專利名稱：滾環復制技術(rca)檢測rna病毒基因的制作方法
技術領域：
本發明是滾環復制技術(RCA方法)及其衍生的酶聯滾環復制技術用于RNA病毒檢測。用于RNA病毒在各種生物制品、、獻血者、病人血液標本等的監測。應用范圍包括人用，獸用及其它生物防御用。
背景技術：
滾環復制原理即滾環放大(Rolling Circle Amplification，RCA)是基于這種復制方式可在同溫下對環狀單鏈DNA序列進行相對無限單鏈擴增的特點，所以被成功運用于單核苷酸多態性(SNP)、病毒基因的分型、基因表達圖譜、芯片技術以及基因測序等一系列研究中。普通的RCA技術的原理是首先設計一種探針，這種探針的每個末端包含15-20個可與靶序列互補的核苷酸。當這些序列與靶序列結合后，再通過連接酶將之連接為環狀，像一把掛鎖“鎖”在檢測基因的靶位上。所以有些研究者也將可環化探針形象地稱為掛鎖探針或環形探針[6]。這個環化后的探針就可通過引物進行滾環復制和支鏈擴增(RamificationRolling Circle Amplification)。反之，若靶序列上存在變異或沒有所要檢測的目的基因，探針無法被連接成環狀，復制也就無法進行。
從RCA的原理和特點不難看出，該方法在RNA病毒的檢測方面應該有著傳統基因診斷方法無法比擬的優勢，與一些常規的檢測手段相比，它具有安全、特異、靈敏、便捷的優勢。這主要體現在以下幾個方面。首先，RCA檢測方法中所擴增的基因并不是病毒的原基因序列而是探針序列，病毒基因只是提供了一個探針環化的互補支架，保證了擴增的安全性和特異性；第二，該方法省去了RNA向cDNA反轉錄的過程，提高了檢測的敏感性。第三，所有的擴增過程都可在同溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬件的要求。第四，較RT-PCR縮短了檢測所需的時間。
酶聯滾環復制技術是一種結合滾環復制原理和酶聯免疫吸附技術用于檢測各種病源基因的新型檢測技術平臺。在此項技術中原理是探針與靶序列雜交后便可在T4DNA連接酶的作用下形成滾環復制中的環化單鏈分子，該分子在同溫下可被特異性引物滾動復制和支鏈擴增，形成最終的雙鏈核酸產物。該雙鏈可通過一條引物上預先用生物素標記的生物素與酶標板上包被的鏈酶親和素結合，而在另一條引物上預先標記了地高辛，因此當呈現陽性反應時地高辛就間接的被固化到酶標板上，再通過抗地高辛的酶標抗體進行顏色反應。酶聯RCA技術通過在核酸上的標記物與該標記物的酶聯抗體有效地將陽性結果以顏色反應的形式呈現出來，并可用酶標儀將這種結果進行量化。從而省略了滾環復制技術中核酸電泳的步驟，減小了污染和結果判斷的難度。
發明內容
1.本發明是對目前對RNA病毒檢測技術手段的改進和補充，它具有安全、特異、靈敏、便捷的優勢。這主要體現在以下幾個方面。首先，RCA檢測方法中所擴增的基因并不是病毒的原基因序列而是探針序列，病毒基因只是提供了一個探針環化的互補支架，保證了擴增的安全性和特異性；第二，該方法省去了RNA向cDNA反轉錄的過程，提高了檢測的敏感性。第三，所有的擴增過程都可在同溫下完成，無需PCR儀，降低了對實驗硬件的要求。第四，較RT-PCR縮短了檢測所需的時間。
2.通過Blast程序選擇了SARS病毒、丙型肝炎病毒和禽流感病毒基因的相對保守區，按照探針設計的普通原則借助Oligo程序，分別設計了對應于保守區序列的捕獲探針、環形探針和相應的引物。所有探針、引物和模式DNA分子的具體序列見表1。
3.建立了如下的檢測過程，詳見如下(1)合成探針使用上海生工生物技術公司合成儀合成。
(2)探針處理5’端進行磷酸化或生物素或地高辛標記，由上海生工生物技術公司完成。
(3)將待測標本按Qiagen公司的病毒RNA提取試劑盒步驟處理，獲得樣本的RNA。
(4)分子雜交反應。
(5)連接和擴增反應(6)電泳檢測
具體實施例方式
實施方案1禽流感病毒HA5基因區的檢測在33μl雜交緩沖液中依次加入5μlRNA樣品、1μl環形探針(HA-C-probe，1012個分子)、1μl相應的捕獲探針(Capture-HA-1、Capture-HA-2，各1012個分子[5，8])，在50℃水浴雜交1小時，緩慢冷卻至室溫。加入40μl鏈霉親和素包被的磁珠(溶于2×結合緩沖液中)，混勻，室溫放置20分鐘，磁性分離。用1×結合緩沖液清洗磁珠2次，棄盡洗液，按15μl連接體系分別加入1.5μl 10×連接酶緩沖液、1μl連接酶(400U)、12.5μl水，37℃，1小時。直接加入3μl 10×exo-Bst DNA擴增緩沖液，1μl exo-Bst聚合酶，1μl dNTP(2.5mM)，各1μl引物(HA-P1、HA-P2)，8μl水，65℃水浴，擴增90分鐘。擴增產物行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。同時設立陰性對照，陰性對照組除用水替代RNA外其它反應組份及程序均相同。
實施方案2禽流感病毒NA1基因區的檢測方法與HA5基因區的檢測相同，使用的探針和引物分別為捕獲探針Capture-NA-1和Capture-NA-2，環形探針NA-C-probe，引物NA-P1和NA-P2。
實施方案3丙型肝炎病毒基因的檢測方法與HA5基因區的檢測相同，使用的探針和引物分別為捕獲探針Capture-HCV-1和Capture-HCV-2，環形探針HCV-C-probe，引物HCV-P1和HCV-P2。
實施方案4SARS病毒基因的檢測方法與HA5基因區的檢測相同，使用的探針和引物分別為捕獲探針Capture-SARS-1和Capture-SARS-2，環形探針SARS-C-probe，引物SARS-P1和SARS-P2。
實施方案5酶聯滾環復制技術檢測RNA病毒(1)用鏈酶親和素包被酶標板以5μg/ml的包被濃度在酶標板上包被鏈酶親和素，每孔加入100μl，4℃過夜，排干酶標板，待用。
(2)環形探針和捕捉探針與被測RNA的雜交和連接按照以下反應體系進行雜交和連接反應
37℃水浴放置1小時，補加35μl水加入酶標板，37℃繼續放置40分鐘。取出酶標板，甩盡板中液體，加入擴增反應液。
(3)恒溫擴增按照以下反應體系進行擴增反應
65℃放置1小時進行連接環的擴增。同時，標記了生物素的引物鏈與酶標板上包被的鏈酶親和素結合。取出酶標板，用標準PBST洗液洗板3次，排干酶標板。
(4)擴增產物與酶標抗地高辛抗體的結合在酶標板中加入100μl過氧化物酶標記的抗地高辛抗體(工作濃度由預實驗確定)，37℃放置40分鐘，洗板3次(洗液同上)，拍盡板中液體。
(5)顯色，讀值在酶標板中加入過氧化物酶的顯色底物，37℃放置3至5分鐘，顯色完成后加入終止液(1N硫酸)終止反應。在酶標儀中檢測顏色信號(波長450nm)，讀值。
實施方案6臨床標本的監測結果對收集于病毒病預防控制所流感室、流行病研究所和武漢協和醫院20例病人血清臨床標本進行檢測，H5N1，HCV和SARS病毒的陽性檢測結果與常規RT-PCR方法完全一致，說明檢測的結果是滿意的。
表1探針和引物序列Table 1 Nucleotide sequences of the probes and primers
權利要求
1.一種用于RNA病毒檢測的滾環復制技術(RCA方法)及其衍生的酶聯滾環復制技術，其中包括H5N1、HCV和SARS病毒檢測的寡核苷酸探針和對照探針。
2.權力要求1所述的RNA病毒檢測RCA方法及其衍生的酶聯滾環復制技術的探針包括
圖1所列的基因序列及其衍生探針及每種探針的互補探針或變體。
3.權力要求1所述的RNA病毒檢測RCA方法及其衍生的酶聯滾環復制技術包括如下病毒及其變異株丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)，人免疫缺陷性病毒(Human Immunodeficiency virus，HIV)和禽流感病毒H5N1及其它的流感病毒亞型等。
4.權力要求1所述的RNA病毒檢測RCA方法及其衍生的酶聯滾環復制技術，其介質為液相或鏈酶親和素包被的磁珠固相。
5.權力要求1所述的RNA病毒檢測的滾環復制技術(RCA方法)及其衍生的酶聯滾環復制技術應用范圍包括H5N1、HCV和SARS病毒和其它RNA病毒。
6.權力要求5所述的本發明的應用范圍包括人用，獸用及其它生物防御用。
7.權力要求1所述的RNA病毒檢測的滾環復制技術(RCA方法)及其衍生的酶聯滾環復制技術的反應程序和檢測程序。
全文摘要
本發明屬于生物技術應用領域，涉及人類醫學及獸醫，包括RNA病毒在各種生物制品、獻血員、病人血液標本等的監測。具體應用滾環復制技術(RCA方法)及其衍生的酶聯滾環復制技術，通過生物學計算分析設計病毒保守和病毒特異性基因序列探針，分子雜交反應。連接和擴增反應，用電泳或酶標抗體進行顏色反應來檢測，與傳統的RT－PCR方法比較，它具有更安全、特異、靈敏、便捷的優勢。
文檔編號C12Q1/68GK1955308SQ200510114349
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月24日 優先權日2005年10月24日
發明者馬學軍, 李啟明, 侯云德 申請人:北京金迪克生物技術研究所