光照時間8-12小時/天。
3.金線蓮苗與菌根真菌的共生栽培、田間管理及收獲 金線蓮苗與菌根真菌的共生栽培基質有以下幾種 (1)基質1中可以有蛭石和砂子，這2種材料加入量之間的比例按重量計為蛭石∶砂子＝4∶1-4； (2)基質2中可以有腐殖土和砂子，這2種材料加入量之間的比例按重量計為腐殖土∶砂子＝6∶1-6； (3)基質3中可以有泥炭土和砂子，這2種材料加入量之間的比例按重量計為泥炭土∶砂子＝5∶1-5； (4)基質4中可以有泥炭土、砂子和蛭石，這3種材料加入量之間的比例按重量計為泥炭土∶砂子∶蛭石＝1-4∶1∶2-4； (5)基質5可以是腐殖土。
栽培中還要用到山毛櫸科Fagaceae植物櫟樹或其他雜木樹的自然落葉，用時粉碎并浸濕，碎樹葉直徑0.5-2cm。
上述栽培基質中用到的腐殖土可直接使用，或高溫滅菌，或提前兩個月鋪好使其熟化，或堆積并蓋塑料布發酵1-2個月，使其熟化以消除病蟲害。
4種菌根真菌的液體培養物或固體培養物，在用于與金線蓮的共生栽培時，可以單獨使用，或分別培養后任意選擇兩種或兩種以上共同使用。金線蓮苗和菌根真菌按以下方法共生栽培 (1)地上遮陽栽培在具有遮陽網的露天大棚，或塑料薄膜溫室，或玻璃溫室中進行栽培，栽培基質厚度5-20cm。栽培時以2-5株金線蓮苗為一叢進行栽培，先在每叢金線蓮苗根的基部放置0.5-5g濕的碎樹葉，再在每叢金線蓮苗的根部放置上述制備好的菌根真菌液體培養物0.4-2.5ml，或菌根真菌固體培養物0.3-2.0g，最后用栽培基質壓住苗的根部。苗叢栽培的株、行距為8-18cm。
(2)立體遮陽栽培在地上搭架分層立體栽培，在硬質材料的盆或盒等容器的底部平鋪一層共生栽培基質，栽培基質厚度3-10cm。栽培時以2-5株金線蓮苗為一叢進行栽培，先在每叢金線蓮苗根的基部放置0.5-5g濕的碎樹葉，再在每叢金線蓮苗的根部放置上述制備好的菌根真菌液體培養物0.4-2.5ml，或菌根真菌固體培養物0.3-2.0g，最后用栽培基質壓住苗的根部。苗叢栽培的株、行距為8-18cm。
金線蓮苗與菌根真菌共生栽培后需要的生長條件環境溫度為5-30℃，光照量為正常日光量的1/3或1/2，避免直射光，或照度為2000-10000Lux。在金線蓮與菌根真菌共生的過程中每年可以補施液體培養或固體培養的菌根真菌0-5次； 與菌根真菌共生栽培的金線蓮，在上述栽培條件下生長6-12個月可以收獲，收獲時可剪取地上部分，留幼小苗或芽，也可一次性連根取出洗凈栽培基質；陰干或60℃以下烘干。

具體實施例方式 實施例一 1.開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)的培養 將MA-1自低溫保藏的斜面試管菌種活化一次后，轉接于PDA平皿中，25℃恒溫培養10天，用φ8mm的打孔器分別在平皿中的菌落邊緣打孔成菌片，分別以小碎塊接入液體培養基中發酵培養。液體培養基的組成按重量百分含量計算為葡萄糖2.5％，磷酸二氫鉀0.15％，磷酸氫二鉀0.1％，硫酸鎂0.15％，麥麩3％(煮汁)。培養基pH 5.6。500ml三角瓶裝培養基250ml，高壓滅菌后接入MO-1真菌。培養條件為搖床震蕩轉速120轉/分鐘，23℃暗培養14天后用勻漿機打碎菌體及發酵物備用。
2.福建金線蓮[Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.](即花葉開唇蘭)苗的培養 福建金線蓮帶有節的莖段經過芽分化、叢芽增殖、壯苗生根等步驟的培養，培育成苗。
金線蓮芽分化的培養基是以MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖30g，肌醇100mg，6-芐基腺嘌呤(6-BA)1.0mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，瓊脂9g。培養基pH5.6。100mL玻璃三角瓶裝量25mL，121℃滅菌20分鐘，接入福建金線蓮帶有節的莖段。培養條件為23-26℃光照培養100天，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。
金線蓮叢芽增殖的培養基是以MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖20g，肌醇90mg，6-芐基腺嘌呤(6-BA)1.5mg，吲哚丁酸(IBA)0.5mg，玉米素(ZT)0.15mg，瓊脂10g。培養基pH 6.0。100mL玻璃三角瓶裝量35mL，121℃滅菌20分鐘，接入福建金線蓮芽。培養條件為23-26℃光照培養90天，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。
壯苗生根培養的培養基是以MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖35g，肌醇120mg，NAA 2mg，IBA 1mg，活性炭2g，瓊脂9g。培養基pH 5.7。100mL玻璃三角瓶裝量30mL，121℃滅菌20分鐘，接入福建金線蓮苗。培養條件為23-26℃光照培養120天，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。培養至福建金線蓮苗的莖直徑0.15cm以上，株高5cm以上，具有4片以上的葉，2條以上長1cm左右的根的壯苗即可進行栽培。
金線蓮苗繼代的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入馬鈴薯(煮汁)200g，蔗糖25g，肌醇100mg，活性炭2g，瓊脂7.5g。培養基pH 5.8。玻璃罐頭瓶裝量30％，121℃滅菌20分鐘，接入福建金線蓮的壯苗。培養條件為23-26℃光照培養，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。暫時不能移栽的金線蓮的壯苗在此培養基上培養。
3.福建金線蓮苗與蘭小菇MA-1的共生栽培 共生栽培基質選用基質5腐殖土。腐殖土提前1個月左右堆積，并蓋塑料布，使其發酵熟化后使用。采用地上遮陽的方法，在玻璃溫室中進行栽培。在溫室鋪一層10-12cm厚的熟化好的腐殖土，栽培時以3-4株福建金線蓮苗為一叢進行栽培，先在每叢福建金線蓮苗根的基部放置1.5g左右的濕的碎樹葉，再在每叢福建金線蓮苗的根部放置上述制備好的MA-1真菌液體培養物1.5ml左右，使福建金線蓮苗的根部與MA-1真菌培養物接觸，最后用腐殖土壓住苗的根部。苗叢栽培的株、行距為10cm。
玻璃溫室的環境溫度控制在18-25℃，其空氣溫度夏天應控制在25℃以下，冬天應控制在18℃以上。溫室內要有遮陽網，避免直射光，光照量為正常日光量的1/3左右，照度2000-500Lux，最忌夏秋中午前后的直射光，每天光照9-11h。金線蓮生長需較高的空氣濕度，但栽培基質中不宜積水。
福建金線蓮苗與蘭小菇MA-1共生栽培后，每隔3個月補施一次液體培養或固體培養的蘭小菇MA-1，栽培后9個月收獲，收獲時一次性連根取出，洗凈栽培基質，60℃以下烘干。
實施例二 1.石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)、紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)、蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)和開唇蘭小菇。開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)的培養 將MD-1，MO-1，MO-2和MA-1分別自低溫保藏的斜面試管菌種活化一次后，分別轉接于PDA平皿中，25℃恒溫培養20天，用φ8mm的打孔器分別在平皿中的菌落邊緣打孔成菌片，分別以小碎塊接入液體培養基中發酵培養。液體培養基的組成按重量百分含量計算為葡萄糖3％，磷酸二氫鉀0.3％，硫酸鎂0.15％，麥麩3％(煮汁)。培養基pH 6.0。500ml三角瓶裝培養基200ml，高壓滅菌后分別接入以上4種菌根真菌。培養條件為搖床震蕩轉速100轉/分鐘，25℃暗培養25天，作為以上4種菌根真菌的種子菌種。
將液體培養的4種菌根真菌的種子菌種分別接入固體培養基中進行培養。固體培養基的組成為闊葉樹鋸末、麥麩和碎玉米粒，這3種原料加入量之間的比例按重量計為闊葉樹鋸末∶麥麩∶碎玉米粒＝1∶1∶0.5。固體培養基的加水量為以上3種原料總重量的3倍。培養基pH5.8。培養基裝在玻璃罐頭瓶中，培養容器裝量60-70％。培養基滅菌后分別接入液體培養的4種菌根真菌的種子菌種，種子菌種的接種量為培養容器裝量的10％左右。培養條件為22-23℃靜置暗培養。待真菌的菌絲從培養基頂部長入底部或長滿培養基時取出，將4種菌根真菌培養物等量混合，備用。
2.臺灣金線蓮[Anoectochilus formosanus(Wall.)Lindl.]苗的培養金線蓮帶有節的莖段經過芽分化、叢芽增殖、壯苗生根等步驟的培養，培育成苗。金線蓮芽分化的培養基是以MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖20g，肌醇90mg，6-芐基腺嘌呤(6-BA)1.5mg，萘乙酸(NAA)1mg，瓊脂8g。培養基pH 5.9。100mL玻璃三角瓶裝量35mL，121℃滅菌20分鐘，接入臺灣金線蓮帶有節的莖段。培養條件為23-26℃光照培養80天，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。
金線蓮叢芽增殖的培養基是以MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖25g，肌醇100mg，6-芐基腺嘌呤(6-BA)2mg，吲哚丁酸(IBA)1mg，玉米素(ZT)0.2mg，瓊脂9g。培養基pH 6.0。100mL玻璃三角瓶裝量30mL，121℃滅菌20分鐘，接入臺灣金線蓮芽。培養條件為23-26℃光照培養70天，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。
壯苗生根培養的培養基是以MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖30g，肌醇110mg，NAA 1.5mg，IBA 1mg，活性炭3g，瓊脂9g。培養基pH 6.0。100mL玻璃三角瓶裝量35mL，121℃滅菌20分鐘，接入臺灣金線蓮苗。培養條件為23-26℃光照培養100天，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。培養至臺灣金線蓮苗的莖直徑0.15cm以上，株高5cm以上，具有4片以上的葉，2條以上長1cm左右的根的壯苗即可進行栽培。
3.臺灣金線蓮苗與4種菌根真菌的共生栽培 共生栽培基質選用基質4，其中泥炭土、砂子和蛭石的加入量之間的比例按重量計為泥炭土∶砂子∶蛭石＝2∶1∶3。采用立體遮陽的方法進行栽培。在木質托盤的基部平鋪一層4-6cm厚的共生栽培基質，栽培時以3株臺灣金線蓮苗為一叢進行栽培，先在臺灣金線蓮苗根的基部放置1.5g左右的濕的碎樹葉，再在臺灣金線蓮苗根部放置以上備好的4種固體培養的菌根真菌的混合物1.5g左右，使臺灣金線蓮的根與菌根真菌接觸，最后用栽培基質埋住石斛苗的根部。苗叢栽培的株、行距為10cm。
在露天搭架，分層放置木質托盤，并架設遮陽網，避免直射光，光照量為正常日光量的1/3左右，照度2000-5000Lux，最忌夏秋中午前后的直射光，每天光照9-11h。金線蓮適宜的環境溫度為18-25℃，其空氣溫度夏天應控制在25℃以下，冬天應控制在18℃以上。金線蓮生長需較高的空氣濕度，但栽培基質中不宜積水。
臺灣金線蓮苗與4種菌根真菌共生栽培后，每隔3個月補施一次液體培養或固體培養的菌根真菌。4種菌根真菌可任選1種單獨用，也可以任意選擇兩種或兩種以上混合使用。臺灣金線蓮栽培后10個月收獲，收獲時剪取地上部分，留幼小苗或芽，陰干。
比較例 1.菌根真菌對金線蓮苗的促生長效果 將蘭小菇MO-2和開唇蘭小菇MA-1分別用液體培養基搖床震蕩暗培養15天。液體培養基組成按重量百分含量計算為葡萄糖2％，磷酸二氫鉀0.25％，硫酸鎂0.15％，麥麩2％(煮汁)。培養基pH 5.6。將2種菌根真菌的液體培養物分別用勻漿機打碎，備用。
由福建金線蓮和臺灣金線蓮的莖段分化的金線蓮苗，分別在壯苗生根培養基上培養90天。壯苗生根培養的培養基是以MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖30g·，肌醇100mg，NAA 2mg，IBA 1mg，活性炭2g，瓊脂10g。培養基pH 6.0。100mL玻璃三角瓶裝量30mL。培養條件為23-26℃光照培養90天，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。選取金線蓮苗的直徑在0.15-0.2cm，株高5-7cm，具有4-6片葉，2-4條根的壯苗進行實驗。
在共生栽培基質1上，用福建金線蓮苗和臺灣金線蓮苗分別與2種液體培養的菌根真菌進行共生栽培，考察菌根真菌對金線蓮生長的影響。以不加菌根真菌栽培的福建金線蓮苗和臺灣金線蓮苗的生長情況作為對照。共生栽培在玻璃溫室中進行。基質1中蛭石和砂子的加入量之間的比例按重量計為蛭石∶砂子＝2∶1。
在溫室鋪一層10-12cm厚的共生栽培基質，栽培時均以3株金線蓮苗為一叢進行栽培。先在金線蓮苗根的基部放置1.5g左右的濕的碎樹葉，再分別在金線蓮苗根部放置以上備好的4種菌根真菌液體培養物，每種1.5ml左右，使金線蓮苗的根與菌根真菌接觸，最后用栽培基質埋住石斛苗的根部。對照則用栽培基質埋住金線蓮苗的根部直接栽培即可。苗叢栽培的株、行距為10cm。
玻璃溫室的環境溫度控制在18-25℃，其空氣溫度夏天應控制在25℃以下，冬天應控制在18℃以上。溫室內要有遮陽網，避免直射光，光照量為正常日光量的1/3左右，照度2000-500Lux，最忌夏秋中午前后的直射光，每天光照9-11h。金線蓮生長需較高的空氣濕度，但栽培基質中不宜積水。
金線蓮苗栽培后6個月收獲，收獲時一次性連根取出，洗凈栽培基質，測量并記錄金線蓮地上部分高度。將收獲的金線蓮于55℃干燥，稱量干重。統計分析結果表明，與未接菌的對照福建金線蓮苗相比，與MO-2共生栽培的福建金線蓮苗的地上部分高度增加了36％，干重增加了17％；與MA-1共生栽培的福建金線蓮苗的地上部分高度增加了43％，干重增加了25％。與未接菌的對照臺灣金線蓮苗相比，與MO-2共生栽培的臺灣金線蓮苗的地上部分高度增加了54％，干重增加了32％；與MA-1共生栽培的臺灣金線蓮苗的地上部分高度增加了63％，干重增加了42％。以上結果說明這2種菌根真菌都能促進金線蓮苗的生長。
2.菌根真菌對金線蓮苗有效成分含量的影響 將石斛小菇MD-1和開唇蘭小菇MA-1分別用液體培養基搖床震蕩暗培養12天。液體培養基組成按重量百分含量計算為葡萄糖2％，磷酸二氫鉀0.3％，硫酸鎂0.15％，麥麩3％(煮汁)。培養基pH 5.9，將MD-1和MA-1真菌的液體培養物等量混合，用勻漿機打碎，備用。
由福建金線蓮的莖段分化的金線蓮苗，在壯苗生根培養基上培養90天。壯苗生根培養是以MS培養基為基本培養基，每升(L)培養基加入蔗糖30g，肌醇100mg，NAA 2mg，IBA1mg，活性炭2g，瓊脂9g。培養基pH 5.8。100mL玻璃三角瓶裝量30mL。培養條件為23-26℃光照培養90天，光照強度3000Lux，光照時間10小時/天。選取苗的直徑在0.15-0.2cm，株高5-7cm，具有4-6片葉，2-4條根的福建金線蓮的壯苗進行實驗。
在共生栽培基質3上，用福建金線蓮苗MD-1和MA-1的液體培養混合物進行共生栽培，考察菌根真菌對福建金線蓮苗中有效成分含量的影響。以不加菌根真菌栽培的福建金線蓮苗的生長情況作為對照。共生栽培在玻璃溫室中進行。基質3中泥炭土和砂子的加入量之間的比例按重量計為泥炭土∶砂子＝5∶2。
在溫室鋪一層10-12cm厚的共生栽培基質，栽培時均以3株金線蓮苗為一叢進行栽培。先在金線蓮苗根的基部放置1.5g左右的濕的碎樹葉，再在金線蓮苗根部放置以上備好的2種菌根真菌的液體培養物的混合物1.5ml左右，使金線蓮苗的根與菌根真菌接觸，最后用栽培基質埋住石斛苗的根部。對照則用栽培基質埋住金線蓮苗的根部直接栽培即可。叢苗栽培的株、行距為10cm。
玻璃溫室的環境溫度控制在18-25℃，其空氣溫度夏天應控制在25℃以下，冬天應控制在18℃以上。溫室內要有遮陽網，避免直射光，光照量為正常日光量的1/3左右，照度2000-500Lux，最忌夏秋中午前后的直射光，每天光照9-11h。金線蓮生長需較高的空氣濕度，但栽培基質中不宜積水。
金線蓮苗栽培后6個月收獲，收獲時一次性連根取出，洗凈栽培基質，于55℃干燥。同時將野生福建金線蓮也在55℃干燥。將干燥的福建金線蓮(包括野生福建金線蓮，加菌人工栽培的福建金線蓮和不加菌人工栽培的福建金線蓮)用甲醇提取，用HPLC方法分析比較了福建金線蓮中黃酮類化合物的含量。實驗結果表明，與不接菌根真菌栽培的福建金線蓮苗(對照)相比，菌根真菌使福建金線蓮苗中黃酮類活性成分的含量顯著提高。與菌根真菌共生栽培的福建金線蓮中9種黃酮含量之和為0.1735％，而未加菌栽培的福建金線蓮中9種黃酮含量之和為0.1135％，野生福建金線蓮中9種黃酮含量之和為0.1296％。此外，與不接菌根真菌栽培的福建金線蓮苗(對照)相比，加菌人工栽培的福建金線蓮苗中多糖類成分的含量提高了59％，硼、鈷、錳、銅、鐵、鋅等微量元素的含量也有所提高。
從上述比較例可以看出，小菇屬的4種菌根真菌對金線蓮的生長發育均有明顯促進作用。采用該項新技術，金線蓮的生長周期可以由傳統栽培的12-18個月縮短到6-10個月，產量提高20-40％。與不接菌根真菌栽培的金線蓮苗(對照)相比，該技術可以提高金線蓮中黃酮和多糖等有效成分的含量，提高微量元素的含量，從而保證了人工栽培金線蓮的藥材質量，為菌根真菌應用于金線蓮規范化栽培提供了科學依據。另外，該項技術栽培方法簡單、投資少、不施任何化學肥料和農藥，生產出的金線蓮為綠色產品。
權利要求
1.一種應用菌根真菌大面積栽培金線蓮的方法，包括步驟
(1)菌根真菌的發酵培養
將4種菌根真菌MD-1，MO-1，MO-2，MA-1自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，分別轉接于含PDA培養基的平皿中，于22-28℃恒溫培養10-20天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養基中進行發酵培養；
由平皿固體菌種轉接液體培養的MD-1，MO-1，MO-2和MA-1真菌可以直接使用，也可以作為種子菌種，種子菌種再進一步接入液體或固體培養基進行放大培養；
真菌液體培養的培養基含有葡萄糖、無機鹽類成分和天然添加物，真菌用三角瓶或其他容器振蕩或發酵罐通氣暗培養，培養結束后可直接使用或用勻漿機打碎培養產物備用；
真菌固體培養的培養基含有天然纖維性或淀粉性物質，真菌用試管、玻璃罐頭瓶或塑料袋等器皿靜置暗培養，待菌絲大部分或全部長滿培養基時取出備用；
(2)金線蓮苗的培養
金線蓮帶有節的莖段經過金線蓮芽分化、金線蓮叢芽增殖、壯苗生根培養等步驟的培養，用玻璃三角瓶或玻璃罐頭瓶等器皿靜置光照培養，培育成苗；經壯苗生根培養后的金線蓮苗可以在繼代培養基上繼代培養；
金線蓮芽增殖、金線蓮叢芽增殖、壯苗生根等步驟所用的培養基是以MS培養基為基本培養基；苗的繼代培養所用的培養基是以1/2MS培養基為基本培養基；以上培養基都需要在基本培養基的基礎上添加蔗糖、肌醇、瓊脂，或添加活性炭，添加不同種類和濃度的植物激素，或添加馬鈴薯提取物；
(3)金線蓮苗與菌根真菌的共生栽培、田間管理和收獲
金線蓮苗與菌根真菌大面積共生栽培的栽培基質含有蛭石、泥炭土、腐殖土、砂子；
金線蓮苗和菌根真菌按以下方法共生栽培
①地上遮陽栽培在具有遮陽網的露天大棚，或塑料薄膜溫室，或玻璃溫室中進行栽培，栽培時先在金線蓮苗根的基部放置適量碎樹葉，再在金線蓮苗根部放置以上備好的液體或固體菌根真菌適量，最后用栽培基質埋住金線蓮苗的根部；
②立體遮陽栽培在地上搭架分層立體栽培，在硬質材料的盆或盒等容器的底部平鋪一層共生栽培基質，栽培時先在金線蓮苗根的基部放置適量碎樹葉，再在金線蓮苗根部放置以上備好的液體或固體菌根真菌適量，最后用栽培基質埋住金線蓮苗的根部；
在金線蓮生長的過程中可以根據需要補施液體或固體菌根真菌；
金線蓮苗出瓶后與菌根真菌共生栽培6-12個月后即可收獲。
2.如權利要求1所述的培養方法，其中所述的4種小菇屬真菌分別為石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)，保藏編號CGMCC No.0685，紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)，保藏編號CGMCC No.0689，蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)，保藏編號CGMCC No.0688，和開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)，保藏編號CGMCC No.0687。
3.如權利要求1和2所述的方法，其特征在于小菇屬4種菌根真菌液體培養的培養基中葡萄糖的加入量按重量計為1.5-4％；無機鹽類成分可以為硫酸鎂，磷酸二氫鉀，或磷酸氫二鉀，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀以任意比例混合的混合物，其加入量按重量計為硫酸鎂0.1-0.5％，磷酸二氫鉀0.1-0.5％，或磷酸氫二鉀0.1-0.5％，或磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以為麥麩(煮汁)，其加入量按重量計為2-5％；培養基pH5.0-6.5；三角瓶或其他容器振蕩培養或發酵罐通氣培養，培養容器裝量10-60％；培養基滅菌后接入上述4種小菇屬真菌，種子菌種接種量為培養容器裝量的5-20％；液體培養的培養條件為振蕩轉速80-150轉/分鐘，18-28℃暗培養10-30天；培養結束后可直接使用或用勻漿機打碎培養產物備用。
4.如權利要求1和2所述的方法，其特征在于小菇屬4種菌根真菌固體培養的培養基中天然纖維性或淀粉性物質可以為闊葉樹鋸末、麥麩和碎玉米粒，這3種原料加入量之間的比例按重量計為闊葉樹鋸末∶麥麩∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5；固體培養基的加水量為以上3種原料總重量的1-4倍；培養基pH5.0-6.5；試管、玻璃罐頭瓶或塑料袋等器皿靜置培養，培養容器裝量50-80％；培養基滅菌后接入液體培養的小菇屬真菌的種子菌種，種子菌種的接種量為培養容器裝量的5-15％；固體培養的培養條件為18-28℃暗培養，待菌絲從培養基頂部長入底部或長滿培養基時取出備用。
5.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于金線蓮苗的培養中，
(1)芽分化培養的培養基中添加的植物激素為6-芐基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，其加入量為每升(L)培養基加入6-BA0.5-3.0mg，NAA0.4-2.5mg；培養時間45-120天；
(2)叢芽增殖培養的培養基中添加的植物激素為6-BA、吲哚丁酸(IBA)和玉米素(ZT)，其加入量為每升(L)培養基加入6-BA0.5-3.0mg，IBA0.3-1.5mg，ZT0.05-0.3mg；培養時間45-120天；
(3)壯苗生根培養的培養基中添加的植物激素為NAA和IBA，其加入量為每升(L)培養基加入NAA0.5-3mg，IBA0.5-2mg；培養時間為45-120天；
(4)苗繼代培養的培養基中添加馬鈴薯(煮汁)的量為每升(L)培養基加入100-300g；培養時間45-90天。
6.如權利要求1所述的培養方法，其特征在于金線蓮芽分化、金線蓮叢芽增殖、壯苗生根和苗的繼代培養中，所用的每升(L)MS和1/2MS基本培養基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、瓊脂6-15g；壯苗生根和苗的繼代培養中，所用的每升(L)培養基中均要添加0.5-4g的活性炭；培養基pH5.0-6.5；用試管或玻璃瓶等器皿培養，培養容器裝量10-50％；苗的培養條件為15-26℃光照培養，光照強度1500-5000Lux，光照時間8-12小時/天。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于金線蓮苗與菌根真菌的共生栽培基質有以下幾種
(1)基質1中可以有蛭石和砂子，這2種材料加入量之間的比例按重量計為蛭石∶砂子＝4∶1-4；
(2)基質2中可以有腐殖土和砂子，這2種材料加入量之間的比例按重量計為腐殖土∶砂子＝6∶1-6；
(3)基質3中可以有泥炭土和砂子，這2種材料加入量之間的比例按重量計為泥炭土∶砂子＝5∶1-5；
(4)基質4中可以有泥炭土、砂子和蛭石，這3種材料加入量之間的比例按重量計為泥炭土∶砂子∶蛭石＝1-4∶1∶2-4；
(5)基質5可以是腐殖土；
栽培中還要用到山毛櫸科Fagaceae植物櫟樹或其他雜木樹的自然落葉，用時粉碎并浸濕，碎樹葉直徑0.5-2cm；
上述栽培基質中用到的腐殖土可以直接使用，或高溫滅菌，或提前兩個月鋪好使其熟化，或堆積并蓋塑料布發酵1-2個月，使其熟化以消除病蟲害。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于金線蓮苗與菌根真菌共生栽培時，以2-5株金線蓮苗為一叢進行栽培，先在每叢金線蓮苗根的基部放置0.5-5g濕的碎樹葉，再在每叢金線蓮苗的根部放置上述制備好的菌根真菌液體培養物0.4-2.5ml，或菌根真菌固體培養物0.3-2.0g，最后用栽培基質壓住苗的根部；叢苗栽培的株、行距為8-18cm；
采用地上遮陽栽培的方法進行金線蓮苗與菌根真菌共生栽培時，栽培基質厚度5-20cm，
采用立體遮陽栽培的方法進行金線蓮苗與菌根真菌共生栽培時，栽培基質厚度3-10cm；
金線蓮苗與菌根真菌共生栽培后需要的生長條件環境溫度為5-30℃，光照量為正常日光量的1/3或1/2，或照度為2000-10000Lux；在金線蓮與菌根真菌共生的過程中每年可以補施液體培養或固體培養的菌根真菌0-5次；
與菌根真菌共生栽培的金線蓮，在上述栽培條件下生長6-12個月可以收獲，收獲時可剪取地上部分，留幼小苗或芽，也可一次性連根取出洗凈栽培基質；陰干或60℃以下烘干。
9.如權利要求1-8所述的方法，其特征在于4種菌根真菌的液體培養物或固體培養物，在用于與金線蓮的共生栽培時，可以單獨使用，或分別培養后任意選擇兩種或兩種以上共同使用。
10.用于任一權利要求1-9所述方法的菌根真菌為小菇屬真菌石斛小菇MD-1(Mycenadendrobii)，保藏編號CGMCC No.0685，紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)，保藏編號CGMCC No.0689，蘭小菇MO-2(Mycena orchidicola)，保藏編號CGMCC No.0688，和開唇蘭小菇MA-1(Mycena anoectochila)，保藏編號CGMCC No.0687。
全文摘要
一種菌根真菌在金線蓮大面積栽培中的應用技術，所用的4種菌根真菌為小菇屬真菌石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycena osmundicola)，蘭小菇(Mycena orchidicola)，開唇蘭小菇(Mycena anoectochila)；先分別培養菌根真菌和金線蓮苗，當金線蓮苗移栽到大田時，加入菌根真菌與金線蓮苗共同栽培。采用該項新技術，可大大縮短金線蓮的生長周期，提高金線蓮產量和有效成分含量。該項技術栽培方法簡單、易于大面積推廣、投資少、不施任何化學肥料、激素和農藥，生產出的金線蓮為綠色產品。
文檔編號C12N1/14GK1961651SQ20051011770
公開日2007年5月16日 申請日期2005年11月7日 優先權日2005年11月7日
發明者郭順星, 于雪梅, 高微微, 陳曉梅, 王春蘭, 孟志霞, 肖培根 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所