菌體的培養方法

專利名稱：菌體的培養方法
技術領域：
本發明涉及一種菌體的培養方法，其在至少含有碳源及氮源的培養基中，使用可調控攪拌功率和通氣量的通氣攪拌型培養裝置，培養可產生多不飽和脂肪酸或含有以多不飽和脂肪酸為結構脂肪酸的化合物中至少一種的微生物。
背景技術：
在需氧培養中，很多情況下氧的供給左右著培養的結果(例如多不飽和脂肪酸(以下記為“PUFA(poly unsaturated fatty acid)”)的生產性能等)，考慮放大時，在重視通氣量、攪拌速度及通氣攪拌所需功率這些因子的同時，還需重視KLa(體積氧傳質系數)指標。
在考慮放大時，將KLa作為指標是指即使培養槽的形式和規模不同，如氧的傳遞速度相等，也可得到同樣的培養結果的考慮方法(例如、參照非專利文獻1和2)。
測定KLa的方法有種種提案，但操作均較繁雜，為能更簡便地推斷出KLa，Cooper等提出了KLa＝K(P/V)0.95(Vs)0.67[K比例常數、P攪拌所需功率(W)、V液量(m3)、Vs空氣線速度(m/sec)]的近似表達式(參照非專利文獻3)。
村上圣等，化學工程學論文集26(4)557-562(2000)[非專利文獻2]A.E.Humphery，發酵工程學會志，42334-345(1964)[非專利文獻3]C.M.Cooper et al.，Ind.Chem.Eng.36504-509(1944)

發明內容
Cooper等提出的上述近似表達式雖可預測KLa，但因其是使用12片攪拌葉的Vaned disk型葉輪求出的KLa和操作條件之間的相關關系，所以嚴格地講使用與其不同的培養槽時將不能得出其相關關系。
另外，Cooper等的實驗是在水中進行的，對細菌、酵母等流變性低的培養來說較適用，但對流變性高的絲狀真菌和放線菌的培養來說，存在很大的差異。
鑒于以上實際情況，本發明提供一種培養方法，即在放大過程中，不需實際求出KLa(體積氧傳質系數)，而且能確保PUFA或含有以PUFA為結構成分的化合物的良好的生產性能。
本發明第1特征的構成重點是在至少含有碳源及氮源的培養基中，使用可調控攪拌功率和通氣量的通氣攪拌型培養裝置，培養可產生多不飽和脂肪酸或含有以多不飽和脂肪酸為結構脂肪酸的化合物中至少一種的微生物的培養方法，從培養開始到所規定的時間內，進行每單位液量攪拌功率為269(W/m3)以下的機械攪拌，在所規定時間之后，當P攪拌所需功率(W)、V液量(m3)、Vs空氣線速度(m/sec)時，在滿足KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)為59以上，空氣線速度參數Vs0.67為0.075以上并且攪拌所需功率參數(P/V)0.95為203以上的范圍內調控最大通氣量或最大所需攪拌功率中至少一項。
本發明第1特征的構成為只要是至少含有碳源及氮源的培養基即可進行培養，因使用機械攪拌，所以可配制始終為均勻混合的培養基。其結果能確保菌體的增殖及在生產性能上的重復性。
且因在通氣攪拌型培養槽內培養，所以能高效地培養出產生PUFA或含有以PUFA為結構成分的化合物中至少一種(以下記為“PUFA類”)的需氧性微生物。
因上述通氣攪拌型培養槽的攪拌功率和通氣量均可調控，例如可隨時將培養液中的溶解氧濃度調節到適合產生PUFA類的范圍內。
另外，從培養開始時到所規定的時間內，由于進行每單位液量的攪拌功率為269(W/m3)以下的、攪拌剪切力較小的機械攪拌，所以能減少放線菌或絲狀真菌的菌絲及球狀菌體所受的物理損傷。其結果可在適合生產PUFA類的形態下培養菌體。
并且因在所規定時間之后，可在滿足KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)為59以上、空氣線速度參數Vs0.67[(m/sec)0.67]為0.075以上并且攪拌所需功率參數(P/V)0.95[(W/m3)0.95]為203以上的范圍內調控最大通氣量或最大所需攪拌功率中至少一項，所以能更有效地進行PUFA類生產菌的培養。因此能促進PUFA類生產性能的提高[P攪拌所需功率(W)、V液量(m3)、Vs空氣線速度(m/sec)]。即在KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)為59以下、空氣線速度參數Vs0.67[(m/sec)0.67]為0.075以下時，如圖1及圖2所示，PUFA類(此處為花生四烯酸)的產量少。另外，將攪拌所需功率參數(P/V)0.95[(W/m3)0.95]定為203以上是因如表4的Ex.4-2欄所示，每單位液量的攪拌功率為培養開始時的269(W/m3)以上時，即攪拌所需功率參數(P/V)0.95[(W/m3)0.95]為203以上時，應進行大于培養開始時的攪拌。并且優選為比培養開始時更強的攪拌。
更有在放大過程中，在上述數值的基礎上，只要設定最大通氣量及最大所需攪拌功率，即可使用最低的通氣量和攪拌功率進行高生產率的培養。因其與降低運轉成本有關，所以可實現生產效率非常高的放大。
本發明第2特征的構成為上述多不飽和脂肪酸為花生四烯酸。
花生四烯酸在構成血液、肝臟等重要器官的脂肪酸中約占10％左右(例如，人體血液的磷脂中脂肪酸的組成比為花生四烯酸占11％、EPA占1％、DHA占3％)，其作為細胞膜的主要構成成分參與細胞膜流動性的調節并在體內代謝上表現出各種功能，同時，作為前列腺素類的直接前驅物質起著重要的作用。
特別是近來作為嬰幼兒營養成份之一的花生四烯酸的作用，以作為表示神經活性作用的內源性大麻酯(Cannabinoids)(2-四氫大麻酚(Arachidonoyl)單甘油、內源性大麻酯(Anandamide))的結構脂肪酸而引人注目。
通常來說，攝取富含亞油酸的食品可轉換成花生四烯酸，但由于成人病患者及其易患人群、嬰兒、老年人的體內參與生物合成的酶活力低下，易導致花生四烯酸不足。因此最好是直接攝取作為油脂(甘油三酯的結構脂肪酸)的花生四烯酸。
根據本發明第2特征的構成，能高效穩定地生產特別是作為嬰幼兒營養成份之一而起重要作用的花生四烯酸或以花生四烯酸為結構脂肪酸的油脂等的化合物中至少一種。并將以上物質添加入飲料食品、治療用營養食品、飼料以及醫藥品中，通過制造銷售，為保持和增進大眾的健康做出貢獻。
本發明第3特征的構成重點為PUFA類生產菌屬于被孢霉屬(Mortierella)被孢霉亞屬(Mortierella)。
根據本發明第3特征的構成，如后詳細所述，因PUFA類生產菌屬于被孢霉屬(Mortierella)被孢霉亞屬(Mortierella)，所以能高效地生產PUFA類，且此菌體容易獲得。
本發明第4特征的構成重點在于培養開始后的所規定時間優選為12～24小時。
根據本發明第4特征的構成，進行每單位液量的攪拌功率為269(W/m3)以下的、攪拌剪切力較小的機械攪拌，在培養開始后12～24小時期間，培養中的菌體發生由漿狀菌絲向球狀菌體轉變的形態變化，其形態變化的有效進行可抑制規定時間后的培養液黏度的極端上升。因此能更高效地生產PUFA類。


圖1為各培養中所得花生四烯酸的產量與KLA值的關系圖。
圖2為構成KLA值的2個參數(P/V)0.95值與Vs0.67值的相關關系圖。
具體實施例方式
本發明所使用的是對PUFA或以PUFA為結構脂肪酸的化合物(例如油脂(甘油三酯)及/或磷脂)中至少一種具有生產能力的微生物，例如，屬于被孢霉屬(Mortierella)、耳霉屬(Conidiobolus)、腐霉屬(Pythium)、疫霉屬(Phytophthora)、青霉屬(Penicillium)、枝孢屬(Cladosporium)、毛霉屬(Mucor)、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、蟲霉屬(Entomophthora)、刺孢囊霉屬(Echinosporangium)、水霉屬(Saprolegnia)的微生物。
特別是屬于被孢霉屬(Mortierella)被孢霉亞屬(Mortierella)的微生物，如長孢被孢霉(Mortierella elongata)、微小被孢霉(Mortierella exigua)、喜濕被孢霉(Mortierella hygrophila)、高山被孢霉(Mortierella alpina)等。具體地說可為長孢被孢霉(Mortierella elongata)IFO8570，微小被孢霉(Mortierellaexigua)IFO8571，喜濕被孢霉(Mortierella hygrophila)IFO5941，高山被孢霉(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等的菌株。
這些菌株中任一種均可從日本大阪市發酵研究所(IFO)、美國典型菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)及荷蘭的霉菌中心保藏所(Centrralbureau voor Schimmelcultures(CBS))中不受限制地得到。另外也可使用本發明研究小組從土壤中分離的菌株長孢被孢霉SAM0219(微工研菌寄第8703號)(微工研條寄第1239號)和高山被孢霉1S-4株。
為培養本發明所使用的菌株，本培養將其菌株的孢子、菌絲或預先培養所得的種子培養液或由種子培養回收的菌體接種于液體培養基中。液體培養基的碳源一般可使用葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、甘油、甘露醇、糖化淀粉等，但不僅限于此種類。氮源除可使用蛋白胨、酵母膏、麥芽汁、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米漿、大豆蛋白、脫脂大豆、棉籽餅等的天然氮源之外，還可使用尿素等有機氮源及硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨等無機氮源，特別是從大豆中得到的氮源，具體為大豆、脫脂大豆、大豆餅、食用大豆蛋白、豆腐渣、豆乳、熟豆面等，尤其是脫脂大豆加熱變性后的產物，更優選的是可將脫脂大豆進行70～90℃熱處理，除去其乙醇可溶成分后的產物單獨或復數或與上述氮源結合使用。
此外，根據需要除可使用磷酸離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子、鈣離子以外，還可把鐵、銅、鋅、錳、鎳、鈷等的金屬離子和維生素等作為微量營養源使用。只要對微生物的生長和發育無害，對這些培養基成分的濃度均無特殊要求。從實用上，一般碳源的總添加量為0.1～40％(重量百分比)，優選為1～25％(重量百分比)；氮源的總添加量為2～15％(重量百分比)，優選為2～10％(重量百分比)，更優選為初次的碳源添加量為1～5％(重量百分比)，初次的氮源添加量為3～8％(重量百分比)，培養過程中流加碳源及氮源，最優選的是只流加碳源進行培養。
另外，為使不飽和脂肪酸的產量增加，作為不飽和脂肪酸的前體，例如十六烷或類十六烷酸的碳氫化物；油酸或類亞油酸的脂肪酸或其鹽，或是脂肪酸酯，例如乙酯、甘油脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂肪酸酯；或是類橄欖油、大豆油、菜籽油、棉籽油或椰子油的油脂類均可被單獨或結合使用。基質的添加量針對培養基為0.001～10％，優選在0.5～10％。并可把這些基質作為唯一的碳源用于培養。
本發明中微生物的培養溫度因所使用的微生物不同而不同。例如，可為5～40℃，優選為20～30℃，亦可先在20～30℃下培養，使菌體增殖后再于5～20℃下繼續培養使其生產不飽和脂肪酸。此種溫度管理還可使生成脂肪酸中的多不飽和脂肪酸的比例上升。
種子培養包括通氣攪拌培養、振蕩培養、固體培養或靜置液體培養，本培養進行的是通氣攪拌培養。將本培養開始時(種子培養液接種時)的培養基的pH調至5～7，優選為5.5～6.5。本培養的培養期間通常為2～30日，優選為5～20日，更優選為5～15日。
本培養方法使用的是可調控攪拌功率和通氣量的通氣攪拌型培養裝置，使用裝有攪拌葉直徑(＝d)、培養槽直徑(＝D)的比率為d/D＝0.30～0.6，優選為d/D＝0.34～0.55，更優選為d/D＝0.37～0.55，最優選為d/D＝0.42～0.55的具備攪拌葉的培養槽進行培養。
屬于被孢霉屬被孢霉亞屬的微生物作為產生以花生四烯酸為主要結構脂肪酸的油脂(甘油三酯)的微生物而廣為人知，本發明人等通過對上述菌株施以誘變處理，獲得了能產生以二同型-γ-亞麻酸為主要結構脂肪酸的油脂(甘油三酯)的微生物(特開平5-91887)和能產生以ω9系列多不飽和脂肪酸為主要結構脂肪酸的油脂(甘油三酯)的微生物(特開平5-91888)。另外，還獲得了對高濃度碳源具有耐性的微生物(WO98/39468)。這些微生物屬于被孢霉屬被孢霉亞屬，且使用本發明的培養法進行培養可提高其生產能力。
將使用上述的菌體、培養基、培養裝置進行本培養的培養過程概況說明如下。
首先在培養開始時，使用每單位液量的攪拌功率為269(W/m3)以下的較弱的機械攪拌的同時進行通氣培養。
并且此時的通氣量無特別限制。將放線菌或絲狀真菌置于需氧條件下進行液體培養，從營養增殖期向生產期轉移時，會有從漿狀菌絲向球狀菌體(別名菌絲球)轉變的形態變化。
此處所述的球狀菌體是指在液體培養基中培養時放線菌或絲狀真菌的菌形態之一，是平均直徑為0.2～數厘米的球狀或紡錘狀菌絲的集合體。
另外漿狀菌絲是指在液體培養基中培養時放線菌或絲狀真菌的典型菌形態，菌絲呈現出直線或放射狀伸展的分散狀態。也就是說從漿狀菌絲向球狀菌體的形態變化是與PUFA類的生產率密切相關的。
進行攪拌剪切力大的機械攪拌時，會破壞球狀菌體的菌形態，妨礙向球狀菌體的形態形成，同時伴隨菌體的增值培養液的黏度會升高，混合效率下降，其結果使氧不能充分供給菌體，因而降低了PUFA類的生產率。
因此為促使向球狀菌體的形態形成，歷來均采用研究培養基的最佳組成或調整通氣氣體中氧分壓的方法。本發明是通過從培養開始到所規定的時間內進行攪拌剪切力較小的攪拌，以促進向球狀菌體的形態形成。
在通氣攪拌型裝置上安裝溶解氧濃度監測傳感器，以監測培養液中溶解氧的濃度。
因在菌體增殖的同時培養基中的溶解氧濃度(DO)開始降低，所以在即將到達不影響PUFA類生產性能的最低DO值(約50％)之前，提高攪拌功率和通氣量以維持所需的DO值。
達到此最低DO值的時間大約為從培養開始的12～24小時之后。之后在滿足KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)為59以上，空氣線速度參數Vs0.67[單位(m/sec)0.67]為0.075以上并且攪拌所需功率參數(P/V)0.95[單位(W/m3)0.95]為203以上的范圍內，調控最大通氣量或最大所需攪拌功率中至少一項進行培養。作為調控的具體實例，例如，可提高最大通氣量或最大所需攪拌功率中的任一方，也可同時提高其雙方。
此處的KLA值為本發明人等根據Cooper等提出的KLa(體積氧傳質系數)＝K(P/V)0.95(Vs)0.67的近似表達式重新設定的參數。并由本發明人等首次發現了KLA值和PUFA類的生產量之間有良好的正相關。
培養開始約40～48小時后，在培養基內的營養成分(特別是氮源)消耗殆盡的同時菌體濃度達到最高值，由營養增殖期向PUFA類生產期的轉移的同時PUFA類在菌體內的蓄積也被促進。
之后在培養過程中隨時進行葡萄糖的培養基流加，培養約5～15天。培養結束后，回收菌體并干燥，干燥菌體用正己烷萃取等以獲得PUFA或含有以PUFA為結構脂肪酸的化合物(例如為甘油三酯或磷脂等)中至少一種。
實施例實施例1(攪拌所需功率的測定)在10kL容量的通氣攪拌培養槽內加滿6kL(＝V)的自來水，在1vvm的通氣條件下，測定用各種攪拌轉數運轉時的攪拌消耗功率(＝A)。之后，測定在同培養槽內用同轉數空轉時的攪拌所需功率(＝B)。空轉時，為防止攪拌軸過熱，加水時下部的水位不僅應沒過攪拌葉，還應沒過攪拌軸下部的軸承部進行運轉。
測定功率需在變流器的一次側(電源側)安裝功率計(日置電機株式會社制鉗式功率計)，測定有效功率。
把A值減B值所得的差值作為攪拌所需功率(＝P)，將P值用液量除所得值為單位液量所需攪拌功率(＝P/V)。求出的實測值如下表所示。


把實測值標在橫軸為攪拌轉數(＝N)、縱軸為單位液量攪拌所需功率(＝P/V)的圖上，用最小二乘法求出近似表達式P/V＝XNY的參數X及Y。使用所求出的X值、Y值及其近似表達式求出在任意攪拌轉數條件下單位液量的攪拌所需功率。
停止向培養槽內通氣時攪拌所需功率會增加，可用和上述同樣的方法求出無通氣時的X值及Y值后，再求出任意攪拌轉數條件下單位液量的攪拌所需功率。
實施例2(培養液中的攪拌所需功率)把花生四烯酸的生產菌高山被孢霉1S-4株(Mortierella alpina1S-4株)置于10kL的培養槽內培養。在培養液量6kL、1vvm的通氣條件下，測定用各種攪拌轉數運轉時的攪拌消耗功率。其結果如下表所示。


比較使用實施例1和實施例2測出的攪拌功率，在水中運轉時(實施例1)與在培養液中運轉時(實施例2)的攪拌功率無顯著差異。由此可認為在培養液中的攪拌所需功率與同培養槽內在浸水運轉時測得的攪拌所需功率十分近似。
實施例3把M.alpina 1S-4株的孢子懸浮液0.1vol.％接種于含酵母膏1.0％、葡萄糖2.0％、pH為6.3的培養基中，往復振蕩100rpm，于溫度28℃條件下開始種子培養(第一階段)，培養3日。
再于容量50L的通氣攪拌培養槽內配制含酵母膏1％、葡萄糖2％、大豆油0.1％、pH為6.3的培養基30L，在其中接種種子培養(第一階段)液，在攪拌轉數為200rpm、溫度28℃、槽內壓150kPa的條件下開始種子培養(第二階段)，培養2日。
之后在10kL容量的通氣攪拌槽(培養槽內直徑為1.8m)內配制本培養的培養基。培養基的配制法為首先將4500L培養基(培養基A大豆粉336kg、KH2PO416.8kg、MgCl2·6H2O 2.8kg、CaCl2·2H2O 2.8kg、大豆油5.6kg)的pH調整為4.5，在121℃、20分鐘條件下在本培養槽內進行滅菌。另一培養基為把1000L培養基(培養基B含水葡萄糖112kg)于121℃、20分鐘的條件下在其他培養槽內滅菌后，將其保持無菌狀態加入到本培養槽的培養基A中(添加后的培養基為培養基C)。在培養基C中保持無菌狀態添加滅菌氫氧化鈉水溶液，將pH調整為6.1后，把容量28L的種子培養液(第二階段)通過無菌操作進行接種，制成合計為5600L液量的初期培養液(培養槽容積為10kL)。在溫度26℃、內壓200kPa、通氣量49m3/hr(空氣線速度(＝Vs)為0.00535m/sec)、單位培養液量的所需攪拌功率(＝P/V)為112W/m3的條件下開始培養。如下式求出培養開始時的各參數值。
(P/V)0.9589[(W/m3)0.95]Vs0.670.03 [(m/sec)0.67]KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)2.67[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]在培養第15小時時將攪拌功率(＝P/V)變更為880W/m3后，到培養第40小時之間逐漸加大通氣量和攪拌轉數，直到提高通氣量到437m3/hr(空氣線速度(＝Vs)為0.0477m/sec)，攪拌功率(＝P/V)到3250W/m3為止。在提高了通氣攪拌的狀態下如下式求出各參數值。
(P/V)0.952169[(W/m3)0.95]Vs0.670.130[(m/sec)0.67]KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)282[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]培養過程中如下表所示進行培養基流加，本培養共進行了306小時。培養結束時，由于培養基受流加時培養液增加及蒸發時培養液減少的影響，培養液的總量變為7750L。
本培養時間流加培養基19小時后含水葡萄糖280kg/460L43小時后含水葡萄糖280kg/450L67小時后含水葡萄糖252kg/390L91小時后含水葡萄糖252kg/410L120小時后 含水葡萄糖224kg/370L140小時后 含水葡萄糖168kg/280L163小時后 含水葡萄糖168kg/270L
培養結束后，在120℃、20分鐘條件下滅菌，之后用連續式脫水機回收濕菌體，用振動流動層干燥機進行熱風干燥(熱風溫度120℃)，將水分含量干燥到2wt％。把干燥后的菌體置于流動層內供給室溫空氣，冷卻到40℃后，再用空氣輸送機將干燥菌體輸送到充填場所。將得到的干燥菌體與氮氣同時充填到容量約1m3的鋁制大包裝袋內，將袋口熱封后，置于10℃以下的冷藏室保藏。
從大包裝袋內取出干燥菌體進行正己烷萃取，過濾正己烷萃取液除去所含的固形成分后，減壓加熱除去正己烷，可獲得以花生四烯酸為結構脂肪酸的粗制油。
實施例4(培養開始時攪拌所需功率的影響)與實施例3同法進行種子培養，配制本培養的培養基。除把培養開始時的攪拌條件如下表所示各種條件設定外，本培養均與實施例3同條件進行。
培養結果顯示培養開始時的P/V值對花生四烯酸的生產有很大影響。


(※)由于各培養中蒸發和葡萄糖添加使培養液液量發生變動，所以如下式求校正值。
花生四烯酸的產量(校正值)＝培養結束時單位培養液中花生四烯酸的產量×培養結束時的液量/培養開始時的液量實施例5(培養開始時通氣量的影響)與實施例3同法進行種子培養，配制本培養的培養基。除將培養開始時的通氣條件如下表所示各種條件設定外，本培養均與實施例3同條件進行。因在實驗No.Ex.5-1及5-2的任意一項中均設定了比培養開始時高的通氣量，所以，在培養開始后20小時之內，與Ex.3相比具有極高的起泡性。因此，為消除泡沫，采用了間歇式停止通氣法。
通氣時會產生泡沫，泡沫高度開始上升。如泡沫的高度上升到槽內頂層附近(排氣管附近)時，立即停止液中通氣。停止通氣后，泡沫高度開始下降，培養液中的溶解氧濃度(DO)也同時開始降低。在即將到達不影響花生四烯酸生產性能的最低DO值之前再次開始通氣。反復進行此操作直到控制住起泡性為止。本實施例中的空氣線速度Vs是指通氣狀態下的空氣線速度，不是考慮到間歇通氣法時通氣量的積算平均值。另外，不影響花生四烯酸生產性能的最低DO值是指停止通氣時引起的DO的減少對經過的時間失去直線關系時的DO濃度(臨界DO濃度)。臨界DO濃度是預先在同等條件下培養時，根據動態測定法(《發酵工程學基礎》，1988，學會出版中心，石崎文彬譯)測得的。
培養結果顯示培養開始時的Vs值對花生四烯酸的生產基本無影響。


(※)由于各培養中蒸發和葡萄糖添加使培養液液量發生變動，所以如下式求校正值。
花生四烯酸的產量(校正值)＝培養結束時單位培養液中花生四烯酸的產量×培養結束時的液量/培養開始時的液量實施例6(最高KLA值的影響)與實施例3同法進行種子培養，配制本培養的培養基。與實施例3相同，在溫度26℃、內壓200kPa、通氣量49m3/hr(空氣線速度(＝Vs)為0.00535m/sec)、單位培養液量的所需攪拌功率(＝P/V)為112W/m3的條件下開始培養。如下式求出培養開始時的各參數值。
(P/V)0.9589[(W/m3)0.95]Vs0.670.03[(m/sec)0.67]KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)2.67[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]在培養第18小時時將攪拌所需功率(＝P/V)變更為380W/m3后，到培養第48小時之間逐漸加大通氣量和攪拌轉數，在各種最大通氣量及最大攪拌功率條件下進行培養。在圖1中，將在各培養中所得的花生四烯酸的產量和培養中最大KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)值的關系進行制圖。由此可看出，KLA值與花生四烯酸的產量之間表現出良好的正相關關系。另外在圖1中，即使把KLA值增加到100以上，花生四烯酸的產量有時也只為15～16g/L左右(例如，圖1中用A所示的范圍內的圖形)，也可看出KLA值與花生四烯酸的產量之間有時會偏離相關關系。為調查此原因，又繪制了構成KLA值的2個參數(P/V)0.95值和Vs0.67值之間的相關關系圖(圖2)。在此，圖2中A’所示范圍內的圖與圖1中A所示范圍內的圖相對應。從結果可知，即使提高KLA值，如Vs0.67值未達到0.075以上時，也不能得出由提高KLA值而使花生四烯酸的產量增大的結果。
實施例7與實施例3同法進行種子培養。將與實施例3相同濃度組成的本培養培養基1300L置于2kL容積的培養槽內配制，在溫度26℃、內壓200kPa、空氣線速度0.0087(m/sec)、單位培養液量的所需攪拌功率(＝P/V)為264W/m3的條件下開始培養。如下式求出培養開始時的各參數值。
(P/V)0.95199[(W/m3)0.95]Vs0.670.042[(m/sec)0.67]KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)8.28[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]在培養第24小時時將攪拌功率(＝P/V)變更為890W/m3后，到培養第48小時之間逐漸加大通氣量和攪拌轉數，直到提高空氣線速度Vs到0.084(m/sec)，攪拌功率P/V到1493W/m3為止。在提高了通氣攪拌的狀態下如下式求出各參數值。
(P/V)0.951036[(W/m3)0.95]Vs0.670.191[(m/s ec)0.67]KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)198[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]培養過程中添加與實施例3同組成濃度的葡萄糖，本培養進行了306小時。其結果，獲得20.0g/L的花生四烯酸的產量(作為校正值)。
實施例8使用作為花生四烯酸生產菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)CBS754.68株進行培養。從保存菌株開始用與實施例3同樣的方法進行種子培養，配制本培養的培養基。在溫度26℃、內壓200kPa、通氣量49m3/hr(空氣線速度(＝Vs)為0.00535m/s ec)、單位培養液量的所需攪拌功率(＝P/V)為112W/m3的條件下開始培養。如下式求出培養開始時的各參數值。
(P/V)0.9589[(W/m3)0.95]Vs0.670.03[(m/sec)0.67]KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)2.67[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]在此條件下開始培養，將最初的攪拌轉數的變更時間作多種設定進行復數次培養(實驗No.Ex.6-1～6-4)。最初的攪拌轉數變更時，將攪拌功率(＝P/V)變更為380W/m3，之后到培養第48小時之間逐漸加大通氣量和攪拌轉數，直到提高最大通氣量到437m3/hr(空氣線速度(＝Vs)為0.0477m/sec)，最大攪拌功率(＝P/V)到3250W/m3為止。在提高了通氣攪拌的狀態下如下式求出各參數值。
(P/V)0.952169[(W/m3)0.95]Vs0.670.130[(m/sec)0.67]KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)282[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]培養過程中添加與實施例3相同的葡萄糖，本培養進行了288小時。
培養結果顯示培養開始后的最初的攪拌功率變更時間對花生四烯酸的生產有很大影響。


(※)由于各培養中蒸發和葡萄糖添加使培養液液量發生變動，所以如下式求校正值。

花生四烯酸的產量(校正值)＝培養結束時單位培養液中花生四烯酸的產量×培養結束時的液量/培養開始時的液量實施例9(DGLA生產)使用高山被孢霉(Mortierella alpina)SAM1860株作為二同型(dihomo)-γ-亞麻酸的生產菌。把保藏菌株接種在配制有含酵母膏1％、葡萄糖2％、pH為6.3的培養基的燒瓶內，在100rpm、28℃條件下開始種子培養(第一階段)，培養3日。之后，把含酵母膏1％、葡萄糖2％、大豆油0.1％、pH為6.3的培養基30L于50L容量的通氣攪拌培養槽內配制，在其中接種上述的種子培養(第一階段)的培養液，在攪拌轉數200rpm、溫度28℃、槽內壓150kPa的條件下進行種子培養(第二階段)，培養2日。
之后在含脫脂大豆粉4％、葡萄糖1.8％、KH2PO40.3％、Na2SO40.1％、MgCl2·6H2O 0.05％、CaCl2·2H2O 0.05％、大豆油0.1％、pH為6.1的培養基中接種0.5％的種子培養液(第二階段)，在4000L液量中開始本培養。
在溫度26℃、內壓200kPa、通氣量52m3/hr(空氣線速度(＝Vs)為0.0057m/sec)、單位培養液量中所需攪拌功率(＝P/V)為30W/m3的條件下開始培養。如下式求出培養開始時的各參數值。
(P/V)0.9525[(W/m3)0.95]Vs0.670.0313[(m/sec)0.67]KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)0.782[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]在此條件下開始培養，在培養開始后第19小時時變更攪拌功率，到培養第48小時之間逐漸加大通氣量和攪拌轉數，直到提高最大通氣量到240m3/hr(空氣線速度(＝Vs)為0.0262m/sec)，最大攪拌功率(＝P/V)到1251W/m3為止。在提高了通氣攪拌的狀態下如下式求出各參數值。
(P/V)0.95875.9[(W/m3)0.95]Vs0.670.0871[(m/sec)0.67]KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)76.3[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]培養過程中添加葡萄糖，本培養進行了160小時。培養結束時二同型γ亞麻酸的生成濃度為7.0g/L。
實施例10(M酸生產)使用高山被孢霉(Mortierella alpina)SAM2086株作為M酸的生產菌。把保藏菌株接種在配制有含酵母膏1％、葡萄糖2％、pH為6.3的培養基的燒瓶內，在100rpm、28℃條件下開始種子培養(第一階段)，培養3日。之后，把含酵母膏1％、葡萄糖2％、橄欖油0.1％、pH為6.3的培養基30L于50L容量的通氣攪拌培養槽內配制，在其中接種上述的種子培養(第一階段)的培養液，在攪拌轉數200rpm、溫度28℃、槽內壓150kPa的條件下進行種子培養(第二階段)，培養2日。
之后在含脫脂大豆粉4％、葡萄糖1.8％、KH2PO40.3％、Na2SO40.1％、MgCl2·6H2O 0.05％、CaCl2·2H2O 0.05％、橄欖油0.1％、pH為6.1的培養基中接種0.5％的種子培養液(第二階段)，在4000L液量中開始本培養。
在溫度24℃、內壓200kPa、通氣量52m3/hr(空氣線速度(＝Vs)為0.0057m/sec)，單位培養液量中所需攪拌功率(＝P/V)為30W/m3條件下開始培養。如下式求出培養開始時的各參數值。
(P/V)0.9525[(W/m3)0.95]Vs0.670.0313[(m/sec)0.67]KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)0.782[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]
在此條件下開始培養，在培養開始第22小時時變更攪拌功率，到培養第48小時之間逐漸加大通氣量和攪拌轉數，直到提高最大通氣量到240m3/hr(空氣線速度(＝Vs)為0.0262m/sec)，最大攪拌功率(＝P/V)到1098W/m3為止。在提高了通氣攪拌的狀態下如下式求出各參數值。
(P/V)0.95773.8[(W/m3)0.95]Vs0.670.0871[(m/sec)0.67]KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)67.4[(W/m3)0.95·(m/sec)0.67]培養過程中添加葡萄糖，本培養進行了376小時。培養結束時M酸的生成濃度為6.0g/L。
因能高效穩定地生產特別是作為嬰幼兒營養成份之一而起重要作用的花生四烯酸或以花生四烯酸為結構脂肪酸的油脂等的化合物中至少一種，所以可將以上物質添加入飲料食品、治療用營養食品、飼料以及醫藥品等的制造中使用。
權利要求
1.一種菌體的培養方法，其在至少含有碳源及氮源的培養基中，使用攪拌功率和通氣量可調控的通氣攪拌型培養裝置，培養可產生多不飽和脂肪酸或含有以多不飽和脂肪酸為結構脂肪酸的化合物中至少一種的微生物；從培養開始到所規定的時間內，進行每單位液量攪拌功率為269(W/m3)以下的機械攪拌，在所規定時間之后，當P攪拌所需功率(W)、V液量(m3)、Vs空氣線速度(m/sec)時，在滿足KLA(＝(P/V)0.95Vs0.67)為59以上，空氣線速度參數Vs0.67為0.075以上，并且攪拌所需功率參數(P/V)0.95為203以上的范圍內調控最大通氣量或最大所需攪拌功率中至少一項。
2.根據權利要求1所述的菌體培養方法，其特征為上述多不飽和脂肪酸為花生四烯酸。
3.根據權利要求1所述的菌體培養方法，其特征為上述微生物屬于被孢霉屬(Mortierella)被孢霉亞屬(Mortierella)。
4.根據權利要求1～3中任一項所述的菌體培養方法，其特征為上述所規定的時間優選為12～24小時。
全文摘要
本發明涉及一種菌體的培養方法，其在至少含有碳源及氮源的培養基中，使用可調控攪拌功率和通氣量的通氣攪拌型培養裝置，培養可產生多不飽和脂肪酸或含有以多不飽和脂肪酸為結構脂肪酸的化合物中至少一種的微生物；且從培養開始到所規定的時間內，進行每單位液量攪拌功率為269(W/m
文檔編號C12P7/40GK1746290SQ200510099108
公開日2006年3月15日 申請日期2005年9月5日 優先權日2004年9月6日
發明者東山堅一 申請人:三得利株式會社