一種利用家畜乳腺高效生產人溶菌酶的方法

專利名稱：一種利用家畜乳腺高效生產人溶菌酶的方法
技術領域：
本發明屬于基因工程領域，更具體的，本發明涉及一種乳腺特異性表達融合基因，以及一種制備乳汁中可高效表達溶菌酶的轉基因家畜的方法。
背景技術：
天然的溶菌酶是一種在動物界和植物界中廣泛存在的多肽類糖苷酶。1922年Alexander Flemin發現多種粘液組織和分泌物以及雞蛋清中存在能夠溶解多種革蘭氏陽性細菌的物質。他把這種溶解因子稱為溶菌酶。Flemin發現溶菌酶在軟骨組織和胃的勻漿液、淚液、唾液、痰、鼻腔分泌物、病理性的尿液、血清和淋巴細胞中都有存在，但在健康的尿液、腦脊髓液或汗液中沒有溶菌酶。1963年Jolles和Canfield各自獨立闡明了雞蛋清來源的溶菌酶的一級結構。1965年Phillips基于X-射線結晶學描繪了溶菌酶的三維結構。
溶菌酶可分為三種類型源于雞蛋卵清的c型、源于鵝蛋卵清的g型和源于噬菌體的溶菌酶。三者有相似的三維結構，但氨基酸序列不同。目前已知溶菌酶發揮生物學活性主要通過兩種方式一種是直接作用，即通過降解細菌細胞壁肽聚糖(polypeptidoglycan)中N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)間的β(1→4)糖苷鍵的連接，破壞肽聚糖支架，引起細菌裂解。由于革蘭氏陽性細菌(G+細菌)的細胞壁幾乎全部由肽聚糖組成，而革蘭氏陰性細菌(G-細菌)只有內壁層為肽聚糖，因此，溶菌酶可高效破壞G+細菌的細胞壁，而對G-細菌的作用不大。間接作用就是通過降解細菌細胞膜中的粘多糖片段引發一些尚未明確的免疫激活，刺激巨噬細胞的噬菌活性。這種間接作用已在大鼠中得到證明，完整的細菌不引發巨噬細胞的噬菌作用，相反經溶菌酶處理過的細菌能夠被迅速吞噬。另外溶菌酶分子本身的陽離子和疏水的特性也有助于其殺菌活性的發揮。人和動物細胞無細胞壁結構亦無肽聚糖，因此溶菌酶對人體細胞無毒性作用。
目前已知的溶菌酶的主要作用有1)抗菌消炎作用。溶菌酶的溶菌活性使其在預防和治療多種細菌性疾病中具有重要作用，如由鏈球菌家族微生物引起的耳炎、竇炎、腺炎、尿道炎、陰道炎等。它還可結合并失活各種誘發炎癥的酸性物質，能增強抗生素和其它藥物的療效等。2)抗病毒作用。溶菌酶的正離子特性使其可結合帶負電荷的病毒蛋白使其失活。3)增強免疫力。溶菌酶作為一種存在于人體正常體液及組織中的非特異性免疫因素，可以改善和增強巨噬細胞的吞噬和消化能力，激活白細胞的吞噬功能，并改善細胞抑制劑所導致的白細胞減少等。4)止血、鎮痛等作用。
上述溶菌酶的廣泛作用表明了其藥用的廣闊前景，具有極大的市場。但是目前溶菌酶在用于臨床時受到了三大因素的制約1)天然人溶菌酶很難大量獲得。目前人乳汁和胎盤是獲得天然人LYZ的唯一來源，但這些材料相當有限，使產品的價格過于昂貴。2)來源于其它物種的溶菌酶會引起許多副作用，如蛋清來源的可引起過敏反應，牛源的具有傳染瘋牛病的威脅。3)其它動物來源的溶菌酶不適合用于人用藥物，因它們與人溶菌酶間的同源性較低，如雞蛋清源的為56.8％，大鼠的為76.4％，奶牛的為82.3％，馬的為50.8％。
基因工程技術的發展為克服上述限制提供了有效途徑。1986年，Jigami等人利用酵母表達了人溶菌酶，但不具有抑菌活性。Castanon和Yoshimura也做了類似的工作，沒有取得突破。1990年，Archer等人在米曲霉中表達了12mg/l的雞蛋清溶菌酶；Tsuchiya等人在米曲霉中表達了1.2mg/l的人溶菌酶，但均沒有生物活性。可見，酵母和米曲霉并非表達溶菌酶的理想宿主。
近年來，利用植物表達溶菌酶的研究取得了可喜進展。1997年，Nakaiima等人在煙草葉中低水平表達的溶菌酶可以提高植物抗真菌和細菌能力。2000年，Takaichi和Oeda在胡蘿卜中表達了人溶菌酶。Ahreholta等人在馬鈴薯里中表達的T4溶菌酶具有不依賴于植物的年齡和生長環境影響的溶菌活性。2002年，經密碼子優化的人工合成的溶菌酶基因在轉基因的水稻懸浮培養的細胞里得到了表達，表達量達到可溶性蛋白的4％，并具有同人溶菌酶相似的生物活性。由此可見，植物可以表達有活性的人溶菌酶。但是植物與動物間蛋白修飾、剪接等方面的差異將可能影響這種重組蛋白的臨床應用。
哺乳動物乳汁中蛋白的表達水平高，成本低、無污然，而人溶菌酶自身就可在人乳中有相當量的高活性表達(0.4-0.7mg/ml)。1994年Mapa等人利用牛的alpha sl-casein啟動子調控人溶菌酶在轉基因小鼠乳腺中獲得了表達，表達量為0.2～0.7mg/ml。1998年，他們進一步的研究表明這種人溶菌酶具有同標準溶菌酶相同的活性。由于大型乳用家畜(牛和羊等)乳腺的蛋白產量大(每頭奶牛可年產250～300kg乳蛋白，一只綿羊或山羊可年產25～30KG乳蛋白)，因此是大量生產人溶菌酶的理想場所。李寧等在CN 16699405A中公開報道獲得了整合有以PBC1(一種商業化載體，調控序列為山羊的β-酪蛋白)指導人溶菌酶乳腺特異表達框架的轉基因奶牛，但沒有檢測表達情況。
綜上所述，盡管目前已經有人利用轉基因技術和基因調控技術來使動物產生溶菌酶。但是仍然沒有找到可有效使動物高產溶菌酶的基因調控方法。因此，現有技術迫切需要尋找到合適的基因調控區域和調控方法，以最終獲得高產溶菌酶的轉基因動物。

發明內容
本發明的目的是提供一種乳腺特異性表達融合基因。
本發明的另一目的是提供一種制備轉基因動物的方法。
本發明的另一目的是提供一種調控外源基因(如人溶菌酶)在動物乳腺組織中特異性表達的載體。
在本發明的第一方面，提供一種乳腺特異性表達融合基因，該融合基因從5’至3’依次包含以下元件牛β-乳球蛋白的5’側翼序列，人溶菌酶基因，和牛生長激素3’側翼序列。
在本發明的一個優選例中，所述的人溶菌酶基因選自(a)包含信號肽編碼序列，第1-4個外顯子和第1-3個內含子(為基因組DNA)；或(b)包含信號肽編碼序列和成熟蛋白的完整編碼序列(為cDNA)。
在本發明的一個優選例中，所述的融合基因選自(a)具有SEQ ID NO5中1-1260位、1267-6067位和6074-6304位依次連接獲得的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO5所示的核苷酸序列；或(c)與(a)或(b)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
在本發明的第二方面，提供一種制備轉基因動物的方法，包括以下步驟(a)將所述的融合基因與抗性篩選基因共轉染體細胞，獲得基因組中整合有融合基因的轉基因細胞；
(b)將(a)獲得的轉基因細胞作為核供體進行體細胞克隆，獲得可高產人溶菌酶的動物。
在本發明的一個優選例中，在步驟(a)中，所述的細胞為動物胎兒成纖維細胞。
在另一優選例中，采用抗性篩選基因作為篩選工具，獲得基因組中整合有融合基因的轉基因細胞，所述的抗性篩選基因獲自雙標記選擇載體。
在另一個優選例中，所述的雙標記選擇載體為pLNK，包含有串聯的Neo和TK兩個選擇標記基因，兩端各有一個同向排列的Loxp位點。
在本發明的一個優選例中，所述的動物為牛、山羊、綿羊、豬、兔。
在另一個優選例中，所述的動物為山羊。
在本發明的第三方面，提供一種調控外源基因在動物乳腺中特異性表達的載體，該載體含有所述的融合基因。
在本發明的第四方面，提供一種家畜的乳汁，它含有濃度10-8000ug/ml的人溶菌酶。
在另一優選例中，家畜的乳汁中含有濃度50-2000ug/ml的人溶菌酶。
在本發明的第五方面，提供一種生產人溶菌酶的方法，它包括步驟培養用所述方法制得的轉基因動物，從動物乳腺分泌的乳汁中分離純化出表達的人溶菌酶。
在本發明的第六方面，提供一種高產人溶菌酶的轉基因克隆動物的細胞及組織，來自采用所述的方法獲得的乳腺高效表達人溶菌酶的轉基因動物。
本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


圖1pbLGLyz的構建流程示意圖以牛基因組DNA為模板，用PCR法擴增BLG5’側翼序列(-1216～+45bp)，將PCR產物克隆入pGEM-T-easy載體，得質粒pbLG5’。XhoI+SacII雙切重組質粒pTA-BGH獲得300bp大小的牛生長素基因3’UTR(PolyA sequence)，將其回收，克隆到質粒pbLG5’中成pbLGpA.最后再用XhoI將人的溶菌酶基因從pcDNA-LYZ切出后克隆到pbLGpA的XhoI位點，最終成pbLGLyz。
圖2pLNK的結構示意圖。neo和TK基因兩端各有一個同向排列的loxp位點，這一框架可通過SalI單切出，大小3.8kb。
圖3抗性細胞株的PCR和Southern-blot的檢測結果。圖3A為PCR檢測結果，1、2、4、5、6、11、21、26、27、28號克隆可擴增出陽性條帶；圖3B為Southern-blot的檢測結果，5、6和11號有3.2kb的清晰雜交條帶。
圖4存活的5頭人溶菌酶轉基因克隆山羊。
圖5人溶菌酶轉基因克隆山羊的PCR和Southern-blot的檢測結果。
圖6轉基因山羊乳汁中人溶菌酶的表達檢測。
圖7轉基因山羊BLG2乳汁中人溶菌酶的估量。
圖8轉基因山羊BLG1乳汁中人溶菌酶的估量。
圖9Heparin-Sepharose層析柱純化轉基因山羊乳汁中的人溶菌酶。
圖10轉基因山羊乳汁中的溶菌酶的活性分析。乳汁中溶菌酶的活性含量是通過倍比關系較好的稀釋度計算出的活性單位。可見BLG1、BLG2和含2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性分別約為617600U/ml、846400U/ml和308800U/m。
圖11用來源于人的α-乳白蛋白，山羊的β-酪蛋白，牛的α-乳球蛋白，和牛的αS1-酪蛋白的片段與其它功能片斷連接，所構建的各調控構件的結構。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現將牛的β-乳球蛋白5’側翼序列，人溶菌酶基因組DNA序列或cDNA序列，以及牛生長激素3’側翼序列三者的融合基因轉染到細胞中，將該轉基因細胞作為核供體制備轉基因動物，可獲得乳汁中高表達人溶菌酶(＞1mg/ml)的轉基因動物。基于上述發現完成了本發明。
為獲得乳汁中高效表達hLYZ的轉基因山羊，本發明人經過長期研究和試驗，率先構建出了人溶菌酶(hLYZ)的乳腺特異表達構件pbLGLyz。該構件包含奶牛β乳球蛋白基因的5’調控序列、溶菌酶基因組DNA的全部編碼序列和牛生長激素的polyA加尾信號序列。
為方便整合細胞的篩選以及將抗性基因從細胞或個體中刪除，在本發明的優選例中，本發明人使用了一種雙標記表達框架，該框架的兩端各包含一個同向loxp序列；loxp位點中間是可獨立表達的新霉素(neomycin)和TK兩個篩選標記基因。其作用為Neo基因提供細胞轉染過程中的抗性篩選標記，loxp位點和TK基因提供了利用Cre/loxp重組酶系統將雙標記表達框架從細胞中刪除的工具和篩選標記。
為了獲得整合有hLYZ的細胞，在本發明的優選例中，用限制性內切酶NotI將pbLGlyz中的人溶菌酶的乳腺特異表達框架切出，用限制性內切酶SalI將雙標記表達框架切出，將兩種表達框架按5∶1摩爾比混合，電穿孔方法共轉染山羊胎兒成纖維細胞，G418篩選出抗性單克隆細胞株，再通過PCR和基因組Southern-blot的雙重鑒定，獲得人溶菌酶的轉基因細胞。
為獲得人溶菌酶的轉基因山羊，用含hLYZ的轉基因細胞作為供核，山羊的卵母細胞作為供質，進行體細胞克隆。最終獲得了5頭成活克隆羊，經PCR和Southern-blot分析，表明該5頭羊均為人溶菌酶的轉基因山羊，整合率100％，這5頭羊分別命名為BLG1、BLG2、BLG3、BLG4和BLG5。
對BLG1和BLG2兩頭轉基因山羊做人工激素誘導泌乳，獲得的乳汁經SDS-PAGE和Western-blot分析表明人溶菌酶在這兩頭山羊的乳汁都獲得了高效表達，分子量與天然人溶菌酶的分子量相當，約14.6kD。定量分析表明，BLG1的乳汁中人溶菌酶的表達量約為3mg/ml，BLG2的表達量超過了4mg/ml。經溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus bacterial)懸浮液的溶壁活性分析表明，BLG1和BLG2乳汁中的溶菌酶活性分別約為617600U/ml和846400U/ml，添加2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性為308800U/ml(天然人乳中的溶菌酶購自SIGMA公司，L6394)。
經Heparin-Sepharose層析柱純化，本發明人從BLG1泌乳第8天獲得的20ml乳汁中純化了約19.6mg的重組人溶菌酶，經SDS-PAGE薄層掃描分析表明其純度約90％。委托中國科學院上海生化與細胞研究所蛋白質組研究分析中心進行N-末段測序表明，這種溶菌酶與天然人的溶菌酶N-末段的10個氨基酸序列完全相同。
本發明獲得了一種調控外源基因(如人溶菌酶)在動物乳腺組織中特異性表達的載體；利用這一載體，通過細胞轉染技術和體細胞克隆技術獲得了5頭可在乳汁中高效表達高活性hLYZ的轉基因山羊；本發明還提出了一種在轉基因家畜中消除抗性基因干擾轉基因表達的方法。本發明適用于制備乳汁中高效表達人溶菌酶的轉基因牛、山羊、綿羊、豬和兔等。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
I.試驗材料1.1菌種和細胞株E.coli DH5α甘油菌為上海轉基因研究中心保存；薩能奶山羊88#胎兒(35日齡)分離的成纖維細胞株(GEF88#)由上海轉基因研究中心制備并保存；薩能奶山羊，上海轉基因研究中心實驗牧場提供。
1.2質粒載體pGEM-T vector載體購自Promega公司。質粒pcDNA-LYZ、pTA-BGH和pGH4均獲自上海轉基因研究中心。
1.3主要試劑材料各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶、T4 DNA聚合酶購自NEB公司，尼龍膜購自Minipole公司，QIAquick膠回收試劑盒、QIAfilter質粒回收試劑盒購自QIAGEN公司，Ready-to-go同位素標記試劑盒購自Amersham PharmaciaBiotech公司，α-32P-dCTP和Probe Quant探針純化試劑盒同為AmershamBiosciences公司產品。GMEM購于Gibco公司，FBS、bFGF、NEAA、G418、GANC、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、0.25％trypsin/0.02％EDTA溶液均購于Sigma公司，hLIF購于Chemicon公司，FBS購于Biochrom公司，各類細胞培養板(瓶)是Nunc和Costar公司的產品。蛋白酶K購于Promega公司，LA PCR試劑盒購于TAKARA公司，秋水仙素購于Gibco公司，氯前列烯醇(PG)購于上海計劃生育研究所；促卵泡生成素(FSH)購于寧波激素制品廠；促黃體生成釋放激素(LRH)購于上海東風制藥廠；2％靜松靈購于長春農牧大學獸醫研究所；F-10粉劑購于Gibco公司；離子酶素、細胞松弛素B(CB)、6-二甲基氨基嘌呤(6-diethylaminopurine，6-DMAP)、透明脂酸酶、DL-乳酸鈉、青霉素、鏈霉素、DMEM粉劑、M16粉劑及所用NaHCO3等化學試劑均為Sigma公司胚胎培養用產品。Micrococcus lysodeikticus bacterial凍干粉購自上海生工生物工程技術服務有限公司，其他試劑均為國產分析純。
引物合成和測序工作由上海申友生物工程公司合成；蛋白N末端測序工作由中國科學院上海生化與細胞研究所蛋白質組研究分析中心進行；人溶菌酶在乳汁中的表達定量的部分工作由復旦大學人類遺傳研究中心完成。
1.4主要儀器設備Power PAC1000型電泳儀BIO-RAD5154D型離心機EppendorfGENE PULSER II型電轉化儀 BIO-RAD4520S/N型恒溫搖床Forma ScientificT-Gradient型PCR儀BiometraAX80型顯微操作儀 OLYMPUSCO2培養箱Medcenter Einrichtungen GmbHSZ-PT型解剖鏡OLYMPUSEG-40型拉針器NARISHIGEP-30型磨針器 NARISHIGECE-450型電融合儀 KEFAK400型倒置顯微鏡 LeicaBCM-1000A型超凈工作臺蘇州安泰MCO-15A型CO2培養箱 SANYOPTC-100Peltier Thermal Cycler MJ Research.
吸卵針、鎢絲、移卵針、方杯、集卵器、手術器械等。
1.5主要試劑的配制LB培養基1％(w/v)Tryptone，0.5％(w/v)Yeast Extract，1％NaClTE緩沖液(pH8.0)10mmol/l Tris-Cl(pH8.0)，1mmol/l EDTA(pH8.0)
10×TAE0.04mol/l Tris-乙酸，1mmol/l EDTA質粒抽提溶液I50mmol/l葡萄糖，25 mmol/l Tris-Cl(pH8.0)，10mmol/lEDTA(pH8.0)質粒抽提溶液II0.2mol/l NaOH，1％(w/v)SDS質粒抽提溶液III5mol/l乙酸鉀(pH4.8)10×PBS(無Ca2+、Mg2+)NaCl 80.0g，KCl 2.0g，Na2HPO414.4g，KH2PO42.4g，調pH7.2，終體積1000ml封閉液含2％(w/v)BSA的PBS緩沖溶液PBST含0.5％(v/v)Tween-20的PBS緩沖溶液10×底物緩沖液檸檬酸36.6g，K2HPO4113.5g，pH6.0底物反應液OPD 0.2mg，30％H2O250μl，10×底物緩沖液10ml，加水至100mlGEF完全培養液GMEM，10％(v/v)FBS，1×NEAA，10ng/mL bFGF，1000u/mlhLIFGEF選擇培養液GMEM，10％(v/v)FBS，1×NEAA，10ng/ml bFGF，1000u/mlhLIF，500mg/ml G418，2μmol/L GANC細胞裂解液10mol/L TrisCl(pH8.0)，100mmol/L NaCl，25mol/LEDTA(pH8.0)，0.5％(w/v)SDS，100mg/ml蛋白酶K變性液0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl中和液1.5mol/L NaCl，0.5mol/L TrisHCl(pH7.4)洗滌液2×SSC預洗液5×SSC，0.5％SDS，1mol/L EDTA(pH8.0)預雜交液5×SSC，5×Denhard′s，0.5％SDS，100μg/ml鮭精DNA洗膜液I2×SSC，0.5％SDS洗膜液II0.2×SSC，0.5％SDS固定液甲醇∶冰醋酸體積比為1∶3沖卵液PBS，1％FBS(Hyclone)饑餓液10ml50μl FBS，100μl P/S(100×)，100μl L-GW(100×)，9.75mlDMEM
M161.65g M16粉劑，0.035gNaHCO3，0.33ml乳酸鈉(60％)，0.006g青霉素，0.005g鏈霉素，定溶至100ml。
M21.15g F-10粉劑，0.2101 NaHCO3，0.33ml乳酸鈉(60％)，0.006g青霉素，0.005g鏈霉素，定溶至100ml。
融合液0.3mol/L甘露醇、0.1mmol/L MgSO4、0.05mmol/LCaCl2激活液M16，CB，離子霉素，M16，CB，6-DMAP包埋瓊脂糖液含1％瓊脂糖的PBS液透明質酸酶液M2，0.2％透明質酸酶5X轉移存貯液將36.3g Tris-base和44.26g CAPS溶解在1L水中。
陽極緩沖液(100ml)20ml5X存貯液+15ml甲醇+65ml水；陰極緩沖液(100ml)20ml5X存貯液+1ml10％SDS+79ml水。
II.具體實施例實施例1人溶菌酶基因的乳腺特異表達載體的構建按照圖1的流程最終獲得了人溶菌酶基因的乳腺特異表達載體pbLGLyz，構建方法如下根據GENBANK登錄號X14710中的序列設計并合成如下引物5’-cggccgggggtctgctcc-3’(SEQ)ID NO1)，和5’-ctcgagggctgcagctggggtcac-3’(SEQ)ID NO2)。
以牛基因組DNA為模板，用PCR法(94℃，5min；94℃，1min；60℃45s；72℃90s，30個循環)擴增BLG5’側翼序列(-1216～+45bp)，將PCR產物克隆入pGEM-T-easy載體，得質粒pbLG5’。XhoI+SacII雙切重組質粒pTA-BGH獲得300bp大小的牛生長素基因3’UTR(PolyA序列)，將其回收，克隆到質粒pbLG5’中成pbLGpA。最后再用XhoI將人的溶菌酶基因從pcDNA-LYZ切出后克隆到pbLGpA的XhoI位點，最終獲得pbLGLyz表達載體。
獲得的人溶菌酶基因的乳腺特異表達載體pbLGLyz見圖1，包含1.3kb的牛β-乳球蛋白的5’側翼序列(-1216～+45bp)，人溶菌酶的完整基因組編碼基因(四個外顯子和三個內含子)和300bp的牛生長激素的polyA信號序列。牛的β-乳球蛋白指導人溶菌酶基因乳腺特異表達框架的核酸序列序列如下(注1-1260位為牛β-乳球蛋白的調控序列；1267-6067位為人溶菌酶的基因組編碼序列；6074-6304位為牛生長激素的polyA加尾序列；1261-1266、6068-6073位為XhoI的酶切位點)(SEQ ID NO5)。
CGGCCGGGGGTCTGCTCCCGTGGGTGGGCTCTTTCTGGTACAGTCACCAACAGTCTCTCCGGGAAGGAAACCAGAGGCCAGAGAGCAAGCCAGAGCTAGTCTAGGAGATCCCTGAGCCTCCACCCAAGATGCCGACCAGGCCAGCGGGCCCCCTGGAAAGACCCTACAGTCTAGGGGGGGAACAGGAGCCGACCCGCCAGGCCCCCGCTATCAGGAGACACCCCAACCTTGCTCCTGTTCCCCTACCCCAGTACGCCCACCCGACCCCTGAGATGAGTGGTTTACTTGCTTAGAATGTCAATTGAAGGCTTTTGTACCCCCTTTGCCAGTGGCACAGGGCACCCACAGCCCGCTGGGTACTGATGCCCATGTGGACTCAGCCAGGAGGACTGTCCTGCGCCCTCCCTGCTCGGGCCCCCTCCATACTCAGCGACACACCCAGCACCAGCATTCCCACCACTCCTGAGGTCTGAAGGCAGCTCGCTGTGGTCTGAGCGGTGCGGAGGGAAGTGCCCTGGGAGATTTAAAATGTGAGAGGTGGGAGGTGGGAGGTTGGGTCCTGTAGGCCTTCCCATCCCACGTGCCTGCACGGAGCCCTAGTGCTACTCAGTCATGCCCCCGCAGCAGGGGTCAGGTCACTTTCCCATCCTGGGGGTTATTATGACTGTTGTCATTGTTGTTGCCATTTTTGCTACCCTAACTGGGCAGCGGGTGCTTGCAGAGCCCTCGATACTGACCAGGTTCCCCCCTCGGAGCTCGACCTGAACCCCATGTCACCCTCGCCCCAGCCTGCAGAGGGTGGGGTGACTGCAGAGATCCCTTTACCCAAGGCCACAGTCACATGGTTTGGAGGAGATGGTGCCCAAGGCAGAAGCCACCCTCCAGGACACACCTGCCCCCAGTGCTGGCTCTGACCTGTCCTTGTCTAAGAGGCTGACCCCAGAAGTGTTCCTGGCGCTGGCAGCCAGCCTGGACCCAGAGCCTGGACACCCCCTGCGCCCCCACTTCTGGGGCGTACCAGGAACCGTCCAGGCCCAGAGGGGGCCTTCCTGCTTGGCCTCGAATGGAAGAAGGCCTCCTATTGTCCTCGTAGAGGAAGCAACCCCAGGGCCCAAGGATAGGCCAGGGGGGATTCGGGGAACCGCGTGGCTGGGGGCCCGGCCCGGGCTGGCTGGCTGGCCCTCCTCCTGTATAAGGCCCCGAGCCCGCTGTCTCAGCCCTCCACTCCCTGCAGAGCTCAGAAGCGTGACCCCAGCTGCACTCGAGATGAAGGCTCTCATTGTTCTGGGGCTTGTCCTCCTTTCTGTTACGGTCCAGGGCAAGGTCTTTGAAAGGTGTGAGTTGGCCAGAACTCTGAAAAGATTGGGAATGGATGGCTACAGGGGAATCAGCCTAGCAAACTGTAAGTCTACTCTCCATAATTCCAGAGAATTAGCTACGTATGGAACAGACACTAGGAGAGAAGGAAGAAGAAGAAGGGGCTTTGAGTGAATAGATGTTTTATTTCTTTGTGGGTTTGTATACTTACAATGGCTAAAAACATCAGTTTGGTTCTTTATAACCAGAGATACCCGATAAAGGAATACGGGCATGGCAGGGGAAAATTCCATTCTAAGTAAAACAGGACCTGTTGTACTGTTCTAGTGCTAGGAAGTTTGCTGGGTGCCTGAGATTCAATGGCACATGTAAGCTGACTGAAAGATACATTTGAGGACCTGGCAGAGCTCTCTCAAGTCCTTGGTATGTGACTCCAGTTATTTCCCATTTTGAACTTGGGCTCTGAGAGCCTAGAGTGATGCAGTATTTTTCTTGTCTTCAAGTCCCCTGCCGTGATGTGGGATTTTTATTTTTATTTTTATTTTATTTTATTTTATTTTTAAAGACAGTCTCACTGTGTGGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCATGATCTCAGCTCACTGCAACCTCTGCCTTCTGGGCTCAAGTGATTCTCGTGCTTCAGCCTTCTGAGTAGCTGTGACTACAGGTGTGTACCACCACACCCAGCTAATTTTTTGTATTTTCAGTAGAGATGGGGTTTCACCATGTTGGCCAAGCTGGTCTTGAACTCCTGGCCTCAAATGATCTGCCCACCTCAGCCTCCCAAAGTGGTAGGATTACAGGTGTGAACCACTGCACCCAGCCGACATGGGATTTTTAACAGTGATGTTTTTAAAGAATATATTGAATTCCCTACACAAGAGCAGTAGGAACCTAGTTCCCTTCAGTCACTCTTTGTATAGGATCCCAGAAACTCAGCATGAAATGTTTTATTATTTTTATCTACTCTACTTGATTAACTATCTTTCATTTTCTCCCACACAATTCAAGATGTGCCATGAGGAAAAGTTATTTTATAGTTTAGTACATAGTTGTCGATGTAATAATCTCTGTAGTTTTCAGATTGAATTCAGACATTTCCCCTCAATAGCTATTTTTGAATGAATGAGTGAAGGGATGAAATCACGGAATAGTCTTGTTTTCAAGATTCTAACTTGATATCCAAATTCACCTTTAGATATTATAAGAAAATTTCTATCAGAAAATCCTTATGTTTTTCTGATTAAAAAAAGCATTTTTCCATCAGCCTATGTATCTGCTATGAATTTACAAAATCTACTCAACAGCTCTGTTGATTTTT
CTGTTCTTGGCTGAATGTTGCCTGAGGGATGGGAGCACGGGAAGGGTAAAAGCAATGGAAGAAACATGTATTTTAATATTTTAAAAGTATGTTATATTGTTCGTTGGTGTTACAAGATGATTTGCATTACAAAAGGATTCTCTTACAAGTCCCTTATCTTAACACTAAAGTGCTAAGATATTTTATAAGTAAATCTTTATACTTATAAAACAAATCAGTAAAATAGAAGTAGCTAAGTAGAACTGATTTTGCTATAGAGTATAAGTCACTTAGTGTTGCTGTTTATTACTAAAAATAAGTTCTTTTCAGGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTACAACACACGAGCTACAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATTATGGGATATTTCAGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTGTCATTTATCCTGCAGTGGTAAGACAAGCTAATATTTGACCAATCTGGTTATACTTACAAGAATTGAGACTCAATACAAATGAAAAAGCCTTGAAAGGTTCATGAGGGACCTAGAAAAACTACATCTCAACTTCCAGAAAGTCATTATTATTTTCCTCATAATTCCCTGAGTAAGAAATTTAAAGAAGTGGTATCATAAAAGGTTGATGTTTTTTAATATACAGAAGTTTCTGGAATGACCTATTAATTTACTGTCAATGGCCTTACTGATGCTTTGTCCAGAACAATGCCATTGCTCCTGCTTACTTTGGGGAGGTTTTGGGATAATTTAGTTGTATGGTCCTTTTTCAATTGTTTTACTTTTTTTTTTATGAAATGTTCTAAATGTATAGAAAATTAGAGACATTAGTATAATAAACAGCCATATGCCCATTATGCACTTTAAAAGTTGTTAACATTTTGCCATAGTTGCTTCTTCTATGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTGAGAGTTTTTTGTTTGGTTTTGTTTTGTTTTATTTTGAGACAGGGTCTCCTGTCCCGAGGCTGTAGTCAGTGGCACCATCACAGCTCACTGCAGCTCAAGTGATCATCCCACCACAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACTACAGGTGTGCACCACCATGCCTGGCAAATTTTTGAAATTTTTAGTACAGGCAAATTCTGTGTTGCCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGAGTTCAAGCAATCTTCCCACCTCAGCCTCCTTAAGCTGCTGGAATTACAGGCGTTAGCACTGTACCTGGCTACTGCTGAGAGACTTTTAAGTGAATTAGGAACATGATGATATTCCATTTCTAAATTCTTTAGTTTACATCTTCAAAAAATACAGTTCCTGTAGAATTATTATTGTAAATAACAAATTAACTTAAGGATTTATTTATTTGGAGTGAAACAAATATTTTACTGAACTCATAAAAATAGAAATACCATGTGGAATCCTCAGTGTCAAAAATATTGCAGAAATCTTGCAAAGTTGATATTATTAAATTGTTAAATATTAAAATTCCCAATAAAGAACATTAATCTTATTTCTAAAATCCAGTTAATTAAAAAAATTTATATTATATAATAATATTTGGTCATTAAATAAAAATTAGAAAATACAAATAAGAAAAATAACACCCATAATCTTACTACCCAGAGGTTTATAACCATGGGTAAATTCTGGTATATATTCTTCCAGAATGTATATCAATCATGTGTATGAATGTTAAATTATATCATACACATATAAACCCACATACAAACATGTAAATACTGTGTGCTTTTGCAAAAATTAAATTGTATTATACACACGGCTTTACAATTTGCTTCTTATCACACAAAATTATTTGCATGTCAGCAAATACAAATCGGTTTTTAATGATCTTTTGCTCCATTTTCCAGATGAGAAAAAAATACAAATCTGTATCATCATTTTAAAAGAATGACTAGAATTTTAATATATGAATATTCTATAATTTACTGATCCAATTGTTACTATTGAGCACTTAGGTTGTTTCCATTTTTCCCTCATAAATTGCTATGAATAGCTTTTTGTATACATCTTTGGGTGCATTTCTTATTTCTTTTGGATAAATTTTCAATAATAGAACTGCTGAGTAAAATATCACTAGGTGTTTTTTTACAGTGTCTAGTGCAAAGAAGACCTTTAATCATTTTGTTAATACTTCCAGAGCTTCCAATGACTTTGGTAAATGAAGAAAAAAATGCTTCATTTCATGCTGAATGGGAGAGAATGAAGAGAGTTTTCCCCAACAATTACACATATATGGACTCATAGAAAATAATATCTTACCATTCTTTCCACAGCCTAACAGAAAAAAGCTGGCTAAACCTAAATTTAAAATAAAATATCTATTAAAGTTTTTATTCCTTACCACCTGTCTTTCAGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCAAAGAGGGTTGTCCGTGATCCACAAGGCATTAGAGCATGGTATGTTTTAAGTGTTAAAAGGGAAAACTATCTTACTCTACTGTTGATATATACAATGAGAGCAGACTTTTAAAGACCAAAGTATGCTAATGACACCTCAAAATTGCAGCTTTTGGCTTATGCTAAATGATGTATTACCTACATCCTTGAAGAAACAATCTACTTTAACTGATCCAGAATCTTACTCTTTTACTCCTCAATTTATTTTAGGGGATTTCTAGAGTTTTAAGATGCTTCACACTCTATCAGTTCCTTGTCATATCTTGAAATTCTTTTTAGAATAAGTAAGTGTGGGCCGGGCACAGTGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGACCGAGGCAGATGGATCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGACCAGCCTGCCTAACATGGCAAAACCCCATCTCCACTAA
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在細胞克隆形成后，用克隆環挑取克隆，按照從96孔板到48孔、24孔、12孔和6孔板順序依次傳代，當細胞在6孔板長滿后凍存其中的一半(凍存密度5×105cells/0.5ml)，另一半接入60mm培養皿中繼續培養，用于抽提基因組DNA。
當細胞在60mm培養板長滿后(約2×106cells以上)，收集細胞，PBS洗兩遍，加細胞裂解液500μl，37℃裂解過夜，酚-氯仿、氯仿各抽提一次，加1/10體積的NaAC(pH5.2)后用等體積無水乙醇沉淀，70％乙醇洗滌一次，稍稍干燥即用40μl含有20μg/ml RNase的TE緩沖液溶解，37℃溫育過夜，4℃保存以備用于陽性克隆的篩選。
用如下引物測定轉基因的整合情況，擴增片段為人溶菌酶基因組內一段大小為429bp的序列，退火溫度為60℃。
Lyz983TACATTTGAGGACCTGGCAGAGC(SEQ)ID NO3)，和Lyz1412TCCTACCACTTTGGGAGGCTGA(SEQ)ID NO4)。
用完整的4.8kbp的人溶菌酶的基因組DNA為探針，EcoR I酶切基因組，Southern-blot分析。可獲得3.2kb的雜交條帶的為正確整合克隆。將正確克隆于液氮中保存備用。
Southern-blot實驗操作步驟主要參照《分子克隆試驗指南》實驗方法進行，瓊脂糖凝膠濃度為1％，電泳液為1×TAE，電泳條件為30V，過夜(16h)。DNA轉移到硝酸纖維膜上，轉移液6×SSC，轉移過夜20小時；DNA固定-雜交80℃烤膜，2小時；預雜交42℃，4小時；雜交42℃，過夜(20小時)；洗膜、放射自顯影壓片后，-80℃，72小時；洗片，分析結果。
共挑取了34個分隔良好的細胞株，PCR檢測表明其中有10個為陽性(1、2、4、5、6、11、21、26、27、28)，進一步Southern-blot分析表明有3個可獲得陽性雜交條帶，分別是5、6和11號，見圖3。
實施例3體細胞核移植1.卵母細胞制備與受體羊的同步挑選出作為卵母細胞供體的母羊肌注PG 0.1mg/頭，間隔10～14天后注射第二次PG，在第二次注射PG 10～13天后開始超排，即首先肌肉注射FSH，分6次，2次/日，用量為每天100IU，80IU，80IU。在最后一次注射FSH的同時，注射一次PG(0.1mg/頭)，間隔24小時后時注射LRH，25μg/次，注射LRH后26～28小時回收卵母細胞。
為與提供卵母細胞的供體羊同步，受體羊間隔9～11天分兩次肌肉注射PG，在供體羊超排注射PG后24小時，受體也同時注射PG，受體注射LRH的時間及劑量同供體。
手術暴露輸卵管，用F-10營養液沖卵、體視鏡下檢卵。透明質酸酶消化顆粒細胞，M16洗4～5次，置M16方杯中培養，備用。
2.供核細胞的饑餓處理把待饑餓的細胞接種于35mm平皿內。待細胞豐度達70％～75％左右時，吸去培養液，加入含0.5％FCS的DMEM液，饑餓5天后，常規法消化收集細胞。然后放于-85℃冰箱內保存。在核移植實驗前6天，取出2小管復蘇并接種于4孔板內。再培養2天或3天后饑餓，饑餓方法同前。
3.重構卵的制備與激活卵母細胞在M16-Hepes(含Hepes 2.8mg/ml，CB 7.5μg/ml)液中洗滌3次，在M16-Hepes(含7.5μg/ml CB)中處理10min；同時將培養的細胞用胰酶消化、分散成單個細胞。將卵母細胞與供核體細胞同時移入置于滅菌玻片上的1mlM16-Hepes(含CB)中，在顯微鏡下去核并吸入供核細胞，將之從原來的切口注射到卵周隙內，使其緊貼于胞質膜，采用電刺激的方法進行融合，融合基質為含0.3mM甘露醇、0.05mM氯化鈣、0.1mM硫酸鎂、0.5％BSA的溶液，融合條件為DC600-610v/cm，脈沖持續時間80μs，連續刺激3次。融合后的胚胎于M16中培養5小時后，在含5μM離子霉素(ionomycin)、7.5μg/ml CB的M16液中處理5min，再在含2mM-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)以及7.5μg/mlCB的M16液中處理5小時后移到M16培養液中培養，待包埋或移植。
4.重構卵的包埋、回收與發育胚胎的移植用1％的Agarose包埋重構卵，并移植入輸卵管內，體內培養5天后將膠條沖出，將膠條內的胚胎剝離出來，選擇發育至桑椹和囊胚期胚胎，移植到受體羊子宮內。移植后的受體在胚胎發育至1～2月齡時用B超進行妊娠檢查，出現孕囊的判定為懷孕，妊娠足月分娩。
最終利用6號細胞株，共獲得了5頭成活克隆羊，見圖4。
實施例4成活克隆山羊的整合檢測取克隆山羊的耳尖組織，組織勻漿機勻漿，加入500μl 1×裂解液，50μl蛋白酶K，37℃恒溫過夜。次日加入500μl酚，緩慢顛倒混勻5分鐘，使其充分乳化。13000g離心5分鐘，用1000μl去尖槍頭小心吸取上清至一1.5ml離心管。用等體積酚∶氯仿(1∶1)反復抽提幾次。最后加入2倍體積的無水乙醇，緩慢混勻，靜置10分鐘。13000g，4℃離心10分鐘，沉淀DNA。傾除上清，倒置離心管至溶液揮發干，加入適量300μlTE(pH8.0)溶解，保存于4℃備用。
基因組DNA的PCR和Southern-blot檢測方法同實施例2。經PCR和Southern-blot分析表明均為5頭克隆山羊均為轉基因山羊，見圖5，圖5A為PCR檢測結果，N1～N3為正常山羊，1～5分別為BLG1～BLG5，+為陽性質粒對照，M為1kb的分子量標準，可見BLG1～BLG5都可擴增獲得陽性條帶；圖5B為Southern-blot的檢測結果，1～5分別為BLG1～BLG5，M為1kb的分子量標準，可見BLG1～BLG5都可擴增獲得陽性條帶，也都可雜交出3.2kb的陽性條帶。
實施例5轉基因山羊的誘導泌乳和重組人溶菌酶的表達檢測選取轉基因山羊BLG1和BLG2，待BLG1和BLG2生長至5月齡時進行誘導泌乳，獲得乳汁。每天肌肉注射苯甲酸雌二醇(2mg)及黃體酮(20mg)二次，共七天。然后分別于第8，10，12，14天肌肉注射利血平0.5mg。于第12天收集乳汁，乳汁保存于-20℃備用。
將羊奶用蒸餾水稀釋10倍，加入等體積的2×SDS凝膠加樣緩沖液，于65℃溫育15分鐘。取5μl做SDS-PAGE凝膠電泳，積層膠為4％膠濃度，分離膠為7.5％膠濃度，100V恒壓。
Western-blot分析SDS-PAGE凝膠電泳后，80mA恒流2小時，將蛋白轉至硝酸纖維素膜上。10％脫脂奶粉過夜封閉轉印膜，以1∶3000的濃度加入第一抗體(兔抗人溶菌酶多抗，DAKO產品)，室溫雜交1小時；雜交結束，用PBST溶液漂洗濾膜3次，每次10分鐘；以1∶3000的濃度加入酶聯二級抗體，室溫雜交1小時；雜交結束，用PBST溶液洗膜3次，每次10分鐘。用DAB和雙氧水顯色5分鐘。
估量乳汁中重組人溶菌酶的表達水平將轉基因山羊的奶樣和人的標準品分別做梯度稀釋后，通過SDS-PAGE和Western-blot檢測，對檢測信號進行對比，以此對奶中人溶菌酶的表達水平進行估計。
奶樣經SDS-PAGE和Western-blot分析，表明BLG1和BLG2的乳汁中都可獲得強的雜交信號。乳汁中rhLYZ的估量表明BLG1初乳中大約為3mg/ml；BLG2初乳中的表達量在4mg/ml。上述雜交分析也表明山羊乳汁中表達的重組人溶菌酶與天然人的溶菌酶有相同的抗原性，分子量也相當，約14.6kD。
圖6顯示了轉基因山羊乳汁中人溶菌酶的表達檢測。圖6A為SDS-PAGE電泳結果，PAA1、PBC1和PBC2是與BLG1和BLG2同一批次制備的不同調控區指導人溶菌酶乳腺特異表達的轉基因克隆山羊，正常山羊與轉基因山羊催乳同步，M為蛋白分子量標準，SDS-PAGE結果表明BLG1和BLG2的奶樣在14.6kD處都有一明顯蛋白條帶，其他樣品無；圖6B為圖6A所述樣品的Western-blot檢測結果，圖中可看出BLG1和BLG2都有強的雜交信號，PBC1、PBC2以及人乳汁有相應的雜交條帶，但較弱。
圖7是轉基因山羊BLG2乳汁中人溶菌酶的估量。1、2、3、4、5為人LYZ的標準品，上樣量分別為0.4μg、0.2μg、0.1μg、0.05μg、0.025μg；A、B、C、D為BLG2山羊乳汁，上樣量分別為0.1μl、0.05μl、0.025μl、0.0125μl為原乳。圖7A為SDS-PAGE檢測結果，圖7B為相應的Western-blot檢測結果，從兩種結果可見D與4的信號強度相當，由此估算出的乳汁中人溶菌酶的表達量約為4mg/ml(0.05μg/0.0125μl)。
圖8是轉基因山羊BLG1乳汁中人溶菌酶的估量。1、2、3、4、5為人LYZ的標準品，上樣量分別為0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg，A、B、C、D為BLG2山羊乳汁，上樣量分別為0.25μl、0.2μl、0.15μl、0.1μl、0.05μl為原乳。從結果可見D與3的信號強度相當，由此估算出的乳汁中人溶菌酶的表達量約為3mg/ml(0.3μg/0.1μl)。
實施例6重組人溶茵酶的純化將收集的乳汁在4℃溶解，然后10000g離心30分鐘。去除脂肪后的乳汁用4N的鹽酸調pH到4.7，通過40℃加熱30分鐘使酪蛋白沉淀，最后10000g，離心30分鐘后將乳清輕輕倒出。將乳清對10倍體積的透析液(0.05M NaCl，5mM巴比妥-HCl，pH7.4)透析，重復3次。然后上肝素-瓊脂糖凝膠柱(50ml固定凝膠)。柱子用250ml透析緩沖液洗滌后，再通過0.05-1M的線性梯度的NaCl(800ml)進行洗脫，流速是20ml/h。收集各洗脫峰。用Western-blot檢測各峰，確定重組溶菌酶的洗脫峰。真空濃縮后用Sephadex G-75柱進行凝膠過濾洗脫液為0.1M sodium acetate(pH 6.5)，流速20ml/h，收集包含重組溶菌酶的組分。
共純化約20ml誘導泌乳第5天BLGl轉基因山羊的奶樣，經肝素-瓊脂糖凝膠柱純化后峰2共收集24ml，DC法檢測蛋白濃度為0.8mg/ml，總計19.2mg，其中大約有90％的組分為重組人溶菌酶。
圖9為Heparin-Sepharose層析柱純化轉基因山羊乳汁中的人溶菌酶。圖9A為0.05-1M NaCl梯度洗脫結果；圖9B為梯度洗脫各峰的SDS-PAGE結果，可見峰2中的蛋白主要為分子量在14.6kD的蛋白；圖9C為梯度洗脫各峰的Western-blot檢測結果，表明在峰2可檢測到與人溶菌酶抗體的反應信號，說明峰2中含有的蛋白主要為重組人的溶菌酶。
實施例7溶菌酶的活性檢測活性分析通過測定A450條件下，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticusbacterial)濁度的變化來測定。1個酶活單位定義為在室溫(20.8℃)條件下，在0.18M的醋酸鈉，pH5.5的緩沖液中，每分鐘A450降低值為0.001。
首先用0.18M的醋酸鈉(pH5.5)的緩沖液將溶壁微球菌配置成0.8mg/ml的懸浮液(OD4500.6-1.0)。將天然人溶菌酶加入正常山羊的乳汁中，濃度達到2mg/ml，作為標準品，正常山羊的乳汁為陰性對照，正常乳汁與轉基因乳汁泌乳期相同。將標準品、陰性對照和轉基因羊奶用0.18M的醋酸鈉(pH5.5)做50、100、200、400、800、1600倍稀釋。將20μl樣品和180μl的溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus bacterial)的懸浮液混合，迅速讀取混合液的A450光吸收值，5分鐘后再測定一次，計算出A450/min的降低值。整個實驗均在室溫(20.8℃)下完成。選擇倍比關系較好的稀釋度計算乳汁中的溶菌酶的活性單位。
經溶壁微球菌懸浮液的溶壁活性分析表明，BLG1和BLG2乳汁中的溶菌酶活性分別約為617600U/ml和846400U/ml，添加2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性為308800U/ml。
圖10為轉基因山羊乳汁中的溶菌酶的活性分析。乳汁中溶菌酶的活性含量是通過倍比關系較好的稀釋度計算出的活性單位。可見BLG1、BLG2和含2mg/ml天然人乳溶菌酶的正常山羊乳汁中的溶菌酶活性分別約為617600U/ml、846400U/ml和308800U/m。
實施例8重組人溶菌酶的N-端氨基酸測序將純化所得的rhLYZ經SDS-PAGE電泳，半干轉移至PVDF膜上。轉移緩沖液為CAPS液，操作方法簡述如下剪PVDF膜大小同凝膠，100％甲醇浸潤，用陽極緩沖液體平衡30分鐘；同時兩張3mm濾紙也在陽極緩沖液中平衡。陰極緩沖液體中平衡凝膠和兩張3mm濾紙。由下至上組裝轉移夾心裝置，依次為濾紙(+)，PVDF膜，凝膠，濾紙(-)。恒流，1.5mA/cm2，30-60分鐘。將膜用0.1％考馬斯亮藍R250(溶解于40％甲醇，1％冰醋酸)，染色30-50秒(不可超過1分鐘)，用50％甲醇脫色后用去離子水充分清洗，濾紙上涼干。切下目的條帶，將PVDF膜保存于兩張濾紙之間，送中國科學院上海生化與細胞研究所蛋白質組研究分析中心進行N-端序列測定。
經中國科學院上海生化與細胞研究所蛋白組研究分析中心的N-端測序表明了重組人溶菌酶的N-端10個氨基酸序列為KVFERCELAR，與天然人的溶菌酶序列完全相同，見表1。表明了重組人溶菌酶在山羊乳汁中進行了正確拼接和翻譯。
表1N-端測序結果

實施例9各種溶菌酶調節構件對于山羊乳汁溶菌酶分泌的影響比較本發明人于2004年，做了4種乳蛋白調區指導人溶菌酶的5種乳腺特異表達框架(包括基因組DNA和cDNA)，將分別來源于人的α-乳白蛋白，山羊的β-酪蛋白，牛的α-乳球蛋白，和牛的αS1-酪蛋白的片段與其它功能片斷連接，構建用于調控的元件，各調控構件的具體結構可見圖11。
通過共轉染的方法，本發明人獲得了上述構件的包含人溶菌酶的整合細胞株，并將其用于體細胞克隆，情況如下pBClyzc整合細胞株為11和26的細胞；pAAlyzc整合細胞株為6、13、43和45的細胞；pbLGlyz整合細胞株為編號為5、6和21的細胞；pBClyzg整合細胞株為編號為8、9和10的細胞；pINS-CNlyz整合細胞株編號為25、B6和B7細胞。
利用上述整合細胞，本發明人都獲得了成活的體細胞克隆羊，出生羊情況為pBClyzc存活4頭，pAAlyzc存活4頭，pbLGlyz存活5頭，pBClyzg存活5頭，pINS-Cnlyz存活3頭。
本發明人選擇了來源于pBClyzc(PBC1和PBC2)、pAAlyzc(PAA1和PAA2)和pbLGlyz(BLG1和BLG2)構件的各2頭羊進行催乳，另外選擇一只相同年齡的山羊做對照。另兩個構件的羊因年齡尚小沒進行催乳。
對獲得乳汁(PAA1沒能獲得乳汁)，進行了表達分析。檢測結果表明，PAA1羊乳汁中沒有hLYZ的表達，PBC1和PBC2兩只羊的乳汁中僅有很微量的表達(表達水平相似)，而BLG1和BLG2兩只羊的乳汁中hLYZ都有了高水平表達，正常羊乳汁中沒有檢測到雜交信號，見圖6。
因此，本發明人很幸運的找到了在乳汁中高效表達hLYZ的最佳調控組合牛BLG5’-hLYZ-bGHpA。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海杰隆生物工程股份有限公司<120>一種利用家畜乳腺高效生產人溶菌酶的方法<130>059336<160>5<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>18<212>DNA<213>引物<400>1cggccggggg tctgctcc 18<210>2<211>24<212>DNA<213>引物<400>2ctcgagggct gcagctgggg tcac 24<210>3<211>23<212>DNA<213>引物<400>3tacatttgag gacctggcag agc 23<210>4<211>22<212>DNA<213>引物<400>4tcctaccact ttgggaggct ga22<210>5<211>6304<212>DNA
<213>人工序列<400>5cggccggggg tctgctcccg tgggtgggct ctttctggta cagtcaccaa cagtctctcc60gggaaggaaa ccagaggcca gagagcaagc cagagctagt ctaggagatc cctgagcctc120cacccaagat gccgaccagg ccagcgggcc ccctggaaag accctacagt ctaggggggg180aacaggagcc gacccgccag gcccccgcta tcaggagaca ccccaacctt gctcctgttc240ccctacccca gtacgcccac ccgacccctg agatgagtgg tttacttgct tagaatgtca300attgaaggct tttgtacccc ctttgccagt ggcacagggc acccacagcc cgctgggtac360tgatgcccat gtggactcag ccaggaggac tgtcctgcgc cctccctgct cgggccccct420ccatactcag cgacacaccc agcaccagca ttcccaccac tcctgaggtc tgaaggcagc480tcgctgtggt ctgagcggtg cggagggaag tgccctggga gatttaaaat gtgagaggtg540ggaggtggga ggttgggtcc tgtaggcctt cccatcccac gtgcctgcac ggagccctag600tgctactcag tcatgccccc gcagcagggg tcaggtcact ttcccatcct gggggttatt660atgactgttg tcattgttgt tgccattttt gctaccctaa ctgggcagcg ggtgcttgca720gagccctcga tactgaccag gttcccccct cggagctcga cctgaacccc atgtcaccct780cgccccagcc tgcagagggt ggggtgactg cagagatccc tttacccaag gccacagtca840catggtttgg aggagatggt gcccaaggca gaagccaccc tccaggacac acctgccccc900agtgctggct ctgacctgtc cttgtctaag aggctgaccc cagaagtgtt cctggcgctg960gcagccagcc tggacccaga gcctggacac cccctgcgcc cccacttctg gggcgtacca1020ggaaccgtcc aggcccagag ggggccttcc tgcttggcct cgaatggaag aaggcctcct1080attgtcctcg tagaggaagc aaccccaggg cccaaggata ggccaggggg gattcgggga1140accgcgtggc tgggggcccg gcccgggctg gctggctggc cctcctcctg tataaggccc1200cgagcccgct gtctcagccc tccactccct gcagagctca gaagcgtgac cccagctgca1260ctcgagatga aggctctcat tgttctgggg cttgtcctcc tttctgttac ggtccagggc1320aaggtctttg aaaggtgtga gttggccaga actctgaaaa gattgggaat ggatggctac1380aggggaatca gcctagcaaa ctgtaagtct actctccata attccagaga attagctacg1440
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1.一種乳腺特異性表達融合基因，其特征在于，該融合基因從5’至3’依次包含以下元件牛β-乳球蛋白的5’側翼序列，人溶菌酶基因，和牛生長激素3’側翼序列。
2.如權利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述的人溶菌酶基因選自(a)包含信號肽編碼序列，第1-4個外顯子和第1-3個內含子；或(b)包含信號肽編碼序列和成熟蛋白的完整編碼序列。
3.如權利要求1所述的融合基因，其特征在于，所述的融合基因選自(a)具有SEQ ID NO5中1-1260位、1267-6067位和6074-6304位依次連接獲得的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO5所示的核苷酸序列；或(c)與(a)或(b)中的核苷酸序列互補的核苷酸序列。
4.一種制備轉基因動物的方法，其特征在于，包括以下步驟(a)將權利要求1所述的融合基因與抗性篩選基因共轉染體細胞，獲得基因組中整合有融合基因的轉基因細胞；(b)將(a)獲得的轉基因細胞作為核供體進行體細胞克隆，獲得可高產人溶菌酶的動物。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，所述的細胞為動物胎兒成纖維細胞。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的動物為牛、山羊、綿羊、豬、兔。
7.一種調控外源基因在動物乳腺中特異性表達的載體，其特征在于，該載體含有權利要求1所述的融合基因。
8.一種家畜的乳汁，其特征在于，它含有濃度10-8000ug/ml的人溶菌酶。
9.一種生產人溶菌酶的方法，其特征在于，它包括步驟培養用權利要求2所述方法制得的轉基因動物，從動物乳腺分泌的乳汁中分離純化出表達的人溶菌酶。
10.高產人溶菌酶的轉基因克隆動物的細胞及組織，其特征在于，來自采用權利要求2所述的方法獲得的乳腺高效表達人溶菌酶的轉基因動物。
全文摘要
本發明公開了一種乳腺特異性表達的融合基因，該融合基因從5′至3′依次包含以下元件牛β－乳球蛋白的5′側翼序列，人溶菌酶基因，和牛生長激素3′側翼序列。本發明還公開了一種制備轉基因動物的方法，包括將所述的融合基因與抗性篩選基因共轉染細胞，獲得基因組中整合有融合基因的轉基因細胞；以及將獲得的轉基因細胞作為核供體進行體細胞克隆，獲得可高產人溶菌酶的動物。本發明的方法獲得的轉基因動物的乳汁中人溶菌酶表達量遠高于現有水平，并具有與天然人乳中溶菌酶相同或相似的生物學活性。
文檔編號C12N15/12GK1970771SQ20051011077
公開日2007年5月30日 申請日期2005年11月25日 優先權日2005年11月25日
發明者成國祥, 陳建泉, 劉思國 申請人:上海杰隆生物工程股份有限公司