專利名稱：真菌中一種控制侵染釘形成效率的新基因MgPPF5及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物基因工程和植物保護領域中一種控制侵染釘形成的基因。
背景技術：
梨孢菌(Magnaporthe grisea)是子囊菌亞門的真菌，能侵染水稻、小麥、大麥、粟以及其它多種禾本科植物，尤其是該菌侵染水稻引起的稻瘟病在世界各個栽培稻區每年均有發生，危害廣泛、嚴重。一般情況下，稻瘟病的危害可使水稻減產5-10％，重病田可導致水稻絕收。稻瘟病在我國曾多次流行，也是我國水稻的主要病害之一。1993年，稻瘟病在我國發生大流行，在全面防治的情況下仍然減產上百億斤。梨孢菌還可侵染鈍葉草、狗牙草、假儉草等屬的草坪草，造成大面積枯死，是草坪草常見病害。
M.grisea具有特異的、形態分化的侵染結構膨大的、半球型的附著胞、侵染釘以及隨后形成的侵染菌絲等。分生孢子是稻瘟病流行的主要傳播體，在稻瘟菌的再次侵染和病害流行過程中起著至關重要的作用。在合適的環境條件和遺傳特性下，自身的營養物質就能夠使分生孢子萌發、形成芽管、附著胞、侵染釘并完成侵入寄主細胞的整個過程。但是這以過程需要一系列的信號調節。芽管前端附著胞的形成依賴于其所接觸表面的理化性質如疏水性、表面硬度、角質單體、蠟質和極性脂類等(Dean R.A.Signal pathways and appressoriummorphogenesis.Ann.Rev.Phytopathl.1997，35211～234)。在親水表面如玻璃或一種叫Gelbond的(FMC Bioproducts，Maine)親水面，芽管只能呈典型的營養生長。稻瘟菌在與水稻葉表具有相似結構的表面也能形成附著胞，但是附著胞形成只與固體基物硬度有關(Hamer J.E.，Howard R.J.，Chumley F.G.et al.A mechanism for surface attachment in spores of a plantpathogenic fungus.Science.1988，239288～290.)，接觸基物的疏水性在形成附著胞中起的作用有待深入研究。cAMP是在真核和原核生物中普遍存在的第二信使分子，它的作用靶標是蛋白激酶A(PKA)的調節亞基，能夠調節真菌的代謝和形態構成。在稻瘟菌中，cAMP調節菌絲的頂端生長、細胞接合、碳代謝并且在致病性中發揮重要作用(Kronstad，J.W.Virulence andcAMP in smuts，blast and blights.Trends Plant Sci.1997，2193～199)。cAMP和它的同系物都能夠在非誘導性基質表面誘導稻瘟菌附著胞的正常形成，表明cAMP信號調控參與了附著胞形成的部分途徑(Lee Y.H.，Dean R.A.cAMP regulates infection structure formation in the plantpathogenic fungus Magnaporthe grisea.Plant Cell.1993，5(6)693～700)。cAMP直接作用的靶標是CPKA編碼的cPKA(依賴于cAMP的蛋白激酶A)，該酶是稻瘟菌從芽管開始向附著胞分化所必需的。真核細胞內的膨壓受一個保守的分裂素激活蛋白激酶(MAPK)信號系統調控，在附著孢形成過程中，該信號系統在cAMP信號系統下游起作用，參與附著孢的形成和隨后的侵染過程。在稻瘟菌中，編碼MAPK的基因有3個PMK1、OSM1和MPS1，它們均在侵染過程中起重要作用(Thines E.，Weber R.，Talbot N.J.MAP kinase and protein kinaseA-dependent mobilization of triacylglycerol and glycogen during appressorium turgor generationby Magnaporthe grisea.Plant Cell.2000，121703～1718)。
糖代謝是真核生物代謝中一個重要組成部分，甘露糖酰基轉移酶(Mannosyltransferase)是近年研究較多的一個熱點。它和其它蛋白一起形成蛋白復合體，定位在細胞內質網上，參與低聚糖的生物合成和蛋白質的修飾。該酶的突變會引起真核生物糖代謝紊亂、影響細胞壁的形成，造成真菌毒性減弱等缺陷。目前在梨孢菌中有關該酶的研究報道很少，主要集中在白色假絲酵母和其他一些真菌上。
糖基磷脂酰肌醇是酵母菌生存必需的一種成分，而且在酵母細胞壁形成中起重要作用。SMP3基因在酵母中編碼甘露糖酰基轉移酶基因，2004年Stephen J.Grimme報道該基因的缺陷會阻礙糖基磷脂酰肌醇的裝配，進而造成白色假絲酵母的生長和細胞壁合成的缺陷(Stephen J.Grimme，Paul A.Colussi，Christopher H.Taron and Peter OrleanDeficiencies in the essential Smp3 mannosyltransferase blockglycosylphosphatidylinositol assembly and lead to defects in growth and cell wallbiogenesis in Candida albicans，Microbiology 150(2004)，3115-3128)。甘露糖酰基轉移酶在白色假絲酵母黏附人的體表和產生毒性的過程中起重要作用，基因被破壞后，在單層PAEC介質上，35％的野生型菌株能夠黏附45分鐘，而突變體只有13～25％(ClaudiaTimpel，Sigrid Zink，Sabine Strahl-Bolsinger，Klaus Schrppel，and Joachim Ernst。Morphogenesis，Adhesive Properties，and Antifungal Resistance Depend on the Pmt6Protein Mannosyltransferase in the Fungal Pathogen Candida albicans Journal ofBacteriology，June2000，Vol.182，No.11，p.3063-3071)。Lynn M.Thomson等(LynnM.Thomson，Steven Bates，Soh Yamazaki，Mikio Arisawa，Yuko Aoki，and Neil A.R.Gow Functional Characterization of the Candida albicans MNT1 MannosyltransferaseExpressed Heterologously in Pichia pastoris J.Biol.Chem.，2000，Vol.275，Issue25，18933-18938，June23)利用該酶在甲基營養酵母中的不同表達，證明它能夠利用Mn2+和Zn2+，專一催化α-甲基甘露糖苷和α-1，2-甘露糖合成受體。N端和跨膜區不是活性必需部分，在基本不影響轉錄的情況下，破壞C端會破壞它的活性。
Takuji Oka的報道指出，在曲霉菌中，甘露糖酰基轉移酶和O-甘露糖酰基化反應的引發有關，該基因的破壞會引起不正常的細胞形態建成，改變碳水化合物的成分，造成細胞壁中多聚糖骨架的減少，是曲霉菌形成正常細胞壁必不可少的成分(Takuji Oka，TetsuHamaguchi，Yuka Sameshima，Masatoshi Goto and Kensuke Furukawa Molecularcharacterization of protein O-mannosyltransferase and its involvement in cell-wallsynthesis in Aspergillus nidulans Microbiology 150(2004)，1973-1982)。
梨孢菌的侵染過程是一個多基因控制的，有多種信號調控參與的復雜系統。而糖代謝作為真核生物代謝的一個重要組成部分也發揮了重要作用，研究該代謝途徑對梨孢菌侵染性的影響，將有助于搞清楚和梨孢菌致病性相關的分子機制，尋找可以作為殺菌劑靶標的蛋白及其基因，為新型農藥的設計和篩選奠定基礎。
發明內容
本發明的目的是提供真菌中一種控制侵染釘形成的基因，在梨孢菌該基因為MgPPF5。MgPPF5基因編碼的蛋白質與已報道的真菌甘露糖酰基轉移酶具有(Mannosyltransferase)序列相似性，該基因的突變導致梨孢菌侵染釘形成率降低，且在感病水稻品種上的致病力減弱。MGPPF5是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與真菌甘露糖代謝及致病性相關的蛋白質。
所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
MGPPF5的編碼基因(MgPPF5)也屬于本發明的保護范圍。其特征為具有下列核苷酸序列之一的多核苷酸序列1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸，或者編碼SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加的蛋白質的多核苷酸。
3)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
序列表中的序列1由3238個堿基組成，其編碼區位于序列1的2473位到3198位堿基之間。
本發明還提供了MgPPF5的cDNA基因，其特征為具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；3)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
含有MgPPF5基因的表達載體，細胞系和宿主菌均屬于本發明的保護范圍。
擴增MgPPF5基因中任一片段的引物也在本發明的保護范圍之內。
本發明證明了MgPPF5基因的突變導致梨孢菌形成侵染釘以及侵染菌絲的能力減弱，侵染菌絲的擴展能力下降，并且在親和性水稻品種上的致病力減弱。篩選能夠破壞掉該基因表達、剪切及其產物的表達、修飾與定位的藥物，是本發明的一個重要用途。MgPPF5的核苷酸序列和MGPPF5的氨基酸序列可以作為靶位點應用于抗真菌藥劑(特別是抗梨孢菌藥劑)的篩選和設計中，也可以以該核苷酸序列的某一區段作為探針在梨孢菌中分離該序列，也可以用于篩選、分離其它真菌的與該基因具有一定序列同源性的序列。
本發明證明梨孢菌MgPPF5的變異可使侵染釘和侵染菌絲減少，并導致致病力顯著減弱。
因此，可利用該基因與致病性變異的相關性篩選殺菌劑。
圖1為野生菌株P131與突變體MO2393在洋蔥皮上侵染釘形成情況的比較。
圖2為野生菌株P131與突變體MO2393在洋蔥皮上侵染菌絲形成情況的比較。
圖3為野生菌株P131與突變體MO2393在親和性水稻麗江新團黑谷葉片上形成病斑比較圖4為插入質粒pV4在染色體上的插入方式5為MO2393的互補載體質粒圖譜圖6為MO2393的敲除載體質粒圖譜圖7為野生菌株P131與互補轉化體CMO2393-1在洋蔥皮上侵染釘形成情況的比較圖8為野生菌株P131與互補轉化體CMO2393-1在洋蔥皮上侵染菌絲形成情況的比較圖9為野生菌株P131與互補轉化體CMO2393-1在親和性水稻麗江新團黑谷葉片上形成病斑比較圖10為突變體MO2393的互補轉化子的southern雜交驗證M為分子量標準物，1為P131，2為MO2393，3為CMO2393-1，4到9為CMO2393-2到CMO2393-7圖11為野生菌株P131與敲除轉化體QMO2393-1在洋蔥皮上侵染釘形成情況的比較。
圖12為野生菌株P131與敲除轉化體QMO2393-1在洋蔥皮上侵染菌絲形成情況的比較圖13為野生菌株P131與敲除轉化體QMO2393-1在親和性水稻麗江新團黑谷葉片上形成病斑比較圖14敲除轉化子以contig2.1486第1700到2681位堿基序列為探針的southern雜交驗證M為分子量標準物，1為P131，2為QMO2393-1，3到6為QMO2393-2到QMO2393-5，7為異位插入轉化子對照圖15敲除轉化子以潮霉素磷酸轉移酶基因序列為探針的southern雜交驗證。
M為分子量標準物，1為P131，2為QMO2393-1，3到6為QMO2393-2到QMO2393-5，
7為異位插入轉化子對照圖16MGPPF5與其他真菌中同源蛋白的親緣關系。圖示說明GZPPF5、NCPPF5和ASPPF5分別為玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)和煙曲霉(Aspergillus fumigatus)中的MgPPF5同源蛋白質，具體實施方式
為了更好的理解本發明，以下通過實例予以進一步地說明，但并非對本發明的限制。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
實施例1、和甘露糖代謝相關并影響梨孢菌侵染釘形成蛋白MgPPF5及其編碼基因的獲得1.突變體的篩選與鑒定1)分生孢子的制備將梨孢菌菌株P131的各REMI轉化體的菌絲充分打斷，均勻地涂布到西紅柿汁燕麥片培養基(每升含150ml西紅柿汁、30-50克燕麥片煮沸30分鐘過濾取濾液、20克瓊脂)平板上，26℃～28℃培養，當肉眼可見新生菌絲長出培養基表面時，用棉簽輕輕將菌絲洗下，并用水沖洗干凈菌落表面，蓋上單層紗布，于26℃～28℃光照培養48小時，在培養基表面即可見大量的梨孢菌孢子。
2)侵染釘及侵染菌絲形成減少突變體的篩選選擇紫色、扁園、較小的新鮮洋蔥，用無菌的手術刀切開。把洋蔥的內表皮切割成1×1平方厘米的小塊，用寬頭鑷子小心地從邊緣撕下，正面朝上平鋪在1.6％的水瓊脂平皿上。用無菌水配制5×104的新鮮孢子懸浮液，點接在洋蔥皮上。28℃避光保濕培養。36小時后在放大倍數為10×40的顯微鏡下觀察梨孢菌菌株浸染釘和侵染菌絲的形成情況，獲得了一個突變體MO2393。該突變體和野生型的梨孢菌P131相比，侵染釘以及侵染菌絲形成百分率大大下降，其侵染釘及侵染菌絲形成率和野生型相比較見表1。圖1和圖2為該數據的柱形圖表示。
3)致病性的鑒定采用步驟2所述的方法培養梨孢菌的分生孢子，孢子洗下后用雙層擦鏡紙過濾于50毫升的離心管中，4000轉/分鐘室溫離心5分鐘收集孢子，然后懸浮于0.25‰(體積比)的吐溫20水溶液中。調整分生孢子濃度到每毫升5×104個孢子，均勻地噴霧接種于五葉一心期的親和性水稻品種麗江新團黑谷幼苗的葉片正面。
表1.P131、MO2393在洋蔥表皮上形成侵染釘和侵染性菌絲的形成率
在親和性水稻品種麗江新團黑谷葉片上，該突變體的致病力也比野生型的低，野生菌株P131與突變體MO2393在親和性水稻麗江新團黑谷葉片上形成病斑如圖3所示。
2.突變體表型變化與插入標記共分離分析用遺傳雜交的方法對突變體中插入標記潮霉素抗性基因與突變表型的共分離進行分析，將此突變體分別與一個不具有突變表型和潮霉素抗性，并且交配型相反的梨孢菌菌株S1528進行雜交，分析其子囊孢子后代形成侵染釘及侵染菌絲的能力以及潮霉素抗性情況，具體方法如下將上述突變體分別與不具有潮霉素抗性、分生孢子形態正常的梨孢菌菌株S1528在西紅柿燕麥片培養基上進行對峙培養。首先于25℃培養至兩者菌落邊緣即將接到一起但是沒有接觸的時候，將其移至20℃光照培養，約20天左右在菌落的交界處形成黑色突起的子囊殼。挑取成熟的子囊殼，于無菌水中輕輕擠破，釋放殼內的子囊，將子囊懸浮液涂在水瓊脂平板上，25℃培養24小時后挑取子囊內子囊孢子萌發的單根菌絲于西紅柿燕麥片培養基上培養。統計這些子囊孢子后代的潮霉素抗性和形成侵染釘以及侵染菌絲的能力。結果如表2所示，表明在測定的子囊孢子后代中，侵染釘以及侵染菌絲形成能力下降的后代都具有潮霉素抗性，說明該突變體形成侵染釘能力下降的表型與插入標記潮霉素抗性基因是共分離的。
表2.S1528與突變體MO2393雜交后代的潮霉素抗性和侵染能力鑒定
3.與梨孢菌侵染釘及浸染菌絲形成能力降低有關的MgPPF5基因的克隆1)粒拯救通過對突變體中插入質粒的拯救，獲得了相應的插入位點側端的基因組序列，確定了突變體中質粒的插入位置。具體方法如下選取插入質粒pV4(Lu，S.，Lyngholm，L.，Yang，G.，Bronson，C.，Yoder，O.C.1994.Tagged mutants at the Toxl locus of Cochliobolus heterostrophus by restrictionenzyme-mediated integration.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911264-12653)中pUC18部分的限制性內切酶HindIII和KpnI完全消化突變體的基因組。酶切產物用乙醇沉淀并純化后用T4DNA連接酶進行自連接，轉化大腸桿菌的感受態細胞JM109。提取轉化子質粒，并進行酶切鑒定。酶切鑒定正確的質粒中除含有pV4中pUC18部分的序列外，還含有部分插入位點側端的基因組的序列。對鑒定正確的兩個質粒進行測序然后在數據庫中檢索所獲得的序列，分析插入位點附近的基因的范圍和可能的外顯子。結果表明在突變體中，質粒插入在一個限制型內切酶XhoI的酶切位點處，對應于SEQ ID NO.1中的第2640位。通過對拯救到的質粒進行酶切分析得知質粒pV4是在染色體上串連重復一共兩個拷貝插入的，且插入方向一致，其在染色體上插入位置和方向見圖4。
質粒拯救過程中涉及到的限制性內切酶和T4DNA連接酶由寶生物工程(大連)有限公司生產，參照使用說明書使用。
2)基因的預測首先將該突變體MO2393中質粒插入位點所在的contig2.1486在國際稻瘟菌基因組協會的官方網站(http://www.riceblast.org/)中進行基因預測，結合網站(http://www.softberry.com/berry.phtml)的分析結果，質粒的插入位點在負鏈上一個預測的MgPPF5的基因組基因(梨孢菌基因組數據庫中contig2.1486的第1427的核苷酸至第4664位的核苷酸)中。根據國際稻瘟菌基因組協會的官方網站中對這個基因的分析，contig2.1486中兩個限制性內切酶HindIII位點(從contig2.1486的第516位的核苷酸至第5248位的核苷酸)之間的序列包含對這個基因所預測的范圍，而且除了這個基因外不再包括別的完整基因。
3)基因組TAC文庫的篩選將獲得的側端序列與國際稻瘟菌基因組協會的官方網站(http://www.riceblast.org/)已公布的梨孢菌的基因組數據庫比較，這兩個插入位點都位于第1號染色體的contig2.1486。以這兩個位點之間的一段1142bp的DNA片斷(序列4)為探針，篩選梨孢菌P131的基因組TAC文庫(其平均克隆片段大小為50kb，共覆蓋全基因組的16-18倍，該基因組TAC文庫按照文獻魏士平等(Construction and Evaluation of a TACLibrary of Magnaporthe grisea，植物病理學報，2003，3357-62)描述的方法構建)，獲得七個陽性克隆，它們都包括MgPPF5的基因組基因(SEQ ID NO.1所示的第1位到第1146位的核苷酸序列)。
實施例2、MgPPF5及其編碼基因功能的確認本發明采用互補實驗和基因置換實驗來確認MgPPF5基因的。在這部分內容中包括互補載體和基因置換載體的構建以及將上述兩類載體導入梨孢菌中，得到梨孢菌的重組轉化體。互補載體的構建是指將包含預測的MgPPF5的全長的基因組基因的DNA序列片斷(梨孢菌基因組數據庫中contig2.1486的第512位的核苷酸至第5648位的核苷酸)與一個帶有新霉素抗性基因的載體相連，在這里新霉素抗性基因并不是對本發明的限制，其他能導致抗生素抗性的基因，即潮霉素抗性基因之外的導致真菌抗性的基因都可以達到同樣的效果。互補載體所導入的梨孢菌受體菌株為該突變體即梨孢菌MO2393。基因置換載體的構建是指將包括預測的MgPPF5的大部份基因組序列(梨孢菌基因組數據庫中contig2.1486的第809位的核苷酸至第3356位的核苷酸)連入一個載體中，然后用潮霉素抗性基因替換掉MgPPF5的基因組基因的大部分。基因置換載體所導入的梨孢菌菌株是野生型梨孢菌P131，基因置換載體通過基因兩側的側翼序列與野生型菌株基因組的相應序列發生同源重組，從而將基因組中相應位點MgPPF5的基因組基因大部分序列與潮霉素基因置換。
1.互補載體和敲除載體的構建1)互補載體的構建首先合成帶有限制性內切酶XbaI識別序列的引物從克隆質粒載體pS65T-C1(gi1019893)中擴增出新霉素磷酸轉移酶基因(neu)連入pBlueScriptKS(+)的限制性內切酶切位點XbaI間，得到的質粒載體命名為KN。然后從實施例1中步驟三的1中所得到的陽性克隆中用限制性內切酶HindIII切下包含有預測的MgPPF5的基因組基因(梨孢菌基因組數據庫中contig2.1486的第516位的核苷酸至第5248位的核苷酸)的DNA片斷，和用同樣限制性內切酶HindIII酶切的KN連接，得到包含有預測的MgPPF5的基因組基因(梨孢菌基因組數據庫中contig2.1486的第516位的核苷酸至第5248位的核苷酸)和選擇標記新霉素磷酸轉移酶基因的互補載體pKNMT。構建過程中涉及到的限制性內切酶和連接酶，末端補平酶由寶生物工程(大連)有限公司生產，參照使用說明書使用。互補載體質粒圖譜見圖5。
2)敲除載體(基因置換載體)的構建。
根據國際稻瘟菌基因組協會的官方網站中所預測的MgPPF5的基因組基因的外顯子-內含子的結構，結合結合網站(http://www.softberry.com/berry.phtml)的分析結果，從contig2.1486的第1458位的核苷酸至第2734位的核苷酸之間的序列能包括MgPPF5的基因組基因的大部分功能域(包括序列1的1931到3207位的序列)而不包括任何別的基因。
一方面從實施例1中步驟三的1中所得到的陽性克隆中用PCR方法在contig2.1486的第809位的核苷酸至第1458位的核苷酸序列上引入SpeI和HinaIII切點，在contig2.1486的第2734位的核苷酸至第3356位的核苷酸序列上引入KpnI和XhoI切點，分別與同樣限制性內切酶酶切的KN連接；另一方面用限制性內切酶SalI從質粒載體pUCATPH中切下潮霉素磷酸轉移酶基因(hyg)與同樣限制性內切酶切的上步質粒連接，得到基因置換載體pPMT，這樣質粒載體pKNS中的預測的MgPPF5的基因組基因(梨孢菌基因組數據庫中contig2.1486的第1458位的核苷酸至第2734位的核苷酸)的大部份序列就被潮霉素磷酸轉移酶基因所代替，在潮霉素磷酸轉移酶基因的兩側分別留下649bp和622bp的MgPPF5基因組基因的側端序列。敲除載體質粒圖譜見圖6。
2.梨孢菌的轉化。
梨孢菌的轉化首選REMI的方法。REMI的原意為限制性內切酶介導的整合，采用不破壞載體內基因的限制性內切酶將載體線性化，在限制性內切酶的介導下轉化梨孢菌的原生質體，被轉化的質粒隨機的整合到基因組中相應的限制性內切酶的切點處。在本發明中，梨孢菌的轉化中省略了限制性內切酶的應用，轉化效率會比添加限制性內切酶的方法低，但不影響被轉化質粒整合到基因組中。原生質體的制備和轉化方法如下1)原生質體的制備500毫升三角瓶裝入150毫升液體CM培養基(酵母提取物0.1％，酶水解干酪素0.05％，葡萄糖1％，硝酸鈣0.1％，磷酸二氫鉀0.02％，硫酸鎂0.025％，氯化鈉0.015％)，分別接入梨孢菌P131和MO2393的1×106個分生孢子，在26-28℃、100轉/分鐘條件下搖培30-32小時，三層滅菌擦鏡紙過濾收集菌絲體，菌絲體用0.7M氯化鈉溶液充分洗滌后轉移至滅菌的50毫升離心管中，每1克菌絲加入1毫升的崩潰酶滲透液(含20毫克/毫升崩潰酶，用0.7M氯化鈉配制)，26-28℃、100轉/分條件下酶解3-4小時后，用0.7M氯化鈉洗滌菌絲體，經三層滅菌擦鏡紙過濾，收集原生質體，4,000轉/分離心15分鐘，先用25毫升STC(1.2 M山梨醇，10mM Tris-Cl，pH7.5，50mM氯化鈣)洗滌原生質體一次，然后分別用10毫升STC洗2次，離心沉淀后用STC將原生質體濃度調至0.5-1×108個/毫升。
2)梨孢菌轉化分別將梨孢菌P131和MO2393原生質體分裝于滅菌的50毫升離心管中，每管150微升，分別加入等體積的線性化的質粒載體(約2微克，梨孢菌P131的離心管中加入用限制性內切酶KpnI線性化的基因置換載體pPMT，梨孢菌X54、H3035和H3587的離心管中分別加用限制性內切酶SmaI線性化的互補載體pKNMT，用STC溶液補足體積)，冰上放置20分鐘，然后逐滴緩慢加入2毫升/管PTC溶液(60％聚己二醇3350，10mM Tris-cL pH7.5，50mM氯化鈣)，冰上靜止20分鐘，加入25毫升/管冰冷的STC，緩慢混勻，4,000轉/分鐘、4℃離心15分鐘，去上清，然后每管加入3毫升的LR培養基(0.1％酵母提取物，0.1％酶水解干酪素，1M蔗糖)，室溫靜置培養12-13小時后，轉入培養皿，加入12毫升冷卻至50℃的SR(LR+1.6％瓊脂)，混勻，待其凝固吹干后，上面鋪一層12毫升的0.7％上層瓊脂(冷卻至50℃，含400微克/毫升的G418(互補實驗)或300微克/毫升的潮霉素(美國Roche公司生產，基因置換試驗)。28℃培養4-6天，將出現的轉化體(梨孢菌突變體MO2393的互補轉化體為CMO2393；梨孢菌P131的基因置換轉化體QMO2393)轉至固體CM培養基(0.6％酵母提取物，0.3％酶水解干酪素，0.3％酸水解干酪素，1％的蔗糖，1.6％瓊脂)(含400微克/毫升的G418(互補實驗)或250微克/毫升的潮霉素(基因置換試驗)上，二次篩選后將單個菌落轉入燕麥片番茄培養基上培養，并進行單孢分離。
互補載體在突變體基因組中的異位整合使該突變體的致病力恢復到野生型的水平，包括在洋蔥表皮上的侵染釘和侵染性菌絲的形成率，以及在親和性水稻品種麗江新團黑谷葉片上形成病斑的數。互補實驗獲得多個轉化子，表型都得到了恢復。互補轉化體CMO2393接種洋蔥表皮上形成侵染釘和侵染性菌絲的比率及與野生型菌的比較如表3所示；圖7和圖8為其柱形圖所示。野生菌株P131和其中一個互補轉化體CMO2393-1都能正常侵染親和性水稻品種麗江新團黑谷葉片，侵染情況如圖9所示。限制性內切酶SalI在congtig2.1486的第68位、3234位和5954位有酶切位點，用該酶酶切處理轉化子總DNA，以contig2.1486第809位到1458位序列作探針進行分子雜交，結果見圖10。野生型P131有一條約3.2Kb的信號帶、突變體MO2393和互補轉化子都有一條大小約2.0Kb的帶而且互補轉化子還有另外大小不同的信號帶，表明他們的插入位點基本是不同的。
基因置換試驗通過把MgPPF5的部分基因組基因序列置換為潮霉素磷酸轉移酶基因序列導致轉化體QMO2393的致病力減弱。實驗獲得5個敲除轉化子，它們在洋蔥表皮上的侵染釘和侵染性菌絲的形成率均以及在親和性水稻品種麗江新團黑谷葉片上形成病斑的能力均下降到突變體水平上。其中，基因置換轉化體QMO2393-1與野生型菌P131在洋蔥表皮上接種后形成侵染釘和侵染性菌絲的情況如表4所示。圖11和圖12為其柱形圖表示。野生菌株P131與基因置換轉化體QMO2393-1對親和性的水稻品種麗江新團黑谷的致病性比較如圖13所示，表3.P131和CMO2393在洋蔥表皮上形成侵染釘和侵染性菌絲的比率
和野生型菌株相比，敲除轉化子形成的病斑數量大大下降。限制性內切酶ApaI在contig2.1486shang上的第705位、1629位、3064位和10179位堿基等處有酶切位點，以contig2.1486上第1700位到2681位堿基序列和潮霉素磷酸轉移酶序列為探針進行分子雜交。結果見圖14和圖15，以contig2.1486第1700到2681位堿基作探針，野生型和異位插入轉化子都有一條約1.4Kb的信號帶，而敲除轉化子由于序列被置換而沒有任何信號帶；以潮霉素磷酸轉移酶紀基因序列為探針，五個敲除轉化子和一個異位插入轉化子都有一條信號帶，敲除轉化子的信號帶大小約為3.4Kb。
表4.基因敲除轉化體QMO2393與野生型菌P131在洋蔥皮上侵染釘和侵染性菌絲的形成率
實施例3、其它植物病原真菌中MgPPF5同源蛋白的生物信息學分析對梨孢菌MgPPF5的氨基酸序列進行tBLAST檢索分析，發現該蛋白在禾谷鐮孢霉(Fusarium graminearum)、新生隱球菌(Cryptococcus neoformans)、黑穗病菌(Ustilago)、白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)和煙曲霉(Aspergillus fumigatus)等真菌中都存在與MgPPF5同源的蛋白質，經過FGENESH軟件和網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進行基因預測，獲得上述真菌中MgPPF5的同源蛋白，其中新生隱球菌、黑穗病菌和白腐真菌同源蛋白和MgPPF5的同源性為100％。粗糙鏈孢霉、玉蜀黍赤霉和煙曲霉中同源序列與MgPPF5在氨基酸序列上的一致性分別為62％、55％和49％，其序列分別如SEQ ID NO5、6、7所示。
序列表<110>中國農業大學<120>真菌中一種控制侵染釘形成的基因MgPPF5及用途<160>7<211>3238<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>1CGTAAATATA TGGGCGATGG TCAATTGTCA TTTTATGTAA TATCGAGGGA ACTAAAAAGT60CTGGATACTC ATTAATCTCT TTGATAAAAT TTCAAATTTC ATCTGCAAAC AATAAGAAAA120TGCCAAAGAT AGTGGTACTA GGGTAGGTTC ACCGTCCAAC ATGTATGACT ACACTGCACT180TCATAAATCA GTAGTGCTAA CACCATTCTT ATAAGGGCGG GTGTTTCGGG CCTTACTGCT240GCCCTTCTGC TTTCACGGAA CAAGGACAAT GATATCACGG TAATTGCAAA GCATATGCCT300GGCGACTATG ATATCGAATA TGCCTCACCA TGGGCAGGAG CCAATGTCTT GCCGTAAGAC360ACTATTTTAA TACGTTCAAT CAATGACCAT CGAGGCTCAA ATTTCCTGAT TAAGTCTTAG420ATGCGATTCG GGGAGGTCCG TTTAGATACT GACCCTGCTG CGCGCTCTCT CAGAATGAAC480ACCGTGGAAG ACAGCCGCTG GGAACGGCGG ACGTTTCCAG AGTTGAAGCG ACTGGCTGAA540GAGGTTCCCG AGGCCGGGAT ACACCTACTG AGTATGCATT TGTAGCCTCA AATCTAGCTG600GCCAAGACAC TGACTTGAGT TTCGACAGAG GTACGCTTGT TCCGACGCAC ACCTGCCTCG660GAAGACAACG AAACCCAGAC CGCGCTGGAC CCCATATTCG CCAAGGACCC ATGGTACAGC720GAAATGTTTG ACGACTTCCG AACCCTGAGC AAGGACGAGC TTCCTGACGG CGTGGTGTCC780GCCAACGAGT TCGGCTCCGT GTGCATCAAC ACGATGCTGT ACCTACCGTG GCTCGTAGGT840CAGTGCCGGG CCAACGGCGT CGTCTTCAAT CGCGCCAACC TCACCCACAT CGCCGAGGCG900GCAGCGCGTC ACCACAGCGG CGCCAAGGCA GACCTGGTCG TCAACGCGAC GGGCGTCACG960GCGTGCAAGC TGGGCGGCGT CATGGACGCG GCGGTGCAGC CCGCCAGGGG CCAGGTAGTC1020GTCGTGCGCA ACGAGCTCCC GCTCATGCTG GGCGCGACCC TGGCTGCCGA AGACGACGCA1080GAGCACCCGG ATGAGATGGT GTATTGCATG ACGCGAGCTG CGGGTGGAGG GACTGTCATT1140GGCGGGTGCT ACCAAAAGGG CAATTGGGAT CCAAACCCGG ATCCGAACCT GGCTGTGCGG1200ATCATGTCCC GCATGGTCGA ATTCTGGCCA GAGATTGCGG ACGGGAAGGG GGTTGCTGGC1260TTGGATGTCA TCCGTCACGG AGTTGGGCTG AGGCCGTACA GGGAGGGAGG TGTCAGGATA1320GAGAAGGAGA GGTTGAGTGA CGGGACGTGG GTTGTGCACA ATTATGGACA TGCGGGTTGG1380GGTTACCAGG GGTCCTATGG CTGCGCAGAG CGCGTGGTCG AGCTGGTCGA CGAGTCTTTT1440AAGGGAAAAC CGAAGCTGTA ATTAGTTGGT TCCTGTCTTG AAGAAGCAAT CGAGGTCTTG1500TAAATGTTTT TCTTTTTTTC CGAATGCCCT TCCTTCGTAA TACCTACCCT GCATGGAATT1560GATGCAACCC CACCACGATT CGACCCCTGA TCGAGACCTG GGCCCAGGCG GAAGCTCCCG1620TGTTTCGTCA TCAAGGAAGC TAACTGTCCA ACGGGAAACA CGACAACAGC AACATCAAAA1680CTCTATCCTG GTCAACTTTG CGGGCAACTT CGACTCTTAC GCAACTCCCC CGATGCGGAT1740GCATTGATCT GCAAAAATGG CTGCAGAAAG GCCGTCAACT CTGGGGAAAC CCGTTCAATT1800CGTCTTTGAT GTCGCAAATG GCCGACATCC TTTGTCGAGA GCCATCCCTC CAATGCTCTT1860AGCCTTTGAC GGTCTGCTCT GTGGCCTGAT CATCAAAAAG GTTCCCTGTC AGTTGCAGCT1920CACTTGGCAC TTTTTTTCTT CAAGCGCGAC TAATAACAGA AATCACTTGC TTCTGTAGAT1980ACCGAGATCG ACTGGACAAC GTACATGCAG CAAATAAAAC AATATGTTAC CGGCGAACGC2040GATTACACCA AAATTACTGG CAGCACCGGT CCTCTGGTCT ACCCAGCAGG CCACGTCTAC2100
ATCTACACAG GCCTGTACCA CATTACAGAT GAGGGAAGGA ATATCTTGTT TGCGCAGCAA2160TTGTTTGGTG CACTCTACCT ACTCACGCTA TACGTTGTCA TAGCGTGCTA CCGAAAGGCA2220AAGGTGCGAT AACGTTGCTC GCCGTCATGA CAATTTCCAT ATTGATGTCC AAGCTAACAA2280ACAGGCATAT GGCAGGTTCC TCCCTATGTT CTCCCCCTCC TCGTCTTGTC GAAACGCCTC2340CACAGTATCT TTGTGCTACG ATGCTTCAAC GATTGCTTCG CCGTGCTCTT CTTCTGGCTC2400GCCATCTACT GCTTCCAACG CCGCGCTTGG TCCCTCGGAG GCGTCTTCTA CAGCTTCGGA2460CTGGGCATCA AGATGACCGT CCTGTTGTCT CTGCCCGCAG TGGGCGTTAT TCTCCTCCTC2520GGCCGCGGTT TCGGAGGCGC GCTAAACGTC GCATCGATCA TGGGCCAGCT CCAGGTTGCC2580ATCGGTCTTC CTTTCTTGTC CAAGAATGCA TGGGGGTACC TTAGCCGAGC ATTCGAACTC2640TCGAGGCAGT TCATGTTCAA GTGGACTGTC AACTGGCGCT TCGTCGGCGA GGAGACTTTC2700TTGAGCAAGC CCTTTGCCAT CACGCTGCTC GCGCTCCACG CATCTGTGTT GCTTGCCTTT2760GTCACGAAGC GGTGGCTCAA GCCTGCGAGC AAAAGCATTG GCGGGCTGAT CGCCCCTCTC2820CTCTCCGGGC GGCCAATATT TACAGCGGAA GAGGCCCAAA CGGCGGCGCG TGCAGTCACG2880CCAGAGTATG TCATGACGAC GATGCTGACG GCCAACATTG TTGGAATGCT ATTTGCGCGG2940TCGCTGCACT ACCAATTCTA CGCCTATCTA GCCTGGTCAA CCCCGTACCT GCTCTGGCGG3000AGCGGAATTC ATCCCCTGCT TCAATGGGGG CTGTGGGCCC TGCAGGAGTG GGCGTGGAAC3060GTCTACCCGA GCACGCCGGT GAGCTCTGGC GTCGTCGTCG GCGTGATGGC TATCACGGTG3120GGTGCGGTTA TGGTTGGGGC AAAGGCGGAG TTTAGACCCC AGGTACCCGT CGCGAAAAAG3180GTTGAAGCAA AGCGCTGAAC CTTCTGGCTT TCGCTGCGCA CGGAATATGA CGCATATA 3238<210>2<211>726<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>2ATGACCGTCC TGTTGTCTCT GCCCGCAGTG GGCGTTATTC TCCTCCTCGG CCGCGGTTTC60GGAGGCGCGC TAAACGTCGC ATCGATCATG GGCCAGCTCC AGGTTGCCAT CGGTCTTCCT120TTCTTGTCCA AGAATGCATG GGGGTACCTT AGCCGAGCAT TCGAACTCTC GAGGCAGTTC180ATGTTCAAGT GGACTGTCAA CTGGCGCTTC GTCGGCGAGG AGACTTTCTT GAGCAAGCCC240TTTGCCATCA CGCTGCTCGC GCTCCACGCA TCTGTGTTGC TTGCCTTTGT CACGAAGCGG300TGGCTCAAGC CTGCGAGCAA AAGCATTGGC GGGCTGATCG CCCCTCTCCT CTCCGGGCGG360CCAATATTTA CAGCGGAAGA GGCCCAAACG GCGGCGCGTG CAGTCACGCC AGAGTATGTC420ATGACGACGA TGCTGACGGC CAACATTGTT GGAATGCTAT TTGCGCGGTC GCTGCACTAC480CAATTCTACG CCTATCTAGC CTGGTCAACC CCGTACCTGC TCTGGCGGAG CGGAATTCAT540CCCCTGCTTC AATGGGGGCT GTGGGCCCTG CAGGAGTGGG CGTGGAACGT CTACCCGAGC600ACGCCGGTGA GCTCTGGCGT CGTCGTCGGC GTGATGGCTA TCACGGTGGG TGCGGTTATG660GTTGGGGCAA AGGCGGAGTT TAGACCCCAG GTACCCGTCG CGAAAAAGGT TGAAGCAAAG720CGCTGA 726
<210>3<211>241<212>PRT<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>3Met Thr Val Leu Leu Ser Leu Pro Ala Val Gly Val Ile Leu Leu Leu1 5 10 15Gly Arg Gly Phe Gly Gly Ala Leu Asn Val Ala Ser Ile Met Gly Gln20 25 30Leu Gln Val Ala Ile Gly Leu Pro Phe Leu Ser Lys Asn Ala Trp Gly35 40 45Tyr Leu Ser Arg Ala Phe Glu Leu Ser Arg Gln Phe Met Phe Lys Trp50 55 60Thr Val Asn Trp Arg Phe Val Gly Glu Glu Thr Phe Leu Ser Lys Pro65 70 75 80Phe Ala Ile Thr Leu Leu Ala Leu His Ala Ser Val Leu Leu Ala Phe85 90 95Val Thr Lys Arg Trp Leu Lys Pro Ala Ser Lys Ser Ile Gly Gly Leu100 105 110Ile Ala Pro Leu Leu Ser Gly Arg Pro Ile Phe Thr Ala Glu Glu Ala115 120 125Gln Thr Ala Ala Arg Ala Val Thr Pro Glu Tyr Val Met Thr Thr Met130 135 140Leu Thr AlaAsn Ile Val Gly Met Leu Phe Ala Arg Ser Leu His Tyr145150 155 160Gln Phe Tyr Ala Tyr Leu Ala Trp Ser Thr Pro Tyr Leu Leu Trp Arg165 170 175Ser Gly Ile His Pro Leu Leu Gln Trp Gly Leu Trp Ala Leu Gln Glu180 185 190Trp Ala Trp Asn Val Tyr Pro Ser Thr Pro Val Ser Ser Gly Val Val195 200 205Val Gly Val Met Ala Ile Thr Val Gly Ala Val Met Val Gly Ala Lys210 215 220Ala Glu Phe Arg Pro Gln Val Pro Val Ala Lys Lys Val Glu Ala Lys225 230 235 240Arg *<210>4<211>1392<212>DNA<213>梨孢菌(Magnaporthe grisea)<400>4CCTTCCTTCG TAATACCTAC CCTGCATGGA ATTGATGCAA CCCCACCACG ATTCGACCCC60
TGATCGAGAC CTGGGCCCAG GCGGAAGCTC CCGTGTTTCG TCATCAAGGA AGCTAACTGT120CCAACGGGAA ACACGACAAC AGCAACATCA AAACTCTATC CTGGTCAACT TTGCGGGCAA180CTTCGACTCT TACGCAACTC CCCCGATGCG GATGCATTGA TCTGCAAAAA TGGCTGCAGA240AAGGCCGTCA ACTCTGGGGA AACCCGTTCA ATTCGTCTTT GATGTCGCAA ATGGCCGACA300TCCTTTGTCG AGAGCCATCC CTCCAATGCT CTTAGCCTTT GACGGTCTGC TCTGTGGCCT360GATCATCAAA AAGGTTCCCT GTCAGTTGCA GCTCACTTGG CACTTTTTTT CTTCAAGCGC420GACTAATAAC AGAAATCACT TGCTTCTGTA GATACCGAGA TCGACTGGAC AACGTACATG480CAGCAAATAA AACAATATGT TACCGGCGAA CGCGATTACA CCAAAATTAC TGGCAGCACC540GGTCCTCTGG TCTACCCAGC AGGCCACGTC TACATCTACA CAGGCCTGTA CCACATTACA600GATGAGGGAA GGAATATCTT GTTTGCGCAG CAATTGTTTG GTGCACTCTA CCTACTCACG660CTATACGTTG TCATAGCGTG CTACCGAAAG GCAAAGGTGC GATAACGTTG CTCGCCGTCA720TGACAATTTC CATATTGATG TCCAAGCTAA CAAACAGGCA TATGGCAGGT TCCTCCCTAT780GTTCTCCCCC TCCTCGTCTT GTCGAAACGC CTCCACAGTA TCTTTGTGCT ACGATGCTTC840AACGATTGCT TCGCCGTGCT CTTCTTCTGG CTCGCCATCT ACTGCTTCCA ACGCCGCGCT900TGGTCCCTCG GAGGCGTCTT CTACAGCTTC GGACTGGGCA TCAAGATGAC CGTCCTGTTG960TCTCTGCCCG CAGTGGGCGT TATTCTCCTC CTCGGCCGCG GTTTCGGAGG CGCGCTAAAC1020GTCGCATCGA TCATGGGCCA GCTCCAGGTT GCCATCGGTC TTCCTTTCTT GTCCAAGAAT1080GCATGGGGGT ACCTTAGCCG AGCATTCGAA CTCTCGAGGC AGTTCATGTT CAAGTGGACT1140GT 1142<210>5<211>442<212>PRT<213>粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)<400>5Met Ala Ala Pro Ser Ser Arg Pro Glu Ser Asn Pro Pro Leu Tyr Lys1 5 10 15Gln Ala Leu Asp Phe Ala Leu Asp Val Ala Asn Gly Arg His Ala Leu20 25 30Ser Lys Leu Ile Pro Pro Ala Leu Phe Leu Val Asp Ala Leu Leu Cys35 40 45
Gly Leu Ile Ile Trp Lys Val Pro Tyr Thr Glu Ile Asp Trp Ala Ala50 55 60Tyr Met Glu Gln Val Ser Gln Ile Leu Ser Gly Glu Arg Asp Tyr Thr65 70 75 80Lys Val Arg Gly Gly Thr Gly Pro Leu Val Tyr Pro Ala Ala His Val85 90 95Tyr Ile Tyr Thr Gly Leu Tyr His Leu Thr Asp Glu Gly Arg Asn Ile100 105 110Leu Leu Ala Gln Gln Leu Phe Ala Gly Leu Tyr Met Val Thr Leu Ala115 120 125Val Val Met Gly Cys Tyr Trp Gln Ala Lys Ala Pro Pro Tyr Leu Phe130 135 140Pro Leu Leu Thr Leu Ser Lys Arg Leu His Ser Ile Phe Val Leu Arg145 150 155 160Cys Phe Asn Asp Cys Phe Ala Val Leu Phe Leu Trp Leu Ala Ile Phe165 170 175Phe Phe Gln Arg Arg Asn Trp Gln Ala Gly Ala Leu Leu Tyr Thr Leu180 185 190Gly Leu Gly Val Lys Met Thr Leu Leu Leu Ser Leu Pro Ala Val Gly195 200 205Ile Val Leu Phe Leu Gly Ser Gly Ser Phe Val Thr Thr Leu Gln Leu210 215 220Val Ala Thr Met Gly Leu Val Gln Ile Leu Ile Gly Val Pro Phe Leu
225 230 235 240Ala His Tyr Pro Thr Glu Tyr Leu Ser Arg Ala Phe Glu Leu Ser Arg245 250 255Gln Phe Phe Phe Lys Trp Thr Val Asn Trp Arg Phe Val Gly Glu Glu260 265 270Ile Phe Leu Ser Lys Gly Phe Ala Leu Thr Leu Leu Ala Leu His Val275 280 285Leu Val Leu Gly Ile Phe Ile Thr Thr Arg Trp Ile Lys Pro Ala Arg290 295 300Lys Ser Leu Val Gln Leu Ile Ser Pro Val Leu Leu Ala Gly Lys Pro305 310 315 320Pro Leu Thr Val Pro Glu His Arg Ala Ala Ala Arg Asp Val Thr Pro325 330 335Arg Tyr Ile Met Thr Thr Ile Leu Ser Ala Asn Ala Val Gly Leu Leu340 345 350Phe Ala Arg Ser Leu His Tyr Gln Phe Tyr Ala Tyr Val Ala Trp Ser355 360 365Thr Pro Phe Leu Leu Trp Arg Ala Gly Leu His Pro Val Leu Val Tyr370 375 380Leu Leu Trp Ala Val His Glu Trp Ala Trp Asn Val Phe Pro Ser Thr385 390 395 400Pro Ala Ser Ser Ala Val Val Val Gly Val Leu Gly Val Thr Val Ala405 410 415
Gly Val Trp Phe Gly Ala Arg Glu Glu Trp Glu Pro Gly Met Lys Ser420 425 430Ser Ser Lys Lys Glu Glu Ala Ala Met Arg435 440<210>6<211>432<212>PRT<213>小麥赤霉病菌(Gibberella zeae)<400>6Met Ala Asp Pro Ala Pro Gly Ala Leu Ala Arg Gly Thr Arg Phe Val1 5 10 15Arg Asn Val Leu Thr Gly Gln His Ala Leu Ser Lys Leu Ile Pro Val20 25 30Ala Leu Trp Leu Ala Asp Ala Val Gly Thr Ser Leu Ile Ile Trp Lys35 40 45Val Pro Tyr Thr Glu Ile Asp Trp Glu Ala Tyr Met Gln Gln Val Ser50 55 60Gln Phe Ile Ser Gly Glu Arg Asp Tyr Thr Lys Ile Glu Gly Gly Thr65 70 75 80Gly Pro Leu Val Tyr Pro Ala Ala His Val Tyr Thr Phe Thr Gly Leu85 90 95Tyr His Ile Thr Asn Glu Gly Glu Asn Ile Phe Leu Ala Gln Gln Ile100 105 110Phe Gly Val Leu Tyr Met Ala Thr Leu Ala Val Val Met Leu Cys Tyr
115 120 125Trp Lys Ala Lys Val Pro Pro Tyr Met Phe Val Phe Leu Ile Ala Ser130 135 140Lys Arg Leu His Ser Leu Phe Val Leu Arg Cys Phe Asn Asp Cys Phe145 150 155 160Ala Val Phe Phe Leu Trp Leu Ser Ile Tyr Phe Phe Gln Arg Arg Asn165 170 175Trp Thr Phe Gly Ser Leu Ala Tyr Thr Trp Gly Leu Gly Ile Lys Met180 185 190Ser Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ile Gly Val Ile Leu Leu Leu Gly195 200 205Arg Gly Phe Trp Pro Gly Leu Arg Leu Ala Trp Leu Met Ala Gln Val210 215 220Gln Phe Ala Ile Gly Ile Pro Phe Ile Met Lys Asn Ser Arg Gly Tyr225 230 235 240Ala Ala Arg Ala Phe Glu Leu Ser Arg Glu Phe Lys Phe Glu Trp Thr245 250 255Val Asn Trp Arg Met Leu Gly Glu Glu Val Phe Leu Ser Lys Ser Phe260 265 270Ala Ile Phe Leu Leu Ala Cys His Val Thr Ala Leu Leu Val Phe Ile275 280 285Ser Gln Arg Trp Leu Gln Pro Thr Gly Arg Pro Leu Ser Ala Met Ile290 295 300
Pro Ser Phe Leu Gln Leu Lys Ser Pro Phe Thr Leu Gln Glu Gln Leu305 310 315 320Arg Ile Ser His Tyr Val Thr Pro Glu Tyr Val Met Thr Thr Met Leu325 330 335Ser Ala Asn Val Ile Gly Leu Leu Phe Ala Arg Ser Leu His Tyr Gln340 345 350Phe Tyr Ala Tyr Leu Ala Trp Ala Ser Pro Tyr Leu Ile Trp Arg Ala355 360 365Thr Glu Asp Pro Phe Ile Val Leu Leu Ile Trp Ala Ala Gln Glu Trp370 375 380Ala Trp Asn Val Phe Pro Ser Thr Asp Leu Ser Ser Arg Val Thr Val385 390 395 400Gly Ala Met Leu Ala Thr Val Val Leu Ala Tyr Arg Gly Thr Ala Arg405 410 415Leu Ala Val Pro Pro Ser Gln Ala Arg Lys Ile Glu Ala Lys Asn Lys420 425 430<2l0>7<211>419<212>PRT<213>煙曲霉(Aspergillus fumigatus)<400>7Met Gln Leu His Arg Ile Asn Thr Met Asp Leu Lys His Ser Leu Arg1 5 10 15Asp Leu Cys Met Asn Pro Arg His Thr Ser Trp Ala Ala Pro Leu Leu20 25 30
Ile Leu Gly Asp Ala Val Leu Cys Ala Leu Ile Ile Trp Arg Val Pro35 40 45Tyr Thr Glu Ile Asp Trp Thr Thr Tyr Met Gln Gln Ile Ser Leu Tyr50 55 60Ile Ser Gly Glu Arg Asp Tyr Thr Leu Ile Lys Gly Ser Thr Gly Pro65 70 75 80Leu Val Tyr Pro Ala Ala His Val Tyr Ile Tyr Asn Ile Leu Tyr His85 90 95Leu Thr Asp Glu Gly Arg Asp Ile Phe Leu Gly Gln Ile Leu Phe Ala100 105 110Ile Leu Tyr Leu Ala Thr Leu Thr Val Ala Met Thr Cys Tyr Arg Gln115 120 125Ala Gly Ala Pro Pro Tyr Leu Leu Val Pro Leu Val Leu Ser Lys Arg130 135 140Leu His Ser Val Phe Met Leu Arg Leu Phe Asn Asp Gly Ile Ala Ala145 150 155 160Phe Ala Met Trp Val Ser Ile Phe Leu Phe Met Asn Lys Lys Leu Ala165 170 175Ala Gly Val Ile Val Trp Ser Thr Gly Val Ala Ile Lys Met Thr Leu180 185 190Leu Leu Leu Ala Pro Ala Ile Ala Met Val Leu Val Leu Ser Leu Ser195 200 205Phe Gly Pro Ser Ile Arg Leu Gly Phe Leu Ala Val Leu Ile Gln Val
210 215 220Leu Phe Gly Ile Pro Phe Leu Arg Asn Asn Pro Ala Gly Tyr Val Ser225 230 235 240Arg Ala Phe Glu Leu Thr Arg Gln Phe Met Phe Lys Trp Thr Val Asn245 250 255Trp Arg Phe Val Gly Glu Glu Leu Phe Leu Ser Arg Lys Phe Ser Leu260 265 270Ala Leu Leu Ala Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Phe Val Ala Thr275 280 285Val Trp Leu Glu Pro Ser Gly Ser Asn Leu Pro Ser Phe Leu Gln Arg290 295 300Leu Ile Gln Arg Arg Tyr Arg Thr Ala Ser Leu Ser Lys Ser Phe Val305 3l0 315 320Met Thr Ala Met Leu Ser Ser Leu Ala Ile Gly Leu Leu Cys Ala Arg325 330 335Ser Leu His Tyr Gln Phe Phe Ala Tyr Leu Ala Cys Ala Thr Pro Phe340 345 350Leu Leu Trp Gln Ala Gly Phe His ProIle Leu Val Tyr Val Val Trp355 360365Ala Ala Gln Glu Trp Ala Trp Asn Ala Tyr Pro Ser Thr Asn Ala Ser370 375 380Ser Leu Val Val Val Leu Ser Leu Ala Ala Gln Val Phe Gly Val Leu385 390 395 400
Gly Asn Ser Phe Ser Arg Lys His Leu Asp Gln Ser Ser Gln Lys Glu405 410 415His Met Gln
權利要求
1.真菌中一種控制侵染釘形成并影響真菌甘露糖代謝的蛋白，在梨孢菌中命名為MGPPF5，其特征在于具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №3；2)將序列表中SEQ ID №3的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且影響真菌甘露糖代謝和侵染釘形成的蛋白質。3)小麥赤霉菌(Gibberella zeae)、粗糙鏈孢霉(Neurospora crassa)和煙曲霉(Aspergillus fumigatus)等真菌中與MGPPF5在氨基酸序列一致性高于40％、且功能相同的同源蛋白。
2.權利要求1所述的影響真菌甘露糖代謝和侵染釘形成的蛋白的編碼基因MgPPF5及其它植物病原真菌的具有相同生物功能的同源基因。該基因的特征在于具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
3.權利要求2所述的基因，其特征還在于其編碼區位于自SEQ ID №1的5′端第844位至3198位堿基之間。
4.權利要求2所述基因的cDNA，其特征在于編碼影響真菌甘露糖代謝和侵染釘形成的蛋白MGPPF5，并具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №3蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；4)與序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
5.利用權利要求2所述的影響真菌甘露糖代謝相關和侵染釘形成的蛋白MGPPF5的編碼基因或其部分序列構建的表達載體，細胞系和宿主菌。
6.利用權利要求1所述的影響真菌甘露糖代謝和侵染釘形成的蛋白的表達、修飾和定位，進行抗真菌藥物的篩選和設計。
7.利用權利要求2所述的影響真菌甘露糖代謝和侵染釘形成的蛋白的基因的表達、轉錄物的剪切，進行抗真菌藥物的篩選和設計。
8.利用權利要求1所述的影響真菌甘露糖代謝和侵染釘形成的蛋白或權利要求2所述的影響真菌甘露糖代謝和侵染釘形成的蛋白的基因參與的信號途徑，進行抗真菌藥物的篩選和設計。
9.權利要求6、7、8所述的抗真菌藥劑包括抗梨孢菌(Magnaporthe grisea)、小麥赤霉菌(Gibberella zeae)等的藥劑。
全文摘要
本發明提供了梨孢菌一個控制侵染釘形成并影響致病力的新基因MgPPF5基因及其用途。該基因及其cDNA、編碼蛋白質分別具有序列表中SEQ ID №1、№2和№3的序列。該基因編碼的蛋白質與甘露糖酰基轉移酶相似。該基因的敲除導致梨孢菌侵染釘形成率顯著下降，并幾乎喪失對水稻的致病能力。本發明還發現該基因的同源基因在植物病原真菌中廣泛存在，并高度相似，在致病過程可能具有相同的功能。因此，MgPPF5及其編碼蛋白的表達、轉錄物的剪切、修飾與定位以及該基因和編碼蛋白參與的信號途徑可作為重要候選靶標，用于設計和篩選抗真菌的新型藥劑。
文檔編號C12N15/63GK1951958SQ20051010944
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月20日 優先權日2005年10月20日
發明者彭友良, 時濤, 趙文生, 王慧鳳, 文朝慧 申請人:中國農業大學