磷酸二酯酶8a的制作方法

專利名稱：磷酸二酯酶8a的制作方法
技術領域：
總的來說，本發明涉及命名為PDE8A的磷酸二酯酶的一個家族以及其應用。
背景技術：
磷酸二酯酶(PDEs)水解3′，5′環核苷酸生成它們各自的5′單磷酸核苷酸。環核苷酸cAMP和cGMP分別由腺苷酰和鳥苷酰環化酶合成，并作為許多細胞信號通路中的第二信使。第二信使信號的持續時間和強度是環核苷酸合成速率和分解速率的函數。
已鑒定了PDEs的各個家族。命名系統包括表示PDE家族的第一個數。到目前為止，已知7個家族(PDE1-7)，它們通過(i)一級結構；(ii)底物優選性；(iii)對不同調節劑的反應，(iv)對特異抑制劑的敏感性；和(v)調節方式來分類[Loughney和Ferguson，關于磷酸二酯酶抑制劑，Schudt，等(編輯)，學術出版社紐約，紐約(1996)pp.1-19]。表示家族的數后面是表示不同基因的大寫字母，大寫字母后面的第二個數，表示特異剪接變異體或使用獨特轉錄起始位點的特異轉錄子。
到目前已鑒定的所有哺乳PDEs的氨基酸序列。包括位于蛋白羧基端一半的大約270個氨基酸的高度保守區域[Charbonneau等，美國國家科學院院刊(美國)839308-9312(1986)]。保守結構域包括cAMP和/或cGMP水解的催化位點和兩個推定的鋅結合位點以及家族特異的決定簇[Beavo，生理評論75725-748(1995)；Francis等，生物化學雜志26922477-22480(1994)]。各種PDEs的氨基端區域是高度可變的，包括其它家族特異決定簇例如(i)鈣調蛋白結合位點(PDE1)；(ii)非催化環GMP結合位點(PDE2、PDE5、PDE6)；(iii)膜靶向位點(PDE4)；(iv)疏水的膜相關位點(PDE3)；和(v)對鈣調蛋白-依賴的激酶II(PDE1)、cAMP-依賴的激酶(PDE1、PDE3、PDE4)或者cGMP依賴的激酶(PDE5)的磷酸化位點[Beavo，生理評論75725-748(1995)；Manganiello等Arch.Biochem.Acta 3221-13(1995)；Conti等，生理評論75723-748(1995)]。
鈣-鈣調蛋白可以激活PDE1家族的許多成員。已鑒定三個基因PDE1A和PPE1B優選水解cGMP而PDE1C已表明對cAMP和cGMP都有高度親和力。PDE2家庭特征是可以特異地由cGMP活化[Loughney和Ferguson，同上]。已經鑒定只有一個基因，PDE2A，其酶產物可以由紅-9-(2-羥基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)特異抑制。PDE3家族中的酶類被cGMP特異性抑制。已知兩個基因，PDE3A和PDE3B，對cAMP和cGMP都有高度親和力，盡管對cGMP水解的Vmax足夠低，以至cGMP作為cAMP水解的競爭抑制劑。甲氰吡酮和依諾西酮 特異抑制PDE3酶[Loughney和Ferguson，同上]。PDE4家族影響cAMP水解，并包括4個基因，PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D，每一個都有多個剪接變異體。抗-抑郁的藥環戊氧基甲氧苯基吡咯烷酮特異抑制這個家族的成員。PDE5家族的成員在非催化位點結合cGMP，并優先水解cGMP。只有一個基因，PDE5A得到鑒定。光感受器PDE6酶特異水解cGMP[Loughney和Ferguson，同上]。除了伴有三個較小蛋白以形成錐部的PDE的PDE6C，基因包括PDE6A和PDE6B(其蛋白產物二聚體化并結合兩拷貝的較小γ抑制亞單位以形成桿部的PDE。PDE7家族影響cAMP水解，但與PDE4家族相比較，不受環戊氧基甲氧苯基吡咯烷酮抑制[Loughney和Ferguson，同上]。只有一個基因，PDE7A，已得到鑒定。
已知cAMP和cGMP在細胞內第二信使信號中的重要性，因而本領域存在持續的需要以鑒定另外的PDE種類。至今PDEs未知家族以及其基因和剪接變異體的鑒定將提供另外的藥理學途徑，以治療環核苷酸途徑異常的病態以及在某些細胞類型中想要調節細胞內cAMP和/或cGMP水平的病態。
發明簡述簡而言之，本發明提供命名為PDE8的新PDE家族的多肽和其多核苷酸。本發明包括自然發生的和非自然發生的PDE8多核苷酸和其多肽產物。自然發生的PDE8產物包括PDE8家族內的不同基因和多肽的種類(即PDE8A)；這些種類包括在相同動物細胞內表達的以及在其它動物細胞內表達的對應種的同系物。在每一個PDE8種類中，發明進一步提供由相同多核苷酸編碼的剪接變異體，但它們產生于不同的mRNA轉錄子(即PDE8A1和PDE8A2)。非自然發生的PDE8產物包括自然發生產物的變異體如類似物(即其中一個或更多個的氨基酸得到添加、置換或刪除)以及包括共價修飾(即融合蛋白、糖基化變異體、Met-1PDE8s、Met-2Lys-1-PDE8s、Gly-1PDE8s等等)的那些PDE8產物。PDE8家族不同于以前已知的PDE家族，對cAMP和cFMP的水解都表現高親和，但對其它家族特異的酶抑制劑有相對低的敏感性。在優選的實施方案中，本發明提供了包含如SEQ ID NO1中所陳述序列的多核苷酸。本發明也包括編碼如SEQ ID NO2中所陳述氨基酸序列的多核苷酸。本發明目前優選的多肽包括如SEQ ID NO2中所陳述的氨基酸序列。本發明提供兩個剪接變異體cDNA，它產生兩個命名為PDE8A1和PDE8A2的多肽。PDE8A1和PDE8A2多肽以及編碼多肽的多核苷酸，在此處作為本發明所包括的PDE8酶家族的代表討論。
本發明提供編碼人PDE8s的新純化和分離的多核苷酸(如DNA序列和包括其剪接變異體的RNA轉錄子、正義和互補反義鏈)。本發明的DNA序列包括基因組和cDNA序列以及全部或部分化學合成的DNA序列。如此處所用的“合成的”，在本領域理解為是指與酶學方法相反的用于合成多核苷酸的純化學方法。“全部”合成的DNA序列因而完全由化學方法合成，而“部分”合成的DNAs包括那些其中只有部分DNA由化學方法合成。編碼人PDE8多肽的優選DNA序列如SEQ IDNO1中所陳述。也優選的是編碼SEQ ID NO2的PDE8多肽的多核苷酸以及SEQ ID NOS6和4中分別陳述的PDE8A1和PDE8A2的剪接變異體多肽。編碼PDE8A1和PDE8A2的優選多核苷酸，分另在SEQ ID NOs5和3中陳述。本發明進一步包括種，優選人PDE8 DNA的哺乳類同系物。
本發明也包括在適度嚴格條件下與SEQ ID NOs1、3和5中多核苷酸的非編碼鏈或互補雜交的編碼PDE8種的DNA序列。本發明考慮能雜交但遺傳密碼多余的編碼PDE8A多肽的DNA序列。典型的適度雜交條件如下在65℃、3×SSC、0.1％肌氨酰和20mM磷酸鈉pH6.8中雜交，并在65℃帶有0.1％SDS的2×SSC中洗滌。在本領域中應該理解通過如Ausebel等(主編)，分子生物學方法，John Wiley &Sons(1994)；PP.6.0.3至6.4.1 0所描述的改變溫度和緩中液或鹽濃度可以取得同嚴格的條件。
根據探針鳥嘌呤/胞嘧啶(GC)堿基對的長度和百分率可以經驗確定或精確計算修約雜交條件中。如Sambrook等(主編)，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社冷泉港，紐約(1989)，pp.9.47至9.51所描述的可以計算雜交條件。
也提供自動復制重組表達構建物如帶有PDE8序列的質粒和病毒DNA載體。也提供表達構建物，其中PDE8-編碼多核苷酸與內源或外源表達控制DNA序列和轉錄終止子可操作性連接。
根據本發明的另一方面，也提供宿主細胞，包括用本發明的DNA序列以允許本發明PDE8多肽，穩定或瞬時轉化表達的方式的原核和真核細胞。本發明的宿主細胞是免疫原有價值的來源用于發展特異地與PDE8免疫反應的抗體。本發明的宿主細胞在大量合成PDE8多肽的方法中也明顯是有用的，其中細胞生長在合適的培養基中，所要的多肽產物從細胞或從細胞生長的培養基中通過例如免疫親和純化來分離。
PDE8 DNA序列的知識允許修飾細胞從允許或增加內源PDE8的表達。通過用全部或部分異源啟動子全部或部分置換自然發生的PDE8啟動子修飾細胞(如通過同源重組)以提供增高的PDE8表達，以便細胞在高水平表達PDE8。異源啟動子以此方式插入以便它與PDE8編碼序列可操作連接。見例如PCT國際申請號WO 94/12650、PCT國際申請號WO 92/20808和PCT國際申請號91/0995 5。本發明也考慮除了異源啟動子DNA之外，可擴增的標記DNA(如編碼磷酸甲氨酰合成酶、天冬氨酸轉氨甲酰酶和氨甲酰天冬氨酸脫水酶的ada、dhfr和多功能CAD基因)和/或內含子DNA也可以與異源啟動子DNA一起插入。如果與PDE8編碼序列連接在一起，通過標準選擇方法的標記DNA的擴增會在細胞中產生PDE8編碼序列的共擴增。
本發明提供的DNA序列信息也使得通過如同源重組或“敲除”策略[Capecchi，科學2441288-1292(1989)]發展成為可能，該策略是得到不能表達功能PDE8或表達PDE8變異體的動物。這樣的動物作為研究PDE8體內活性和PDE8調節劑的模型是有用的。
本發明也提供純化的和分離的哺乳類PDE8多肽。目前優選的PDE8A多肽陳述于SEQ ID NOs4和6中。最優選的是含有陳述于SEQ ID NO2中的氨基酸序列的PDE8多肽。本發明的PDE8多肽可以從天然細胞來源中分離或化學合成，但優選通過包括本發明宿主細胞的重組方法來合成。哺乳類宿主細胞的使用期望提供這些翻譯后修飾(如糖基化、截短、脂質化和磷酸化)，需要這些修飾以便對本發明的重組表達產物賦于最佳生物活性。本發明的PDE8產物可以是全長多肽、生物活性片段或保留特異的PDE8生物活性的其變異體。變異體可以包括PDE8多肽類似物，其中刪除或置換一個或多個特異的(即自然編碼)的氨基酸，或者其中加入一個或多個非特異的氨基酸(1)不丟失對PDE8特異的一個或多個生物活性或免疫特征；或者(2)PDE特定生物活性的特異殘失。
本發明的變異體產物包括成熟的PDE8A產物，即其中去除前導或信號序列的PDE8產物，具有附加的氨基端殘基。考慮在-1位具有附加甲硫氨酸殘基的PDE8產物(Met-1-PDE8)，以及在-2和-1位具有附加的甲硫氨酸和賴氨酸的PDE8產物(Met-2-Lys-1-PDE8)。這些類型的變異體，對在細菌細胞類型中重組蛋白合成尤其有用。
本發明也包括具有附加氨基酸殘基的PDE8變異體，這些氨基酸殘基產生于特異表達系統。例如使用商業可獲得載體表達所需要多肽如谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合產物的所需多肽，該多肽在-1位具有附加甘氨酸殘基，結果能從所需多肽上切除GST成分。也考慮在其它載體系統中表達所產生的變異體。
本發明進一步包括修飾以包括一個或多個水溶多聚體附著物的PDE8產物。尤其優選的是和具有聚乙二醇(PEG)亞單位共價修飾的PDE8產物。水溶多聚體可以在特定位置如PDE8產物的氨基末端鍵合，或隨機附著在多肽的一個或多個側鏈上。
本發明也包括抗體(如單克隆和多克隆抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、CDR-移植抗體等等)和對PDE8產物或其片段特異的其它結合蛋白。使用分離或重組的PDE8產物、PDE8變異體或表達這些產物的細胞發展特異結合蛋白。使用已知的免疫方法，結合蛋白對純化PDE8產物和在流體和組織樣品中檢測或定量PDE8產物是有用的。結合蛋白在調節(即阻斷、抑制或激活)PDE8的生物活性，尤其是參與信號轉導的那些活性是明顯有用的。也考慮對抗-PDE8抗體特異的抗-獨特型抗體。
通過本發明DNA和氨基酸序列的披露所貢獻的信息的科學價值是明顯的。鑒于一系列的實施例，PED8A cDNA序列的了解使得通過使用Southern雜交或聚合酶鏈反應(PCR)鑒定編碼PDE8以及PDE8表達控制調節序列如啟動子、操縱子、增強子、抑制子等等的基因組DNA序列成為可能。在適度至高度嚴格的條件下用本發明的DNA序列進行的DNA/DNA雜交過程也預期允許分離編碼PDE8A等位變異體的DNAs，本領域已知等位變異體包括對PDE8A特異的一個或多個生物和/或免疫特性的結構相關蛋白。相似地，編碼與PDE8A同源蛋白的非人類種基因，也可以通過Southern和/或PCR分析得到鑒定。因為一個可選擇的、互補研究對鑒定其它人PDE8產物以及享有一個或多個PDE8A生物特性的非人類蛋白和編碼蛋白的DNA是有用。
本發明的多核苷酸，在用以檢測細胞表達PDE8能力的雜交實驗中也是有用的。本發明的多核苷酸也是用于鑒定PDE8位點中遺傳改變的診斷方法的基礎，而PDE8位點中遺傳改變是造成疾病狀態的根本原因。
本發明也可以得到的是識別并與編碼PDE8的多核苷酸雜交的反義多核苷酸。提供全長和片段反義多核苷酸。反義多核苷酸通過表達PDE8mRNA的那些細胞對調節PDE8的表達尤其相關。
本發明提供的DNA和氨基酸序列信息也使得系統分析PDE8s的結構和功能成為可能。 PDE8的DNA和氨基酸序列信息也允許鑒定與PDE8A相互作用的分子。通過將推定的調節劑與PDE8溫育并確定推定調節劑對PDE8磷酸二酯酶活性的影響可以鑒定調節(即增加、降低或阻斷)PDE8活性的藥劑。通過將它對PDE8的活性與它對其它PDE酶活性相比較，可以評估調節PDE8活性的化合物的選擇性。本發明考慮以細胞為基礎的方法，如雙雜交實驗和斷裂雜交實驗以及體外方法，包括固定多肽或它的結合伙伴的實驗和溶液實驗。
選擇性調節劑可以包括如抗體和其它與PDE8或PDE8核酸特異結合的蛋白或肽、與PDE8或PDE8核酸特異結合的寡核苷酸、以及與PDE8或編碼PDE8的核酸特異反應的其它非肽化合物(如分離的或合成的有機分子)。本發明也考慮影響野生型PDE8酶活性或細胞定位的PDE8突變形式。目前用于發展選擇性調節劑的優選目標包括(1)和其它蛋白聯系和/或細胞內定位PDE8的PDE8區域，(2)結合底物的PDE8區域，(3)PDE8的變構環核苷酸結合位點，(4)PDE8的磷酸化位點和(5)參與PDE8亞單位多聚化的PDE8區域。PDE8活性的調節劑對治療已知PDE活性參與的廣泛的疾病和生理狀態是治療上有用的。
本發明進一步考慮PDE8A酶活性的小分子調節劑。至少有三種不同類型的文庫用以鑒定小分子調節劑。這包括(1)化學制劑文庫、(2)天然產物文庫和(3)包含隨機肽、寡核苷酸或有機分子的組合文庫。
化學制劑文庫由已知化合物的結構類似物或通過天然產物篩選鑒定為“hits”或“Leads”的化合物。天然產物文庫是微生物、動物、植物或海洋生物的集合，它們通過(1)來自土壤、植物或海洋微生物的液體培養基發酵和提取或(2)植物或海洋生物的提取制造混合物用于篩選。組合文庫包括大量的肽、寡核苷酸或有機化合物作為混合物。通過傳統自動合成方法、PCR、克隆或者專有的合成方法它們相對容易制備。尤其感興趣的是肽和寡核苷酸組合文庫。感興趣的其它文庫也包括肽、蛋白、肽模擬物、多平行、合成集合、重組的和多肽文庫。對從那里制的組合化學和文庫的評論，見Mysers，生物技術的現行評價8701-707(1997)。
通過使用在此描述的各種文庫調節劑的鑒定允許修飾候選的“hit”(或“Lead”)以最優選“hit”調節活性的能力。
本發明進一步提供方法以鑒定本發明PDE8A多肽的特異結合伙伴化合物，包括步驟a)在允許化合物和PDE8A多肽結合的條件下將PDE8A多肽與化合物接觸；b)檢測化合物與PDE8A多肽的結合；和c)鑒定化合物作為PDE8A多肽的特異結合伙伴。本發明的方法所鑒定的結合伙伴通過酶的抑制、活化或加強，優選調節PDE8A酶活性。
本發明也提供方法以鑒定本發明PDE8A多核苷酸的特異結合伙伴化合物，該方法包括步驟a)在允許化合物和PDE8A多核苷酸結合的條件下，將PDE8A多核苷酸與化合物接觸；(2)檢測化合物與PDE8A多核苷酸的結合；和c)鑒定化合物作為PDE8A多核苷酸的特異結合伙伴。PDE8A多核苷酸的結合伙伴通過抑制表達或者加強表達。優選調節PDE8A多核苷酸所編碼的PDE8A多肽的表達。
本發明也提供通過本發明的方法所鑒定的化合物以及包含所鑒定化合物和藥學可接受載體的組合物。
發明詳述通過涉及編碼PDE8多肽的多核苷酸的分離以及編碼多肽的表達和特征的下列實施例說明本發明。為了鑒定對分離本發明的DNAs潛在有用的探針，實施例1描述尋找表達序列標簽(EST)數據庫的方法。實施例2涉及PDE8A-編碼多核苷酸的鑒定。實施例3說明分離的多核苷酸的序列分析。實施例4描述PDE8A多核苷酸編碼的多肽的分析。實施例5說明重組的PDE8A多肽的表達。實施例6涉及PDE8A表達的Northern分析。實施例7說明編碼PDE8A的基因的染色體定位圖。實施例8描述證明PDE8A1和PDE8A2是剪接變異體。實施例9說明重組PDE8A的表達和特征。實施例10詳細說明抗-PDE8A單克隆抗體的合成。實施例11說明通過原位雜交分析PDE8A表達的。
實施例1與人PDE相關的EST的鑒定為了鑒定對新磷酸二酯酶(PDE)基因的鑒定潛在有用的cDNA片段，使用已知的人3′，5′環核苷酸磷酸二酯酶的序列，進行國家生物技術信息中心(NCBI)表達序列標簽(EST)數據庫的搜尋。這個數據庫包含代表從許多組織來源收集的cDNA一端或兩端的DNA序列。在cDNA的一端或兩端進行單一序列測定，DNA序列的質量變化巨大。此時進行PDE搜尋，EST序列數據庫含有來自許多生物體的超過600000 cDNA序列。
新的PDE序列的搜尋包括3個步驟。首先通過NCBI可得到的BLASTN程序用于在EST序列數據庫中鑒定與編碼已知人PDEs的cDNA同源和DNA序列。程序將核苷酸搜尋序列與核苷酸序列數據庫比較。提交15個已知人PDEs的cDNA序列，并進行15次BLASTN搜尋；搜尋PDEs序列包括PDE1A3[Loughney，等，生物化學雜志，271796-806(1996)]、PDE1B1[Yu等，細胞信號，待發表(1997)]、PDE1C2[Loughney等，生物化學雜志.271796-806(1996)]、PDE2A3[Rosman等，基因19189-95(1997)]、PDE3A[Meacci等，美國國家科學院院刊(美國)893721-3725(1992)]、PDE3B[Miki等，基因組36476-485(1996)]、PDE4A5[Bolger等，分子細胞生物學136558-6571(1993)]、PDE4B2[Bolger等，分子細胞生物學136558-6571(1993)]、PDE4C[Bolger等，分子細胞生物學136558-6571(1993)]、PDE4D1和PDE4D3[Bolger等，分子細胞生物學136558-6571(1993)]、PDE5A、PDE6A[Pittler等，基因組6272-283(1990)]、PDE6B[Collins等，基因組13698-704(1992)]、PDE6C[Piriev等，基因組28429-435(1995)]和PDE7A1[Michaeli等，生物化學雜志1712925-12932(1993)]。檢查BLASTN結果，判斷為與15個已知PDE cDNAs的每一個相對應的EST序列得到鑒定并收集進表中。用作搜尋的PDE6和PDE6B序列由于在cDNAs的3′未翻譯區域存在重復元件而在3′端截短(去除部分3′未翻譯區域)。
其次，NCBI TBLASTN程序用于檢查15個已知人PDEs(如上述)的蛋白序列和由每一個EST DNA序列編碼的6個不同可能蛋白之間的同源性。在此搜尋中，在6個框架中翻譯EST序列，產生的氨基酸序列與搜尋PDE氨基酸序列相比較。檢查在氨基酸水平鑒定為同源的序列，去除在上述BLASTN搜尋過程中絕對確定與已知PDE對應的任何EST序列。
搜尋的第三步包括分析那些并不是已知的PDEs的序列。這些氨基酸序列與已知的PDE同源但不是BLASTN搜尋中鑒定為15個已知PDE基因的其中一個。
BLAST搜尋從人肺胎兒肺cDNA文庫中鑒定一個EST序列(命名WO 4835)，為編碼具有與PDE2A、PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE5A、桿αPDE6A、桿βPDE6B、椎αPDE6C和PDE7A的催化區域同源性的氨基酸序列。WO 4835的數據庫序列陳述于SEQ ID NO7。使用PDE4D序列舉例說明來自如下面討論的數據庫分析的結果。
WO4835 cDNA從美國典型培養物保藏中心(Rockville，MD)獲得，它保藏并使得由I.M.A.G.E.(Lawrence Livermore國家實驗室，Livermore，CA)所鑒定和測定的EST保藏物可公開獲得。一旦收到對WO4835 DNA進行測序以肯定它的身份并確定與SEQ IDNO7相一致。
由EST序列WO4835的-1閱讀框架編碼的氨基酸序列可以被除了PDE1A、1B和1C之外的所有PDE搜尋cDNA序列識別。使用PDE4D3的TBLASTN的結果作一個例子，檢測相似的兩個區域。第一個區域顯示15/37精確匹配或40％相同(19/37相似氨基酸)并包括在所有的搜尋序列中發現的HD(X)2HXG(X)13A(SEQ ID NO8)基序[Charboneau，分子藥理細胞調節2267-298(1990)]。第二個區域顯示9/20精確匹配或45％相同，并包括在大部分搜尋序列中發現的YHNXXHA基序。WO 4835序列BLASTN分析提示它是獨特的，因為它不與Genbank數據庫中的任何其它人DNA序列相同。WO4835的EST數據庫登記鑒定此序列與PIRA4879、牛cGMP結合的、水解cGMP的PDE5A1序列相似。WO4835框架-1的蛋白序列與牛PDE5A1序列比較揭示58/153匹配，38％的完全相同。在此區域內是更大同源性的小區域；一個區域表現12/14相同的氨基酸。考慮到WO4835序列的獨特性質，與牛PDE5A1的相對低同源性以及存在在大部分其它已知人PDE氨基酸序列中發現的氨基酸基序，WO4835代表一種新的人PDE cDNA。
實施例2推定PDE cDNA的分離用限制酶EcoRT和Hind III將WO4835 cDNA插入子從pTTT3D載體上消化成為兩個片段，這兩個片段用兩個序列低溶點瓊脂糖凝膠純化。利用本領域常規執行的方法，兩個片段用作探針篩選來源于人心臟(Stratagene，La Jolla，CA)和人胎兒腦(Stratagene)的cDNA文庫。篩選來自每一個文庫的大約5×15噬菌體。雜交于65℃在含有3×SSC、0.1％肌氨酰、20mM磷酸鈉、pH6.8、10×Denhardts溶液和50μg/ml鮭魚精子DNA的緩沖液中過夜進行。放射自顯影之前濾膜于65℃在含2×SSC和0.1％SDS的緩沖液中洗滌。
來自胎兒腦cDNA文庫的9個克隆和來自心臟cDNA文庫的2個克隆與WO4835探針雜交。部分測序和定位圖使得從胎兒腦文庫中選擇一個克隆命名為FB66a以進一步分析特征。
使用WO4835 5′部分的1.3kb EcoRI/Hind III片段在第一次篩選所用的條件下第二次篩選來自胎兒腦cDNA文庫的大約7.5×105個噬菌體，產生19個另外的cDNA克隆。這些cDNAs中的6個也與包括WO4835 5′端的256個核苷酸區域的WO 4835的HindIII/kpn I片段雜交。5個這些克隆的部分測序和定位圖使得選擇第2個克隆命名為FB85C-2做進一步分析。
買施例3FB66a和FB85C-2的DNA序列分析根據生產者建議的步驟使用下面在SEQ ID NOS9至31中陳述的DNA寡核苷酸引物和Perkin Elmer應用生物系統部門的373ADNA測序儀對兩條鏈確定FB66a的DNA序列。根據PCR產物的大小計算用作模板的PCR產物的量，并用帶有Apli Taq DNA聚合酶FS(Perkin Elmer，Foster City，CA)的ABI PRISM Dye TerminatorCycle Sequencing Ready反應試劑盒和不對稱PCR測序。反應產物在AGCT旋轉柱(Advanced Genetic Technologies Corp.，Gaithersburg，MD)并干燥。上樣緩沖液加至每一純化的樣品中，混合物于90℃加熱2分鐘。溶液轉移到冰上直至加到4％聚丙烯酰胺凝膠上。一旦數據收集程序啟動則自動收集數據，并由序列分析程序自動分析和閱讀。手工進行所有的編輯，在確定一致的序列的地方得到的序列進行對比M13Rev.1GGAAACAGCTATGACCATGSEQ ID NO9W48A2 ACTCTCCAAGGAAATACAGSEQ ID NO10W48A9 CTGTCTCTGCACTAACAC SEQ ID NO11W48A4 TTGGCAAGGCCTCTGCAT SEQ ID NO12W48S1 CCTCTATGAACTGAGCAG SEQ ID NO13W48A1 GAAGGCACTGCCACTGAT SEQ ID NO14W48S6 TCGAGCTGTATCGGCACT SEQ ID NO15W48A5 AGCGTGTGATTGTTCTGAASEQ ID NO16W48S7 TGCTGGCCAAGTAGCAAG SEQ ID NO17W48AAAGGTCACAGGCAGTCAT SEQ ID NO18W48S2 GAAGAGTGGCAAGGTCTC SEQ ID NO19W48S3 TCATGACCTGGACCACCAGSEQ ID NO20W48A8 CCTTCTTGAAGAGGTTTGCSEQ ID NO21W48S4 ATGACTGCCTGTGACCTT SEQ ID NO22W48S5 CTGCTATACAACCCTTACCSEQ ID NO23W48S8 GCTAATATTGCTGAGGCC SEQ ID NO24W48A7 TAAGTGAGAGGTGACTGC SEQ ID NO25W48S9 CCTAAAGGGCTGAGATCA SEQ ID NO26W48S10 CGCAGTCACCTCTCACTT SEQ ID NO27M13 TGTAAAACGACGGCCAGT SEQ ID NO28W48A11 ACAAAACGCCTATGGTGG SEQ ID NO29W48A10 TTGATCTCAGCCCTTTAGCSEQ ID NO30W48S11 TCATGTGGCAGGAAACTG SEQ ID NO31
陳述于SEQ ID NO3中的FB66a cDNA長度上是4389個核苷酸，從核苷酸3至核苷酸2411編碼具有大約90 775 Da預計分子量的803個氨基酸的蛋白質。FB66a推斷的氨基酸序列陳述于SEQ ID NO4中。第一個甲硫氨酸在核苷酸45編碼；缺少一個上游框架內終止密碼使得此殘基是內部甲硫氨酸還是開放閱讀框架的起始不太清楚。
使用引物M13Rev.1、W48A2、W48A9、W48A4、W48S1、W48A1、W48S6、W48A5、W48A6、W48S2、W48S3、W48S4、W48S5、W48S7、W48A8和M13相似地確定FB85c-2(SEQ IDNO5)的DNA序列。FB85c-2好象包括兩個不同的DNA插入子，只有一個與WO4835同源。與WO4835同源的區域大約長2.8kb。插入子5′端精確序列并不確定，因而幾百個是5′-未翻譯區域的序列堿基不包括在陳述于SEQ ID NO5的2573個核苷酸序列中。核苷酸67至核苷酸2406編碼具有預計分子量88353Da的具有779個氨基酸的蛋白(SEQ ID NO6)。框架內上游終止密碼子使得有可能核苷酸67位所編碼的甲硫氨酸是起始甲硫氨酸。
FB66a和FB85c-2所編碼的蛋白有不同的氨基端序列，這可能由于可選擇的剪接。從FB66a中核苷酸112及FB85c-2中核苷酸104的5′DNA序列彼此不同。這樣FB85c-2在氨基端有13個在FB66a蛋白中未發現的氨基酸。如果起始甲硫氨酸推測由核苷酸35編碼，FB66a蛋白包括23個獨特的氨基端殘基；如果FB66a克隆中開放閱讀框架不完整，蛋白則包括超過37個獨特的氨基端殘基。
FB66a序列的BLASTN分析，其中搜尋核苷酸序列與核苷酸序列數據庫相比較，揭示與Genbank、NCBI、STS、NCBIHTGS、或NCBIGSS數據庫中的序列不相同。然而兩個相同序列在NCBI EST數據庫中得到鑒定。
一個序列是用于鑒定cDNA克隆的WO4835 EST。第二個，起源于結腸癌細胞系KM12C(HCC)的AA307865(SEQ ID NO32)，顯示與FB66a和FB85c-2克隆的3′未翻譯區域有序列相同性。在鑒定AA307865的搜尋中，另外的EST DNAs得到鑒定推測它編碼FB66a和FB85c-2所編碼人蛋白的推定小鼠(EST AA386789，SEQ IDNO38)和大鼠(EST H32734，SEQ ID NO33)同系物。小鼠序列與人的序列是86％相同，而大鼠是81％。
實施例4分析FB85c-2和FB66a蛋白由克隆FB85c-2和FB66a編碼的PDEs分別命名為PDE8A1和PDE8A2。在上面所討論的分岐點以外具有完全氨基酸序列相同性的兩個PDE8A蛋白與人PDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B和PDE6C最相似。表1和表2表明PDE8A和PDE2A、PDE5A及PDE6A之間氨基酸相同的百分率。
PDE8A1和PDE8A2在催化區域(PDE8A1中氨基酸492至748)與其它PDEs以及PDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B和PDE6C的氨基端區域中保守的推定cGMP結合結構域享有同源性。PDE8A的潛在cGMP結合結構域從PDE8A1多肽中的氨基酸75延伸至氨基酸445。在PDE2A、PDE5A、PDE6A、PDE6B和PDE6C的cGMP結合結構域中，有兩個命名為“a”和“b”的內部重復，每個重復含有一系列保守氨基酸[McAllister-Lucas等，生物化學雜志26822863-22873(1993)]。在PDE8A的對應“b”重復區域，發現所有的保守氨基酸；在對應的“a”重復區域，只檢測到一些保守的殘基。表明對牛PDE5A的cGMP結合是必需的一個天冬氨酸殘基[McAllister-Lucas等，生物化學雜志.2701-9(1995)]不存在于PDE8A的“a”重復區域。因而不能肯定PDE8A的此區域是否有結合cGMP的功能。
表1在整個蛋白中PDE8A的相同性
表2在催化結構域中PDE8A的相同性
買施例5重組PDE8A的表達產生PDE8A的表達構建物，它包括從PDE8A1和PDE8A2分岐點3′的DNA序列通過終止密碼子。表達構建物包括編碼8個氨基酸表位標簽的DNA。包含陳述于SEQ ID NO34肽序列的所謂“FLAG標簽”，加到氨基末端以便蛋白通過Western印跡技術用抗-FLAGMZ抗體(Eastman Kodak，Rochesterm，NY)得到鑒定，此抗體特異識別SEQ ID NO34的肽。
SEQ ID NO34 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys在蛋白的氨基末端也加上編碼起始甲硫氨酸的序列。
作為構建表達質粒的第一步，用FB66a DNA作為模板，用陳述于SEQ ID NO35(下面)和W48A2(SEQ ID NO10， p14)的引物，在含有2μl每一引物[儲存液100μg/ml]、2μl 10×PCR緩沖液II(Perkin Elmer)/2μl 10X每一核苷酸儲存液(儲存液2mM)、1.2μl MgCl2(儲存液25mM)的反應混合物中進行PCR。0.09μl 5Units/μl taq聚合酶(Perkin Elmer)、FB66a DNA和水加入反應混合物中至20μl進行PCR反應。在5′引物中(SEQ ID NO35)，NcoI粒點加重，FLAG標簽編碼區域劃線。
SEQ ID NO35CAGTCAGCTAGCCGCCATGGACTACAAGGAC-GACGATGACCAAGTTGACTGATGAAAAGGTG在Perkin Elmer DNA熱循環儀中在下列條件下進行PCR95℃4分鐘，接著94℃1分鐘、50℃1分鐘、72℃2分鐘，30個循環。
得到的PCR產物用NcoI和kpnI消化，凝膠純化，并亞克隆進入已用相同酶消化的Bluescript SKII載體中。Bluescript載體已經過修飾以包括從YEpC-PADH2d載體上去除的醇脫氫酶2(ADH2)啟動子片段(Price等，酶學方法185308-315(1990))。得到的質粒命名為W48pcr1。
含有開放閱讀框架3′部分的kpnI/SstI片段從FB66a cDNA分離，并插入已用kpnI和EcoRV消化的W48pcr1中。得到的質粒命名為W485.1。
含有ADH2啟動子和PDE8A基因5′部分的SacI/KpnI片段從W49pcr1中分離。含有PDE8A 3′區域的kpnI/SalI片段從W485.1分離。兩個片段連接進已用SacI和SalI消化的酵母表達載體YEpC-PADH2d。得到的質粒命名為W48-2ADH2，并按照布達佩斯條約于1997年10月2日保藏于美國典型培養物保藏中心(A.T.C.C.)，12301Parklawn Drive，Rockville，MD20852。帶有質粒W48-2ADH2的細菌菌種授與保藏號ATCC98552。確定PCR產生的DNA序列和PDE8/載體結合處的DNA序列以確保正確的質粒構建物。一旦確認了序列，質粒轉化進缺少內源PDE活性的酵母菌種BJ2-54(ura3-52；trp1；leu2；cir°；gal2；pep4-3；prb1-1122；prc1-402；ΔPDE1URA3；HIS3；ΔPDE2TRP1)。
宿主細胞在包括2％葡萄糖的SC-leu選擇培養基中過夜生長，稀釋至1-2×105細胞/ml，接下來在相同的培養基中生長至107細胞/ml的濃度。即使在非-誘導條件下表達質粒的出現好象將細胞生長的雙倍時間增加2至3倍。細胞經離心收集，用包括3％甘油的YEP培養基洗滌，以107細胞/ml的密度重新懸浮于YEP/3％甘油中，收獲前生長24小時。細胞冷凍直至使用。
冷凍的細胞塊(0.06ml)融解，懸浮于含有100mM MOPS、pH8.0、200mM NaCl、2μM ZnSO4、2mM二硫蘇糖醇、和10μg/ml每一種蛋白酶抑制劑抑胃酶肽、亮抑酰肽和抑蛋白酶酞的0.2ml裂解緩中液中。大約0.2ml 0.5mm玻璃珠加到細胞中，這些細胞然后用4個30秒劇烈振蕩循環裂解。吸出裂解物，玻璃珠用0.3ml裂解緩中液洗滌2次。裂解物和洗滌液合并產生酵母提取液。在一些實驗中，裂解物通過在105000×g離心30分鐘而分成幾部分。
按如下對含有重組蛋白的酵母提取液進行Western分析。蛋白首先在SDS-PAGE上分離，并使用標準方法轉移到Immobilon-P(Millipore)上。蛋白印跡于室溫使用存在于20mM Tris-HCl、pH7.4、150mM NaCl、0.05％Tween-20中的5％無脂干牛奶(TBST緩中液加牛奶)封閉1小時。印跡與存在于TBST緩沖液加牛奶中的濃度為1μg/ml的抗-FLAG M2抗體(上面討論的)溫育1小時，之后點跡用TBST緩中液洗滌4次。印跡然后與偶聯了辣根過氧化物酶(HRP)的印跡級親和純化的山羊抗小鼠IgG抗體溫育1小時。山羊IgG事先在加牛奶TBST緩沖液中1∶10000稀釋。印跡用TBST洗滌4次，根據生產商建議的步驟，散射自顯影之前用加強化學發光的Renaissance系統(New England Nuclear Life SeieneesProducts)處理。通過抗體檢測的大部分蛋白是重組蛋白預期的大小。
如以前所描述的[Loughney等，生物化學雜志271796-806(1996)]方法，通過檢測從32P-CAMP或32P-cGMP中釋放的32P-磷酸測定PDE活性。酵母提取物在也含有0.5mg/ml牛血清白蛋白的0.5X裂解緩沖液中稀釋。20μl酵母提取物或稀釋的酵母提取物，在包括另外的50mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl2、1μM ZnSO4和0.1mg/ml牛血清白蛋白的100μl反應體積中測定。蛋白濃度通過Bradford的方法測定。
觀察到PDE8A水解cAMP和cGMP。在未分部的裂解物中，對cAMP的特異活性是3.9nmol/min/mg，對cGMP的特異活性是7.6nmol/min/mg。分部揭示20-40％的總活性與高速上清部分相關。用cAMP作為底物的活性動力學分析表明以1∶1活性比率存在酶的高和低km形式。估計的km值是0.2μM和350μM。高速沉淀塊的分析表明相同種也存在但是以1∶4的高km低km活性。用cGMP作為底物的動力學分析表明存在酶的低和高活性的形式。在這些分析中，km值估計是3μM和300μM。
使用一套同功酶選擇性PDE抑制劑和非選擇性抑制劑異甲基丁基黃嘌呤(IBMX)確定PDE8A活性抑制的IC50值。因為此測定在60nM的cAMP濃度進行，IC50值只反映低km形式的抑制。結果陳述于表3中，值以微摩爾單位顯示。
表3使用同功酶特異的PDE抑制劑的PDE8抑制
每一種選擇抑制劑對PDE8的IC50值比對它們的靶同功酶高至少30倍，這說明PDE8的抑制情況不同于PDEs1-5。cAMP和cGMP的水解將PDE8A的酶活性和PDE6及PDE7A的活性清楚區別開。非選擇性抑制劑IBMX對PDE8的IC50值在對已知人PDEs所觀察的范圍內，表明PDE8的催化點與其它人和哺乳類PDEs的相似，并不同于對IBMX不敏感的更低真核形式。
買施例6PDE8A表達的Northern分析使用人多組織點跡(Clontech，Palo Alto，CA)進行PDE8A表達的Northern分析。327個堿基的探針從SEQ ID NO3中的核酸1767延伸至2293。核糖探針的制備和雜交條件如以前所描述的[Loughney等，同上]。
結果表明在所有檢查的組織中有9.5kb的mRNA但帶強度有變化。信號在心臟、腦和腎中最強；信號在肝、胎盤、胰腺和骨骼肌中較弱。信號在肺中最弱。
實施例7人PDE8A的染色體定位圖含有人PDE8A基因的酵母人工染色體(YACs)從購買自遺傳研究公司的一組人YACs中分離并按如下通過PCR篩選。
用兩個嵌套引物對篩選YAC的上庫。在第一次篩選反應中，正義引物W48S8(SEQ ID NO36)與反義引物W48A10(SEQ IDNO37)配對。用10mM Tris-HCl、pH8.3、50mM KCl、2mMMgSO4、0.2mM每一種dNTP、10μg/ml每一種引物、0.5 units Taq聚合酶(Perkin-Elmer)以及1.5μl YAC庫DNA作為模板進行PCR。反應進行30個循環，每一循環包括94℃1分鐘、60℃2分鐘和72℃4分鐘。首輪擴增以后，反應產物用內部引物對W48S12(SEQ IDNO36)和W48A12(SEQ ID NO37)再擴增。
W48S12SEQ ID NO36CCAGAAGGGGTACTTTTCCW48A12SEQ ID NO37CATTGTCCTGAGGCTGTGG除了模板是1μl首輪反應1∶10稀釋液(在水中)外按上述進行反應。鑒定產生正確大小PCR產物的上庫，在相同條件下用相同的嵌套引物對篩選對應的下庫以鑒定含有PDE8A的YACs的獨特位置。
帶有相關YACs的酵母菌株從遺傳研究公司購買。為了確證PDE8A基因在各種YACs中存在，從每一菌株中制備DNA，并通過PCR用引物W48S8和W48A10分析。根據以前描述[Hoffman和Winston，基因57267-272(1987)]但按下面經過修改的方法從每一菌株中制備DNA。菌株在含有葡萄糖的YEP培養基中30℃過夜生長。離心沉淀10ml培養物，并在含有10mM Tris-HCl、pH8.0、100mM NaCl、1mM Na2EDTA、1％SDS和2％Triton-X100的200μl水緩沖液中重新懸浮。在200μl酚/氯仿(1∶1混合物)和100μl玻璃珠(425-600μm)的存在下通過劇烈振蕩裂解細胞。裂解后，加入200μl TE緩沖液(100mM Tris、pH8.0、1mM Na2EDTA)，樣品離心以分相。用200μl水緩沖液再次抽提有相機。收集的水相用100units牛胰腺PNase(Boehringer Mannheim)37℃處理1小時，根據已建立的方法樣品用酚/氯仿抽提，用氯仿再抽提，乙醇沉淀。得到的沉淀重新懸浮在50μl TE緩沖液中。除了反應體積是25μl以及模板由1μl相關酵母DNA制品組成之外，按上述進行PCR。
鑒定3個位置為805B6、919H10和920A3(作為每一個CEPH命名)含有PDE8基因的人YACs。根據基因組研究數據庫中心的信息(Whitehead)，3個YACs互相重疊，是人染色體6上單獨連接的毗連序列群(WC6.16)的部分。在基因組研究中心的工作中此毗連序列群中的兩個序列標簽位點(D6S305和D6S411)放在染色體6遺傳圖譜距離6p端167cM的位置上；在CEPH-Genethon的工作中，D6S305定位于距離6p端173cM的位置上。在CEPH-Genethon通過熒光原位雜交已定位WC6.16毗連序列群中3個其它YACs(932F1、956B1和947D5)。雜交信號位于距離6P端0.94和0.99部分長度單位之間。根據CEPH結合的總結圖譜[Chumakov等，自然377(增刊)175-297(1995)]，此區域對應于細胞遺傳區域6q26-27。
與人基因組這個區域相關的遺傳缺陷包括視網膜錐退化(OMIM數據庫)、胰島素依賴的糖尿病[Davies等，自然371130-136(1994)，Luo等，美國人類遺傳雜志，57911-919(1995)]和青少年發病的帕金森神經機能障礙[Matsumine等，美國人類遺傳雜志60588-596(1997)]。此外，在各種不同的癌細胞中，包括Burkitt′s淋巴瘤[Parsa等，基因、染色體&癌913-18(1994)]、星形細胞瘤[Liang等，神經病學44533-536(1994)]、胃癌[Queimado等，基因、染色體&癌1428-34(1995)]、甲狀旁腺瘤[Tahara等，癌癥研究56599-605(1996)和卵巢瘤[Cooke等，基因、染色體&瘤15 223-233(1996)]；Saito等，癌癥研究565586-5589(1996)]中在此區域經常觀察到雜合性的丟失(LOH)。LOH表明在受影響的區域表明存在腫瘤抑制基因[Weinberg，科學2541138-1146(1991)]。由于它的廣泛表達，有可能PDE8基因的突變參與所有或者一部分這些遣傳異常。
實施例8證實PDE8A1和PDE8A2代表剪接變異體并努力擴展PDE8A2的5′序列為了證實PDE8A1和PDE8A2代表5′剪接變異體，采用兩種方法。首先PCR分析表明，在基因組DNA中，PDE8A1和PDE8A2的序列都不鄰近普通區域的DNA序列。普通區域的基因組序列上游存在于第三個PDE8A cDNA，FB74b中，它在與實施例2中所述探針OW4835的5′端雜交的6個最初克隆的一組中得到鑒定。克隆FB74b的部分序列(3′端755個核苷酸)陳述于SEQ ID NO39。FB74b cDNA在FB85c-2和FB66a彼此分岐的相同位置與FB85c-2和FB66a分岐，但FB74b克隆不保留開放閱讀框架。在FB74b序列5′至與FB66a和FB85c-2克隆序列分岐點，一個框架內終止密碼子比起始甲硫氨酸密碼子更接近分岐點表明，如果FB74b代表cDNA而不是未剪接前體，起始甲硫氨酸有必要位于對FB66a和FB85c-2都普通的序列中。
使用FB74b上游序列中命名為FB74bS1(SEQ ID NO40)的一個引物和對FB74b、FB66a和FB85c-2共同的序列內命名為W48A9(SEQ ID NO11)的第二個引物進行PCR分析。FB74bS1GTTAGATGAGAGGTTGCTGGSEQ ID NO40使用1μg人基因組DNA作為模板，擴增一條帶，與用FB74b作為模板擴增的帶具有同樣大小，表明FB74b所獨特的序列和共同區域在基因組DNA中是鄰近的。這樣FB74b序列可以代表未剪接內含子或者代表編碼具有共同區域內起始甲硫氨酸蛋白的第三個剪接變異體。在兩種情況下，FB85c-2和FB66a序列推測由剪接產生。
第二，使用從人皮質、小腦、心臟、肝、肺組織分離的RNA進行5′RACE分析。按所描述的[Loughney等，生物化學雜志271796-806(1996)]從冷凍組織片段中分離RNA，用使用Fast TrackTM mRNA分離系統(Invitrogen)選擇polyA+mRNA。使用5μg polyA+mRNA和cDNA合成試劑盒(Boehringer Mannheim)制備雙鏈cDNA。cDNA連接到通過退火寡核苷酸L15(SEQ ID NO41)和L30(SEQ ID NO42)形成的接頭上。
L15 GTATGCTAATCTCAGSEQ ID NO41L30 CAACTCGAATTCCTTGACAGATTAGCATAC SEQ ID NO42對5′RACE，使用寡核苷酸L18(SEQ ID NO43)和W48A13(SEQ ID NO44)通過PCR擴增接頭所連接的cDNA。
L18CAACTCGAATTCCTTGACSEQ ID NO43W48A13 GTTGTTCTTCCTCTTCAGCC SEQ ID NO44在25μl的反應體積中反應含有10mM Tris-HCl、pH8.3、50mMKCl、1.5mM MgCl2、0.2mM每一種dNTP、10μg/ml每一種引物和1μg接頭所連接的cDNA。94℃加熱步驟后，加入0.1unit Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)起始PCR，PCR繼續30個循環，每個循環94℃1分鐘、60℃2分鐘和72℃4分鐘。
PCR反應的產物用水稀釋10倍，并在如上述相同條件下使用寡核苷酸L21(SEQ ID NO45)和W48A9S(SEQ ID NO46)的第2個PCR反應中用作模板。
L21 CAACTCGAATTCCTTGACAGA SEQ ID NO45W48A9S GATCGTCGACCTGTCTCTGCACTAACAC SEQ ID NO46在第2個PCR反應中擴增的DNA用EcoRI和SalI切割，并連接進已經用相同的酶消化的載體Bluescript(stratagene)中。
開始，檢查來自每一組織來源的5個質粒中DNA序列，并發現PDE8A1和PDE8A2 5′都在所分離的cDNA中。也可以獲得FB74b 5′序列，它是幾個序列，每一人只分離一次，代表另外的剪接變異體或不相關DNA序列。
因為無PDE8A2一樣cDNA比最初FB66a cDNA向5′延伸更長，為了試圖延伸5′端序列分析另外的PDE8A2 RACE克隆。鑒定并測序另外5個肺PDE8A2 cDNA，但沒有一個延伸PDE8A2序列。
使用L21引物(SEQ ID NO45)和引物W48A14S(SEQ IDNO47)重復RACE PCR的第2輪。
W48A14S SEQ ID NO47GATCGTCGACAAGCACTCGGTCAGCCTTCG通過PCR篩選得到的克隆，選擇最長的一個用于測序。只有兩個克隆比最初FB66a cDNA長，它們在未翻譯區域分別延伸5′序列8和12bp。用5′-CCCAGGGCGCCA使FB66a序列得到延伸。FB66a最遠5′端是GC非常豐富的，這也許決定了困難得到全長cDNA。
實施例9PDE8A的表達和特征描述實施例5中所描述重組PDE8A在酵母提取液中以低親和和高親和形式存在。因為有可能低親和形式代表部分未活化酶，在sf9和COS細胞中進行PDE8A表達以試圖或者獲得同型酶或者確定是否兩種動力學形式總是從cDNA表達。
用來自質粒W4851(實施例5中所述)3′KpnI-SalI片段和按如下PCR產生的5′片段產生PDE8A sf9表達構建物。引物FLAG-1(SEQ ID NO48)和W48A4(SEQ ID NO12)用在PDE8COS-1 DNA(在下面描述)作為模板的PCR中。
FLAG-1 GATCGGATCCACCATGGACTACAAGGSEQ ID NO48除了2mM MgSO4置換MgCl2使用并用0.02μ Taq聚合酶之外，按實施例8中所述進行PCR。94℃4分鐘初始溫育后，進行30個循環，94℃1分鐘、50℃1分鐘和72℃2分鐘。5′擴增產物用BamHI和KpnI切割、凝膠純化并與3′片段連接進已用BanHI和SalI消化的載體pFASTBC(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。得到的質粒命名為pFBRPDE8。通過測序確證所有的PCR擴增產物和所有新的結合物。
根據生產商所建議的步驟使用FastBac系統(Gibco BRL)產生重組病毒株，并按如下進行蛋白表達。sf9細胞于27℃生度在含50μ/ml氨芐青霉素和50μg/ml硫酸鏈霉素(Gibco)的CCM3培養基(Hyclone，Logan，UT)中生長。指數生長的細胞以大約每個細胞兩個病毒的倍數感染并培養48小時。離心收集細胞，用CMF-PBS(2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、137mM NaCl、8.1mM Na2PO4)洗滌，冷凍沉淀細胞并于-80℃保藏至使用。在等體積玻璃珠(酸洗滌，0.5mm，Sigma)存在時通過劇烈振蕩在緩沖液(50mM MOPS pH7.2、10μM硫酸鋅、1mM DTT、2mM苯扎明、10μg/ml抑胃酶肽、亮抑酶肽和抑蛋白酶肽以及20μg/ml鈣蛋白酶抑制劑I和鈣蛋白酶抑制劑II)中裂解細胞，并如實施例5中所描述的確定PDE活性。
在sf9提取物中，對cAMP水解(100μM底物)檢測到45.4nmol/min/mg PDE活性，對cGMP水解(100μm底物)檢測到69.4nmol/min/mg PDE活性。背底PDE活性是可以忽略的。PDE8A活性好象是實施例5中所描述的如在酵母提取液中所檢測到的高和低親和形式的混和物。
對在COS細胞中的表達，通過聯合來自質粒W485.1(實施例5)3′KpnI/SalI片段和切割PCR擴增產物獲得的NheI/KpnI片段產生pDE8COS-l，而PCR擴增產物來自包括FB66a cDNA作為模板使用引用W48A2(SEQ ID NO10)和ATG(SEQ ID NO35)的反應。PCR的條件包括在Perkin Elmer Cetus DNA熱循環儀中，94℃4分鐘的初始溫育，接著30個循環，94℃1分鐘，50℃1分鐘和72℃2分鐘。得到的5′片段和上述3′片段連接進已用NheI和SalI消化的載體pClneo(Promega，Aadison，WI)中。
生長在15cm培養皿中的半融合COS細胞用25ml DMEM(Dulbeccos修改的Eagle培養基，100U/ml氨芐青霉素和100μg/ml硫酸鏈霉素，GIBCO)洗滌1次，之后14ml DMEM/DEAE-dextran/氯奎加到每個培養皿中。DMEM/DEAE-dextran/氯奎包括75mlDMEM和30μl存在于PBS(2.7mM KCl、1.5mM KH2PO4、137mM NaCl、8.1mM Na2PO4、0.9mM CaCl2、0.5mMMgCl2)中的0.25M氯奎與0.75ml 50μg/ml DEAE-dextran(Pharmacia，Uppsala，瑞典)。存在于135μl Tris/EDTA緩中液(TE)中的20μg質粒DNA加入每一培養皿中，培養皿于37℃在5％CO2中培養2小時。去除培養基，加入12ml 10％DMSO/PBS 1分鐘并去除。細胞用25ml DMEM洗滌1次，之后另外25ml含有10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的DMEM加入，細胞于37℃在5％CO2中過夜培養。去除培養基并用25ml CMF-PBS洗滌單層細胞。加入6ml含有0.05％胰蛋白酶/0.5mM EDTA(Gibco)的溶液。細胞于37℃溫育5分鐘。通過研磨從培養皿中取出細胞并轉移到園錐形離心管中。培養皿用6ml完全DMEM洗滌以收獲任何剩余的細胞，洗滌溶液加到離心管中。通過在大約340×g下離心5分鐘沉淀細胞，在5ml完全DMEM中重新懸浮，移至含20ml完全DMEM的15cm組織培養皿中，于5％CO2中過夜培養。
單層細胞用CMF-PBS洗滌兩次，在維爾烯(0.5mMNa2EDTA·2H2O、137mM NaCl、2.68mM KCl、8.1mMNa2HPO4、1.1mM葡萄糖、pH7.4)中于37℃溫育5分鐘，并按上述收獲。沉淀的細胞用CMF-PBS洗滌，在干冰中冷凍，并保藏于-80℃直至使用。在緩中液(50mM MOPS、pH7.2、10μM硫酸鋅、1mM DTT、2mM苯扎明10μg/ml抑胃酶肽、亮抑酶肽、抑蛋白肽和20μg/ml鈣蛋白酶抑制劑I和鈣蛋白酶抑制劑II)中于20000psi通過French壓力細胞(SLM儀器)裂解細胞，如實施例5中所描述的方法確定PDE活性。
PDE8A的表達在COS細胞提取液中是低的，由于來自內源PDEs的高水平背景活性，不能精確確定其特征。為了更完全確定COS細胞表達產物的特征，根據生產商建議的步驟，使用抗-FLAG M2親和柱(Sigma)從細胞提取液100000xg上清中純化包括在氨基端FLAG標簽的酶(實施例5)。為了更精確確定酵母PDE8A活性的特征，如實施例5中所描述的為了獲得同型蛋白進行氨基端截短但保留催化區域的重組蛋白的表達。
實施例10抗-PDE8A抗體的合成在大腸桿菌中合成GST融合蛋白以提供產生抗PDE8A單克隆抗體的抗原。來自FB70a(包括FB85c-2的核苷酸182-1330的一個PDE8AcDNA，它是最初鑒定的與實施例2中所述全長WO4835探針雜交的9個克隆之一)的EcoRI片段插入pGEX5XI(Pharmacia)的EcoRI位點，得到的構建物轉化進大腸桿菌菌株XL1 Blue。用IPTG誘導此構建物產生包括來自PDE8A 382個氨基酸的GST-PDE8融合蛋白。用SDS-PAQE分離融合蛋白，用冷0.4M KCl染色后從凝膠中取出合適大小的帶，并通過電洗脫從丙烯酰胺中獲得蛋白。洗脫產物逆著PBS透析，注射進小鼠之前用Centriprep 10和Centricon柱(Amicon，BeverlyMA)濃縮。
第0天，4只Balble小鼠預先出血，并用200μl總體積中在完全弗氏佐劑中包括30μg/小鼠GST-PDE8融合蛋白的抗原皮下注射。在第3周和第9周在不完全弗氏佐劑中重復相同的注射。最后一次免疫后10天，獲得檢測血樣，并通過抗原捕獲ELISA和Western分析來篩選。
在ELISA中，Immulon 4培養板(Dynex，Cambridge，Massachusetts)于4℃用50μl/孔于50mM碳酸鹽緩中液pH9.6中含2μg/ml GST-PDE8的溶液來包被。培養板用0.5％魚皮明膠(Sigma)封閉30分鐘，加入在PBS加5％Tween 20(PBST)中稀釋的50μl血清。血清稀釋液范圍從1∶100至1∶102400，通過一系列加倍稀釋獲得。37℃溫育30分鐘并用PBST洗滌3次，加入50μl偶聯辣根過氧化物酶的山羊-抗小鼠IgG(fc)抗體(Jockson)(在PBST中以1∶1000稀釋)。如上述溫育培養板并用PBST洗滌4次。加入四甲基聯苯胺(Sigma Chemical，St.Louis，Missouri)檢測抗體，加入50μl15％ H2SO45分鐘后終止顏色反應。在培養板閱讀儀上測量450nm的吸收值。
對Western分析，用大約10μg酵母PDE8提取物和大約200ng凝膠純化的GST-PDE8跑SDS-PAGE凝膠，并且蛋白轉移至Immobilon-PVDF上。使用BioRad山羊抗小鼠IgG辣根過氧化酶作為二抗進行一個標準的加強化學發光(ECL)Western印跡方法。
在制備雜交瘤時，來自上面ELISA和/或Western點雜交方面給出陽性結果的小鼠脾細胞使用聚乙二醇1500(Boehringer Mannheim)通過標準方法以5∶1的比率與NS-1融合(Harlow和Lane，抗體，實驗室手冊，冷泉港實驗室，1988)。融合細胞重新懸浮于200ml含15％ FBS、100mM次黃嘌呤鈉、0.4mM氨基喋呤、16mM胸腺嘧啶(HAT)(Gibco)、25units/ml IL-6(Boehringer Mannheim)和1.5×106小鼠胸腺細胞/ml的RPMI中，并以200μl/孔分配至10個96孔平底組織培養板中(Corning，United kingdon)。通過用18G針(Becton Dickinson)從每一孔中吸出大約100μl，并加入除含有10units/ml IL-6和缺少胸腺細胞之外的上述100μl/孔鋪板培養基在融合后第2、4和6天飼養細胞。在第9至12天，通過使用GST和GST-PDE8的抗原捕獲ELISA和上述ELC Western分析篩選來自融合孔的上清。
使用小鼠血在Western雜交的兩個泳道上獲得預期大小的陽性信號，在隨后的融合中獲得與酵母重組蛋白具有弱反應性的單克隆抗體。使用50μg抗原/小鼠重復整個過程以獲得更強免疫反應的單克隆抗體。
實施例11通過原位雜交分析PDE8A的表達通過如下述的原位雜交在組織切片中檢查PDE8A的表達。探針的制備來自cDNA FB70a的XhoI/EcoRI限制酶片段(對應于SEQ IDNO1的核苷酸571至1226)亞克隆進Bluescript載體(Stratagene，LaJolla，CA)以產生命名為PDE8XR2A的表達質粒。質粒用XhoI切割并用T3聚合酶轉錄(見下面)以產生反義探針。用EcoRI切割PDE8XR2A并用T7聚合酶轉錄產生正義探針。使用RNA轉錄試劑盒(Stratagene，La Jolla，CA)在含有5μl 5X轉錄緩沖液(Stratagene)、30mMDTT(Stratagene)、0.8mM每一種ATP、CTP、GTP(10mM(Stratagene)、40U Rnase BlockII(Stratagene)、12.5U T3或T7聚合酶(Stratagene)、和300ng線性化質粒模板、50μ Ci35S-UTP(大于1000Ci/mmol，Amersham，Arlington Heights，IL)的反應中轉錄PDE8A模板。混合物于37℃溫育1小時，之后加入1μl無RNase的DNase I(Stratagene)并于37℃溫育15分鐘去除模板DNA。60℃下加入4μl 1M NaHCO3和6μl 1M Na2CO322分鐘分解探針，通過加入25μl含有100μl 3M乙酸鈉、5μl乙酸(VWR，So.Plainfield，NJ)和395μl dH2O的溶液中和反應混合物。根據生產商建議的方法制備一個Quick Spin G50 RNA柱(5′→3′Inc.，Boulder，Co)。探針放在柱子中心，柱子在桌子高離心機中于1000rpm離心4分鐘。柱子的流經液體與50μl H2O、2μl 10mg/ml tRNA溶液、10μl 3M乙酸鈉和200μl 100％乙醇(VWR)混和，得到的混合液于-20℃下溫育過夜。探針溶液于4℃微量離心15分鐘，去除上清，沉淀重新懸浮于含有1μl 0.1M DTT的40μl 1X TBE中。探針保藏于-70℃直至進行原位雜交試驗。
組織樣品的制備和原位雜交。
組織(國立疾病研究交流中心，Philadephia，PA和合作的人組織網絡，Philadephia，PA)以6μm切片，并放置于Super frost Plus切片(VWR)上。切片4℃于4％低聚甲醛(Sigma，St.Louis，MO)中固定20分鐘。載玻片在1X CMF-PBS中洗3次，在用70％乙醇、95％乙醇和100％乙醇的3次連續洗滌中脫水，于室溫干燥30分鐘。載玻片在存在于2X SSC中的70％甲酰胺(J.T.Baker)中于70℃放置2分鐘，于4℃在2X SSC中沖洗，通過70％、95％和100％乙醇洗滌而脫水，并室溫下干燥30分鐘。
將載玻片放置在避光盒子中，盒子中含有用存在于4X SSC中50％甲酰胺(J.T.Baker)的盒子緩沖液飽和的一張濾紙。每一個切片用100μl由10％硫酸葡聚糖(Sigma)、50％甲酰胺(J.T.Baker，Phillpsburg，NJ)100mM DTT(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)、0.3M NaCl(Sigma)、20mM Tris、pH7.5、5mM EDTA(Sigma)、和1×Denhardt′s溶液(Sigma)組成的rHB2緩沖液覆蓋，載玻片于42℃溫育1小時。通過將4×105cpm/每個組織切片與每個切片5μl 10mg/ml tRNA溶液混合并于95℃加熱混合物3分鐘制備如上述的探針。加入冰冷rHB2緩沖液使終體積為20μl/每個切片。含有探針的溶液(20μl/切片)加到以前加入的100μl rHB2緩沖液中。載玻片于55℃溫育12至16小時。雜交后，載玻片用含有10mM DTT的4×SSC于室溫下洗滌1小時，在50％去離子甲酰胺(J.T.Baker)、1×SSC、和1mM DTT中于60℃洗40分鐘，于2×SSC中室溫下洗30分鐘，在0.1×SSC于室溫下洗30分鐘。切片通過70％、95％和100％乙醇洗滌而脫水，空氣干燥30分鐘。載玻片浸在KodakNTB2核乳膠中，于黑暗中室溫干燥1至3小時，并在黑暗中于4℃下用干燥劑保藏直至顯影時間。載玻片在4℃ Kodak Dektol顯影液中顯影4分鐘，在4℃dH2O中浸泡4次，在4℃ Kodak定影液中放置4分鐘。載玻片用dH2O沖洗，按如下進行標準H&E染色。
載玻片在dH2O中沖洗，并通過載玻片的轉移經過下列一系列用蘇木精和曙絲染色在甲醛/乙醇(100ml甲醛、900ml 80％乙醇)中5分鐘；于水中洗滌3次總共2分鐘；在0.75％ Harris蘇木精(Sigma)中5分鐘；在水中洗滌3次總共2分鐘；4次浸泡在1％碳酸鋰中；在水中10分鐘；在0.5％曙紅(Sigma)中2分鐘；在水中洗3次總共2分鐘；在70％乙醇中2分鐘；在95％乙醇中3次1分鐘洗滌；在100％乙醇中兩次1分鐘洗滌；兩次2分鐘在二甲苯洗滌。用Cytoseal 60(Stephens Scientific，Riverdale，NJ)封閉載玻片。
用反義PDE8A探針獲得的信號與正義PDE8A探針產生的對照信號相比較，對反義探針特異的信號可認為代表PDE8A的表達。在整個小腦的大部分、睪丸輸精小管的一個細胞亞群中、骨骼肌仍未確定來源的分散細胞中、卵巢粒膜細胞和卵巢基質中、腎Henle襻的上皮細胞中和心臟一些小動脈的平滑肌中檢測到PDE8A的信號。
這些結果不同于通過實施例6中所述Northern雜交所獲得的結果，因為由Northern雜交在心臟檢測到中等信號，而使用此心臟樣品的原位數據給出弱信號。這種不一致反應來自不同個體組織中的差異或者兩種方法固有的測檢差異的水平。卵巢中的信號和腎中的信號表明PDE8A分別參與排卵或鹽和/或水自身穩定。
對本領域的那些熟練技術人員預期發生如在上面說明的實施例中所陳述的本發明的許多修改和變化方法。因而只有出現在附加權利說明中的限制應放在本發明中。
序列表<110>Loughney，Kate<120>磷酸二酯酶8A<130>27866/35047<140>
<141>
<150>08/951,648<151>1997-10-16<160>48<170>PatentIn Ver. 2.0<210>1<211>2298<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(2298)<220>
<221>misc_feature<222>(868)..(870)<223>
核苷酸868-870所編碼的氨基酸是Pro或Leu<400>1ttg aca gat gaa aaa gtg aag gca tat ctt tct ctt cac ccc cag gta 48Leu Thr Asp Glu Lys Val Lys Ala Tyr Leu Ser Leu His Pro Gln Val1 5 10 15tta gat gaa ttt gta tct gaa agt gtt agt gca gag aca gta gag aaa 96Leu Asp Glu Phe Val Ser Glu Ser Val Ser Ala Glu Thr Val Glu Lys20 25 30tgg ctg aag agg aag aac aac aaa tca gaa gat gaa tcg gct cct aag 144Trp Leu Lys Arg Lys Asn Asn Lys Ser Glu Asp Glu Ser Ala Pro Lys35 40 45gaa gtc agc agg tac caa gat acg aat atg cag gga gtt gta tat gaa 192Glu Val Ser Arg Tyr Gln Asp Thr Asn Met Gln Gly Val Val Tyr Glu50 55 60cta aac agc tat ata gaa caa cgg ttg gac aca gga gga gac aac cag 240Leu Asn Ser Tyr Ile Glu Gln Arg Leu Asp Thr Gly Gly Asp Asn Gln65 70 75 80
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<211>779<212>蛋白質<213>人<400>6Met Arg Ile Glu Glu Arg Lys Ser Gln His Leu Thr Gly Leu Thr Aspl 5 10 15Glu Lys Val Lys Ala Tyr Leu Ser Leu His Pro Gln Val Leu Asp Glu20 25 30Phe Val Ser Glu Ser Val Ser Ala Glu Thr Val Glu Lys Trp Leu Lys35 40 45Arg Lys Asn Asn Lys Ser Glu Asp Glu Ser Ala Pro Lys Glu Val Ser50 55 60Arg Tyr Gln Asp Thr Asn Met Gln Gly Val Val Tyr Glu Leu Asn Ser65 70 75 80Tyr Ile Glu Gln Arg Leu Asp Thr Gly Gly Asp Asn Gln Leu Leu Leu85 90 95Tyr Glu Leu Ser Ser Ile Ile Lys Ile Ala Thr Lys Ala Asp Gly Phe100 105 110Ala Leu Tyr Phe Leu Gly Glu Cys Asn Asn Ser Leu Cys Ile Phe Thr115 120 125Pro Pro Gly Ile Lys Glu Gly Lys Pro Arg Leu Ile Pro Ala Gly Pro130 135 140Ile Thr Gln Gly Thr Thr Val Ser Ala Tyr Val Ala Lys Ser Arg Lys145 150 155 160Thr Leu Leu Val Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Arg Phe Pro Arg Gly165 170 175Thr Gly Leu Glu Ser Gly Thr Arg Ile Gln Ser Val Leu Cys Leu Pro180 185 190Ile Val Thr Ala Ile Gly Asp Leu Ile Gly Ile Leu Glu Leu Tyr Arg195 200 205His Trp Gly Lys Glu Ala Phe Cys Leu Ser His Gln Glu Val Ala Thr210 215 220Ala Asn Leu Ala Trp Ala Ser Val Ala Ile His Gln Val Gln Val Cys225 230 235 240Arg Gly Leu Ala Lys Gln Thr Glu Leu Asn Asp Phe Leu Leu Asp Val245 250 255
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<223>人工序列描述引物
<400>42caactcgaat tccttgacag attagcatac 30<210>43<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列描述引物
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<223>人工序列描述引物<400>48gatcggatcc accatggact acaagg 2權利要求
1.編碼PDE8多肽片段或類似物的多核苷酸，其中所述多核苷酸在適度嚴格條件下與SEQ ID NO1中所示的多核苷酸序列的互補序列雜交，所述適度嚴格條件包括在65℃下在2×SSC和0.1％ SDS的終洗滌；其中所述PDE8多肽片段或類似物保留PDE8生物活性。2.編碼PDE8多肽片段或類似物的多核苷酸，其中所述多核苷酸在適度嚴格條件下與SEQ ID NO3中所示的多核苷酸序列的互補序列雜交，所述適度嚴格條件包括在65℃下在2×SSC和0.1％ SDS的終洗滌；其中所述PDE8多肽片段或類似物保留PDE8生物活性。
3.編碼PDE8多肽片段或類似物的多核苷酸，其中所述多核苷酸在適度嚴格條件下與SEQ ID NO5中所示的多核苷酸序列的互補序列雜交，所述適度嚴格條件包括在65℃下在2×SSC和0.1％ SDS的終洗滌；其中所述PDE8多肽片段或類似物保留PDE8生物活性。
4.由權利要求1-3中任一項的多核苷酸編碼的多肽。
5.權利要求1-3中任一項的多核苷酸，它是DNA分子。
6.權利要求5的多核苷酸，其中DNA是全部或部分化學合成的DNA分子。
7.一種特異地與權利要求1-3中任一項的多核苷酸雜交的反義多核苷酸。
8.一種包含根據權利要求1-3中任一項的多核苷酸的表達構建物。
9.一種用根據權利要求1-3中任一項的多核苷酸或權利要求8的表達構建物轉化或轉染的宿主細胞。
10.一種制備PDE8多肽片段或類似物的方法，該方法包括步驟在適合PDE8多肽片段或類似物表達的條件下生長根據權利要求9的宿主細胞；和從來自生長培養基的宿主細胞分離PDE8多肽片段或類似物。
11.一種與根據權利要求4的PDE8多肽片段或類似物能特異免疫反應的抗體。
12.根據權利要求11的抗體，它是單克隆抗體。
13.分泌根據權利要求12的抗體的雜交瘤。
14.能與根據權利要求11的抗體特異免疫反應的抗獨特型抗體。
15.一種鑒定PDE8多肽片段或類似物的特異結合伙伴化合物的方法，包括步驟在允許化合物和PDE8多肽片段或類似物結合的條件下將權利要求4的PDE8多肽片段或類似物和化合物接觸；檢測化合物與PDE8多肽片段或類似物的結合；和鑒定作為PDE8多肽片段或類似物的特異結合配偶體的化合物。
16.根據權利要求15的方法，其中在步驟b)中檢測PDE8多肽片段或類似物的活性的調節。
17.根據權利要求16的方法，其中在步驟b)中檢測PDE8多肽片段或類似物的活性的抑制。
18.根據權利要求16的方法，其中在步驟b)中檢測PDE8多肽片段或類似物的活性的增強。
19.一種鑒定編碼PDE8多肽片段或類似物的多核苷酸的特異結合伙伴化合物的方法，包括步驟在允許化合物和多核苷酸結合的條件下將權利要求1-3中任一項的多核苷酸和化合物接觸；檢測化合物與多核苷酸的結合；和鑒定作為多核苷酸的特異結合配偶體的化合物。
20.根據權利要求19的方法，其中在步驟b)中檢測多核苷酸編碼的PDE8多肽片段或類似物的表達的調節。
21.根據權利要求20的方法，其中在步驟b)中檢測多核苷酸編碼的PDE8多肽片段或類似物的表達的抑制。
22.根據權利要求20的方法，其中在步驟b)中檢測多核苷酸編碼的PDE8多肽片段或類似物的表達的增強。
全文摘要
本發明提供了人PDE8多肽，編碼該多肽的多核苷酸，包括該多核苷酸的表達構建體，用該表達構建體轉化的宿主細胞；產生PDE8多肽的方法；反義多核苷酸；以及特異性與PDE8多肽起免疫反應的抗體。
文檔編號C12N15/11GK1800399SQ20051011376
公開日2006年7月12日 申請日期1998年10月16日 優先權日1997年10月16日
發明者K·諾克內 申請人:艾科斯有限公司