人hNIF3－s基因序列、其編碼蛋白及制備方法

專利名稱：人hNIF3－s基因序列、其編碼蛋白及制備方法
技術領域：
本發明涉及一種新的人基因和蛋白，尤其涉及一種人hNIF3-s基因的核酸序列、其編碼蛋白；此外，本發明還涉及該基因編碼蛋白的制備方法。
背景技術：
受半乳糖基因GAL4調節的轉錄過程在葡萄糖培養基中受到抑制，NGG1基因在這過程中必不可少。實驗證明NGG1抑制了GAL啟動子的功能(EMBO J 1993 Dec15；12(13)5255-65)(J Biol Chem 1996 Apr 19；271(16)9298-306)。進一步的研究表明，NGG1基因與另外兩個基因一起，雙向調節(刺激或者抑制)著酵母中一簇轉錄激活相關蛋白(J Biol Chem 1997 Feb 28；272(9)5571-8)。這樣，NGG1基因間接地影響到酵母的生長周期、復制周期，進一步影響到以酵母為生產載體的工程的工程效率。
NGG1基因本身也受到幾種蛋白的制約調節作用，這其中便包含了NGG1相互作用蛋白因子3(NGG1-INTERACTING FACTOR 3，NIF3)。NIF3作用于NGG1，同樣級聯影響了酵母中若干基因的轉錄過程，從而又影響了酵母的生長周期(Yeast 13，1077-1090(1997))。
本發明中，我們在人類造血干細胞中克隆到Saccharomyces cerevisiae NIF3基因的同源基因hNIF3-s。
在本發明之前，還沒有出現涉及本發明的人hNIF3-s蛋白的公開報道。

發明內容
本發明要解決的技術問題之一是提供一種新的人基因hNIF3-s(GenbankAccession No.AF182416)，該基因是一個人hNIF3-s蛋白基因。
本發明要解決的技術問題之二是提供一種新的人hNIF3-s蛋白質。
本發明要解決的技術問題之三是提供一種利用基因重組技術生產上述新的人hNIF3-s蛋白的方法。
為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人hNIF3-s蛋白質活性的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第236-1291位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第236-1291位的核苷酸序列雜交。
較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的蛋白質。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第236-1291位的核苷酸序列。
在本發明的另一方面，提供了一種分離出的人hNIF3-s蛋白質，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的蛋白質、或其保守性變異蛋白質、或其活性片段，或其活性衍生物。
較佳地，該蛋白質選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的蛋白質；(b)將SEQ ID NO.7氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO.7氨基酸序列相同活性的由(a)衍生的蛋白質。
更佳地，所述蛋白質是具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的蛋白質。
在本發明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉化的宿主細胞。在一個實例中該宿主細胞是大腸桿菌；在另一實例中，該宿主細胞是真核細胞。
在本發明的另一方面，還提供了一種產生具有活性的人hNIF3-s蛋白質的方法，該方法包括(1)將編碼人hNIF3-s蛋白質的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人hNIF3-s蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第236-1291位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人hNIF3-s蛋白的重組細胞；(3)在適合表達人hNIF3-s蛋白質的條件下，培養步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出有活性的人hNIF3-s蛋白質。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第236-1291位的序列。
本發明還提供了與人hNIF3-s蛋白質特異性結合的抗體。
在本發明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組份分開，而且已經與在細胞中伴隨其的蛋白質分開。
在本發明中，術語“人hNIF3-s蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hNIF3-s蛋白質活性的核苷酸序列，如SEQ ID NO.6中第236-1291位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的編碼框第236-1291位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.6中第236-1291位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第236-1291位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。其中，“嚴緊條件”是指核苷酸序列在膜上雜交后的洗膜條件。例如，在本領域中，低嚴緊度洗膜可以在雜交管中倒入150ml左右洗液，放入雜交膜，室溫持續搖動20分鐘左右，而高嚴緊度洗膜可以是在雜交管中倒入200ml左右洗液，放入雜交膜，50℃搖床中持續搖動20分鐘左右。該術語還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸第236-1291位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人hNIF3-s相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
在本發明中，“基本純的”蛋白質或多肽是指其至少占樣品總物質的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態下的伴隨其的組分。
在本發明中，術語“人hNIF3-s蛋白質”指具有人hNIF3-s蛋白活性的SEQ ID NO.7序列的蛋白質。該術語還包括具有與人hNIF3-s相同功能的、SEQ ID NO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括hNIF3-s蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發明人hNIF3-s蛋白的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與人hNIF3-s的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hNIF3-s蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他蛋白質，如包含人hNIF3-s多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的蛋白質外，本發明還包括人hNIF3-s蛋白質的可溶性片段。通常，該片段具有人hNIF3-s多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。
在本發明中，“hNIF3-s保守性變異蛋白質”指與SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成蛋白質。
本發明還包括人hNIF3-s蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人hNIF3-s蛋白質的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些蛋白質包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質粒，粘粒等。在生產本發明的人hNIF3-s多肽時，可以將hNIF3-s編碼序列可操作地連于表達調控序列，從而形成人hNIF3-s蛋白表達載體。
在本發明中，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
本發明還提供了對人hNIF3-s蛋白質特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發明中，可以使用一系列本領域已知的方法來制備針對hNIF3-s特異的抗體。例如，將提純的人hNIF3-s基因產物或它的抗原片段注射入動物體內以產生多克隆抗體。同樣，表達人hNIF3-s或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產生抗體。根據本發明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術制備(例如，Kohler et al.，Nature 256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511，1976Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292，1976)。本發明的抗體包括可以阻抑hNIF3-s功能的抗體，也可以是不影響人hNIF3-s功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人hNIF3-s基因產物的片段或功能域致免疫而產生，而人hNIF3-s基因產物及其片段可以用重組方法產生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的hNIF3-s基因產物結合的抗體，可以通過用在原核細胞例如E.coli中產生的基因產物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結合的抗體，可以通過用在真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產生的基因產物的來免疫動物而得到。
本發明的人hNIF3-s抗體可以用來鑒定表達人hNIF3-s蛋白或多肽的細胞，如Jurkat T細胞。例如，可以用一種可檢測的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來標記hNIF3-s特異抗體，然后讓人hNIF3-s特異抗體與細胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測出與hNIF3-s特異抗體結合的細胞。
除了在細胞表面檢測人hNIF3-s外，還可以用Western印跡技術分析該蛋白質。細胞裂解液可以從培養細胞或取自病人的組織標本如腎上腺中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞提取物(同時將提純的人hNIF3-s多肽作為陽性對照)，接著通過電泳雜交將其轉移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測hNIF3-s多肽，可以使用典型的抗體結合檢測方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測方法。并可使用免疫接種血清或不相關的單克隆抗體作為非特異反應的對照。
還可用Nothern印跡法技術分析hNIF3-s基因產物的表達，即分析人hNIF3-s的RNA轉錄物在細胞中的存在與否和數量。
人hNIF3-s DNA的Nothern印跡分析和人hNIF3-s特異抗體的Western印跡分析還可以聯合使用，以證實人hNIF3-s在生物樣本中的表達。人hNIF3-s DNA還可以用于Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位于染色體上，并可進行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關基因。
hNIF3-s同源物也可以用針對hNIF3-s蛋白或多肽的抗體來識別。例如，可以用標準的方法對商品化的或者用已知方法構建的，來自細胞或者組織例如腎上腺的表達文庫進行篩選。將文庫倒入平皿，菌落轉移到一張硝化纖維素膜上，使表達的重組蛋白結合到膜上。然后就可以用特異性的人hNIF3-s抗體進行典型的抗體結合和檢測。用這種方法所識別出克隆中的DNA插入序列，可以進一步用DNA限制性內切酶分析和DNA測序進行分析以評價它與hNIF3-s基因的相似性。新識別的基因的組織表達分布可以同樣地按上述方法進行分析。
本發明的人hNIF3-s核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的eDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
本發明的人hNIF3-s蛋白可以施用于病人，以治療或減輕因人hNIF3-s缺失、無功能或異常而導致的有關病癥，還可以用基于本發明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。


圖1是本發明的人hNIF3-s蛋白與Saccharomyces cerevisiae NIF3蛋白的氨基酸序列(GenPept Accession No.P53081)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出，相似的氨基酸用“+”標出。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。
以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1hNIF3-s基因的克隆1.組織分離(Tissue isolation)造血干細胞來源于5個正常成年男性供體，在死后四小時內取出造血干細胞，立即置于液氮中冷凍保存。
2.mRNA的分離(mRNAisolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NX，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文庫的構建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉錄引物見SEQ ID NO.1。補平末端后，加含EcoRI切點的接頭，接頭序列分別見SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內切酶消化1.5小時，再進行片段分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)進行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF’(Stratagene，CA9203，USA)細菌。涂板并測定滴度。
4.測序及數據庫建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴增后抽提質粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3′端和5′端的通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行EST大規模測序。測序結果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸到SUN Ultra 450 Server上進行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數據庫(Genebnnk+EMBL)，將無同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數據庫。
5.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎上，進行cDNA全長克隆，分兩階段進行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針搜尋dbEST數據庫，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達序列標簽(Expressed sequence Tag，簡稱“EST”)序列認為同一序列(consensus sequence)，取出并用Autoassembler軟件進行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用Strider軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(OpenReading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長完整性如何。通過電子克隆的方法，通常可獲取人hNIF3-s基因的全長序列。
(2)cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長，則在已有序列的5′或3′端設計引物，在人類造血干細胞Marathon-Ready cDNA文庫(Clontech Lab，Inc，USA)中進行長距離PCR反應。然后對PCR產物克隆、測序。用Autoassembler及Strider軟件分析被延長的序列有無完整的ORF，如無，重復上述過程直至獲得全長。
(3)RT-PCR對于5′和3′端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無法從已有的公共數據庫或自身數據庫獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5′端設計引物，3′端引物采用Oligo-dT，在造血干細胞總RNA庫中進行擴增。然后對產物進行克隆、測序。最后拼接并獲得全長。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的人hNIF3-s蛋白的全長編碼序列。在拼接得到全長(至少包含完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物R15′-TATCTTGGTGCTG-CAGAGGA-3′(SEQ ID NO.4)為正向引物，寡核苷酸R25′-CCCTCGAAGACACTCTCTGG-3′(SEQ ID NO.5)為反向引物，以造血干細胞的總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，R1/R2的PCR條件為94℃5分鐘，隨之以94℃30秒、60℃30秒和72℃1分鐘進行35個循環，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，獲得擴增片段長度為1398bp。然后按常規方法以PCR擴增產物進行克隆、測序，獲得SEQ ID NO.6所示的序列。
實施例2人hNIF3-s基因的序列信息與同源性分析本發明新的人hNIF3-s全長cDNA(GenBank Accession No.AF182416。在本申請之前未公開過)的長度為1398bp，詳細序列見SEQ ID NO.6，其中開放讀框位于236-1291位核苷酸。根據全長cDNA推導出人hNIF3-s的氨基酸序列，共351個氨基酸殘基，分子量39004.57，pI為5.91。詳細序列見SEQ ID NO.7。
將hNIF3-s的蛋白質序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數據庫中進行蛋白質同源性檢索，結果發現它與Saccharomyces cerevisiae的NIF3基因存在一定的同源性。在氨基酸水平上，它與Saccharomyces cerevisiae NIF3蛋白(GenPept Accession No.P53081)的第1-280位氨基酸殘基有28.3％的相同性和56.6％的相似性(圖1)。由上可見，hNIF3-s基因與Saccharomyces cerevisiac NIF3基因在蛋白水平上存在較高的同源性，可以認為兩者在功能上也可能有很高相似性。
由于本發明的人hNIF3-s蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來源于其他物種(如Saccharomyces cerevisiae)的同族蛋白相比，預計在施用于人時將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內的免疫原性更低或沒有)。
實施例3人hNIF3-s基因的組織表達譜電子Northern表達譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem Biophys ResCommun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwnng DM，et al.，Circulation 1997 Dec 16；96(12)4146 4203)，將人hNIF3-s cDNA序列在GCG軟件包中的humanEST數據庫中做BLAST檢索，在得到的人類EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST有上百個，可視為該基因在組織中的轉錄表達本，由此得出表達該基因的組織譜，發現其在松果體腺、腎臟、神經上皮腫瘤、肝臟、脾臟、胎盤、嬰兒心臟、胎兒肝臟、睪丸、胎腦等等組織中有表達，表明它在人體這些組織器官中發揮著重要作用。
實施例4人hNIF3-s蛋白質的制備和提純在該實施例中，將全長的人hNIF3-s編碼序列或片段構建入商品化的蛋白質融合表達載體之中，以表達和提純重組蛋白。
1.將人hNIF3-s多肽以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進行原核表達。
(1)原核表達載體的構建，以及轉化大腸桿菌根據人hNIF3-s的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(分別對應于編碼序列5’和3’端的約20個以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這根據選用的pGEX-2T載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，將人hNIF3-s基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑒定好的表達載體利用CaCl2方法轉入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-hNIF3-s表達載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-hNIF3-s。
(2)表達GST-hNIF3-s重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-hNIF3-s工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中振搖培養過夜，按1∶100的濃度吸取培養液于新的LB培養基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養約3小時，至OD600達0.5后，加入IPTG至終濃度1mol/L繼續于37℃分別培養0，1，2，3小時。取培養時間不同的1ml菌液離心，在細菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導時間增加而增加的菌株即為表達GST-hNIF3-s融合蛋白的工程菌。
(3)GST-hNIF3-s融合蛋白的提取純化按上述方法誘導表達GST-hNIF3-s融合表達蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hNIF3-s。誘導后的細菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細菌，超聲破碎細菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結合了GST-hNIF3-s的谷胱苷肽Sepharose 4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μlPBS的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10μl還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進行SDS-PAGE電泳，檢測純化效果。在39kDa處的蛋白質條帶即為人hNIF3-s蛋白。
實施例6人hNIF3-s蛋白或多肽在昆蟲細胞中進行真核細胞表達。
1.人hNIF3-s桿狀病毒表達載體的構建及轉染Sf9昆蟲細胞株根據人hNIF3-s的全長編碼序列(SEQ ID NO.6)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，將人hNIF3-scDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTM ACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無血清的昆蟲培養基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲細胞懸液于60mm組織培養板中，貼壁1小時后換轉染培養基，室溫孵育15分鐘后棄培養基，加入前面制備好的DNA載體轉染混合物，Parafilm密封培養板，于室溫27℃振搖培養4小時，而后換完全培養基培養3天，收集上清備用。
2.轉入重組表達載體的昆蟲細胞株的篩選鑒定轉染3天后的昆蟲細胞用新鮮培養基制成細胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細胞懸液置于60mm組織培養皿中，加入3ml培養基，100μl收集的培養上清，貼壁1小時，棄2ml培養基，繼續室溫培養1小時，棄去所有的培養基，加入預熱的含20μl4％X-gal的3ml半固體培養基，培養5-7天后挑取白色細胞克隆于96孔培養板中培養3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆蟲細胞。
收集感染的細胞進行Western鑒定。將細胞裂解后進行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的Multiphor II半干電轉移儀中將蛋白質轉印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時，而后于抗人hNIF3-s的抗體溶液中封閉1小時，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標記的抗人hNIF3-s一抗的第二抗體溶液中振搖1小時，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復合物反應30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達人hNIF3-s的Sf9細胞克隆。
3.人hNIF3-s蛋白的提取純化用高表達人hNIF3-s的Sf9細胞克隆的上清大量感染Sf9細胞，感染48小時后收集細胞，PBS洗滌。每2×108細胞加入20ml細胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mM Na3P04(磷酸鈉，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mM Pefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細胞，12000×g離心20min去除細胞碎片，上清按每2×108的細胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mM N，N’-二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進行SDS-PAGE電泳檢測提取的人hNIF3-s蛋白的純度。在39kDa處的蛋白質條帶即為人hNIF3-s蛋白。
實施例6抗人hNIF3-s抗體的制備1.免疫小鼠和脾細胞的制備將實施例5和實施例6中獲得的人hNIF3-s蛋白用層析法進行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細胞制備見鄂征主編，《組織培養和分子細胞學技術》，北京出版社，第210頁。
2.按《組織培養和分子細胞學技術》(同上)，第371頁中的方法，制備飼養細胞。
3.按《組織培養和分子細胞學技術》(同上)，第213頁中的方法，進行細胞融合。
4.抗體的檢測在細胞融合10-15天后，需逐孔進行檢查，一旦發現旺盛的雜交細胞集落生長，就應用人hNIF3-s蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗、發射免疫試驗(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進行克隆培養，并分離出抗體。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>人hNIF3-s基因序列、其編碼蛋白及制備方法<130>NP-10242<160>7<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT 50<210>2<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>接頭序列<400>2AATTCGGCAC GA G13
<210>3<211>9<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>接頭序列<400>3GCCGTGCTC 9<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4TATCTTGGTGCTGCAGAGGA 20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5CCCTCGAAGACACTCTCTGG 20<210>6<211>1398<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(236)..(1291)<400>61 TATCTTGGTG CTGCAGAGGA CAGCAGAAGA GGAGATTGGG TCAGAAAACT51 GCCCTGCCGC ACCAGAGCAC AGCGCACTAG TGGGACAGGG GTCCTGACTC101 AGACTTAACT GGCTGTGTTC GTGGTTTTTC ACTGTCCTGG AAAAGGCCTG151 AAGTGGCACT GAAATGAGGC ATAGATGAGT CCCCACGACA GTCCGGTTTG201 TAGATTCCCT GATCTGCAAT TCTTCCCGTT CCTTCATGGA TTTGAAGGCT251 CTCCTTTCTT CCTTGAATGA CTTTGCATCC CTCTCGTTTG CTGAGAGTTG301 GGACAATGTT GGATTACTGG TGGAACCAAG CCCACCACAT ACTGTAAATA351 CACTCTTCCT GACCAATGAC CTGACTGAGG AAGTGATGGA GGAGGTGCTG401 CAAAAGAAGG CAGACCTCAT TCTCTCCTAC CATCCGCCTA TCTTCCGACC
451 CATGAAGCGC ATTAACCTGG AACACATGGG AAGGGAGCGC CTGGTGATCC501 GGGCTCTGGA GAACAGAGTC GGTATCTACT CTCCTCATAC AGCCTATGAT551 GCTGCGCCCC AGGGCGTCAA CAACTGGTTG GCTAAAGGGC TTGGAGCTTG601 TACCTCCAGG CCCATACATC CTTCCAAAGC TCCCAACTAC CCTACAGAGG651 GAAACCACCG AGTAGAATTC AACGTTAACT ACACCCAAGA CCTGGACAAA701 GTCATGTCTG CAGTGAAAGG AATTGACGGT GTTTCTGTCA CTTCTTTTTC751 TGCTAGGACT GGTAATGAGG AACAAACACG GATTAATCTG AATTGTACTC801 AGAAGGCTTT GATGCAGGTG GTAGATTTTC TTTCCCGGAA CAAACAACTT851 TATCAGAAGA CGGAAATTCT GTCACTGGAG AAGCCTTTGC TTCTACATAC901 TGGAATGGGA CGGTTATGCA CACTGGATGA ATCTGTCTCC CTGGCAACCA951 TGATTGATCG AATAAAAAGA CACCTAAAAC TATCTCATAT TCGCTTAGCC1001 CTTGGGGTGG GGAGAACCTT AGAGTCTCAA GTCAAAGTCG TGGCCCTGTG1051 TGCTGGTTCT GGGAGCAGCG TTCTGCAGGG TGTTGAGGCT GACCTTTACC1101 TCACAGGTGA GATGTCCCAT CATGATACTT TGGATGCTGC TTCCCAAGGA1151 ATAAATGTCA TCCTCTGTGA ACACAGCAAC ACTGAACGAG GCTTTCTTTC1201 TGACCTTCGA GATATGCTGG ATTCTCACTT GGAGAATAAG ATAAATATTA1251 TCCTATCAGA GACTGACAGG GACCCTCTTC AGGTGGTATA ATTGCAGAAA1301 CATCAGGATA ACACATTCTA CAAATCAGCT GGATGCCAAC TTAAATTTGT1351 AACATGAGTC AGTGGGACTG GTGTGCTTCC AGAGAGTGTC TTCGAGGG<210>7<211>351<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)<400>71 MDLKALLSSL NDFASLSFAE SWDNVGLLVE PSPPHTVNTL FLTNDLTEEV51 MEEVLQKKAD LILSYHPPIF RPMKRINLEH MGRERLVIRA LENRVGIYSP101 HTAYDAAPQG VNNWLAKGLG ACTSRPIHPS KAPNYPTEGN HRVEFNVNYT151 QDLDKVMSAV KGIDGVSVTS FSARTGNEEQ TRINLNCTQK ALMQVVDFLS201 RNKQLYQKTE ILSLEKPLLL HTGMGRLCTL DESVSLATMI DRIKRHLKLS251 HIRLALGVGR TLESQVKVVA LCAGSGSSVL QGVEADLYLT GEMSHHDTLD301 AASQGINVIL CEHSNTERGF LSDLRDMLDS HLENKINIIL SETDRDPLQV351 V
權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hNIF3-s蛋白質活性的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第236-1291位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQID NO.6中從核苷酸第236-1291位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示序列的蛋白質。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第236-1291位的核苷酸序列。
4.一種分離出的人hNIF3-s蛋白質，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的蛋白質、或其保守性變異蛋白質、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的蛋白質，其特征在于，該蛋白質選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的蛋白質；(b)將SEQ ID NO.7氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO.7氨基酸序列相同活性的由(a)衍生的蛋白質。
6.如權利要求4或5所述的蛋白質，其特征在于，所述蛋白質是具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的蛋白質。
7.一種載體，其特征在于，它包含權利要求1所述的DNA。
8.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求7所述的載體。
9.一種產生具有活性的人hNIF3-s蛋白質的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)將編碼人hNIF3-s蛋白質的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，形成人hNIF3-s蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第236-1291位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉入宿主細胞，形成人hNIF3-s蛋白的重組細胞；(3)在適合表達人hNIF3-s蛋白質的條件下，培養步驟(2)中的重組細胞；(4)分離出有活性的人hNIF3-s蛋白質。
10.一種能與權利要求4所述的人hNIF3-s蛋白質特異性結合的抗體。
全文摘要
本發明公開了一種在人體造血干細胞中表達的人hNIF3－s基因序列及其編碼蛋白，本發明還公開了該蛋白的制備方法，以及提供了與人hNIF3－s蛋白質特異性結合的抗體。本發明的人hNIF3－s蛋白可以施用于病人，以治療或減輕因人hNIF3－s蛋白缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。
文檔編號C12P21/02GK1978645SQ20051011105
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月1日 優先權日2005年12月1日
發明者黃健, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心