專利名稱：一種高密度細胞培養方法及其生物反應裝置的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞培養方法及其生物反應裝置，尤其涉及一種細胞高密度循環式或連續式培養方法及其生物反應裝置。
背景技術：
膜生物反應器是將膜分離技術引入生物反應器后所形成的一類新型設備，現有的膜生物反應器(MBA)主要用于污水處理，其作用原理是利用膜截留活性污泥中的微生物以提高其污水生物處理的效率，其核心問題是解決污水生物處理過程中膜過濾污染即過濾通量下降的問題。由于生物污水處理系開放式的發酵過程，并不涉及到雜菌的污染，即是此類生物反應器中所采用的膜設備無需考慮滅菌及分離過程中的雜菌污染問題。
在高密度培養方面，目前所采用的方法，主要是通過優化培養基、培養條件等方法，從而提高培養或發酵過程中活細胞濃度。如劉馨磊等(補料分批法高密度培養凝結芽孢桿菌，生物技術，2001，11〔6〕)報道利用間歇式的補料培養使培養液中菌體達到了4.5×109cfu/ml；呂兵等(乳酸菌發酵劑濃縮培養的研究，中國乳品工業，2001，29〔3〕)報道，通過在培養基中添加緩沖鹽法使培養液中的菌體濃度達到了5.89×109cfu/ml的結果。也有少數人采用管狀有機膜過濾濃縮，如戚薇等(中空纖維膜過濾法高密度培養凝結芽孢桿菌TQ33，食品與發酵工業，2003，29〔3〕)報道，利用中空纖維超濾裝置進行TQ33高密度培養，確定了采用過濾法進行高密度培養的工藝流程和參數。在對數后期，當乳酸質量濃度達到15g/L時，開始過濾培養。過濾培養階段持續6h，培養過程中平均過濾速率和培養基的流入速率為1L/h，平均稀釋率為0.4/h。對通過試驗所確定的工藝進行高密度培養，最終菌體和芽孢濃度分別達到1.6×1010cfu/mL和1.2×1010cfu/mL，是分批培養的21倍和37倍。在以上的這些報導中，采用化學方法來解除代謝產物對微生物的生長抑制是極為有限的，這點在以上的結果中也能清楚地反映出來。而利用外置式中空纖維膜管進行純種高密度培養方法中所采用的有機膜無法進行熱滅菌，因而在實際應用中很難消除雜菌的污染，更難于完成循環式或連續式的高密度培養。
發明內容
本發明的目的是為了解決現有用于細胞高密度培養方法中存在的上述問題，而提供一種適用于細胞高密度培養的方法，即將細胞培養和膜過濾濃縮結合在一起，在截留活細胞的同時去除有害或分離所需的代謝產物，進而達到細胞的高密度培養或利用高密度培養生產所需代謝產物，以及使用補料罐、生物反應器和膜組件實現高密度連續化培養。在實現細胞高密度培養的同時，縮短反應時間、大幅度提高生產效率、降低操作費用。本發明的另一個目的是提供該方法所需的一種膜生物反應裝置。
本發明的技術方案是一種循環式或連續式高密度細胞培養的方法，其步驟包括A、將新鮮培養基通過物料進口(I)加入生物反應器(2)中進行細胞培養，待生物反應器(2)中活細胞數達到105cfu/ml-108cfu/ml時，發酵液經閥門K2、K1和泵4通過無機膜過濾組件(3)過濾濃縮，棄去清液，濃縮菌液通過閥門K5返回到生物反應器(2)中，并通過補料罐(1)重新補加新鮮培養基后再次進行培養。
B、從過濾到補料再到重新培養稱為一個循環，當培養液中菌體濃度達到109cfu/ml-1013cfu/ml，培養液經過閥門K2、K4由出料口(G)直接排出，為循環式高密度細胞培養或當培養液達到109cfu/ml-1013cfu/ml后，進入連續培養，新鮮培養液從補料罐1由蠕動泵進入生物反應器2中，高密度培養液經閥門K3、K4由出料口(G)以排出，整個過程由自動系統控制，為連續式高密度細胞培養。
其中每次循環中過濾要求的發酵液濃縮倍數為1-10倍。循環次數為1-4次。
在連續培養過程中，可通過控制pH、培養液的光密度值或葡萄糖濃度來進行補料，其中pH可控制在1-7的范圍內、光密度可控制在0.1-2.0、以培養基為基準葡萄糖質量百分濃度控制在1％-10％范圍。
本發明還提出了一種循環式或連續式高密度細胞培養的方法的生物反應裝置，其特征在于該裝置由生物反應器(2)、無機膜過濾組件(3)和補料罐(1)通過控制回路將三者連接而成。
其中生物反應器(2)由反應罐、攪拌器(I)、蒸汽滅菌裝置、通氣加壓裝置和探測控制裝置組成；無機膜分離過濾組件(3)由無機膜管、膜管支撐架組成，其中無機膜管為陶瓷膜管、金屬材料膜管或它們的復合材料膜管；補料罐(1)通過管道同生物反應器(2)相連，它的補料方式是通過控制pH、培養液的光密度值或葡萄糖濃度，并通過液位控制來實現培養液的自動排放。
本發明適用于單細胞微生物，如細菌、酵母、植物細胞等。
有益效果1.本發明方法將無機膜分離組件與生物反應器及補料罐連接在一起，通過適當的控制方式，使得生物反應過程與細胞過濾濃縮合為一體，利用該系統，既可實現細胞的培養與菌體產物回收的耦合，也能完成微生物連續式的高密度培養。
2.采用本發明的方法對乳酸菌等進行高密度培養，其菌體的最終濃度可達到1012cfu/ml-1013cfu/ml，而常規方法菌體的最終濃度4.5×109cfu/ml-1.6×1010cfu/mL。
3.與現有的用于細胞高密度培養的生物反應器相比，本發明反應裝置中所采用的無機膜過濾組件具有耐高溫、耐腐蝕，在高溫高壓條件下密封性良好，長時間操作無機膜過濾組件及其連結件不損壞，且易于拆卸和更換，從而使該膜組件的滅菌成為可能。細胞培養與產物分離耦合既可實現細胞的重復利用，也可通過產物分離解除產物合成的代謝抑制及對細胞生長的抑制。同樣在變換控制方式的前提下，也可利用該系統完成高密度條件下的細胞連續培養。
4.與傳統的生物反應器相比，本系統極大地提高了生物反應器單位體積的設備利用率，可縮短生產周期、降低操作費用。
圖1是用于細胞高密度培養膜生物反應器結構示意圖。其中1-補料罐；2-生物反應器；3-無機膜組件；4-泵；5-蠕動泵；6-pH、光密度或葡萄糖控制系統，7-液位控制系統；A蒸汽；B無菌空氣；C冷卻水；D取樣口；E清液出口；F濃液料出口；G料液出口；H冷凝水；I物料進口；J攪拌器；K1、K2、K3、K4、K5、K6、K7、K8為閥門。
下面結合附圖1對該方法及裝置作詳細介紹1.循環式高密度培養，首先在清洗好的生物反應器內加入合適培養基，按常規方法對生物反應器2及與罐體相通的管路進行熱滅菌的，通過夾套冷卻水冷卻后即可接入種子液的在一定溫度下進行培養。培養結束前，在K2K3K4關閉的情況下，打開K1K6K8用蒸汽對無機膜組件及泵4和與之相連接的管道進行滅菌后，關閉K6K7K8并適當冷卻到室溫，當生物反應器內細菌濃度達到105cfu/ml-108cfu/ml時，打開K2K1K5，開啟泵4，經膜管循環過濾，通過清液出口棄去清液，濃縮菌液重新回到生物反應器內，經循環過濾后，使生物反應器內菌體濃度提高1-10倍后，將補料罐內已滅菌冷卻的新鮮培養基(與初始開入生物反應器內的培養基相同)通過蠕動泵5加入到發酵罐內到起始培養時液位，并在相同條件下開始新一輪培養。依據所要求的培養液中菌體濃度達到1011cfu/ml-1013cfu/ml，決定上述從過濾到補料再到重新培養的循環次數，從而實現乳酸菌的高密培養。所要求的培養液中菌體濃度指109cfu/ml-1013cfu/ml。當循環培養結束后，發酵液可通過料液出口直接排出，亦可通過膜組件過濾后由濃縮液出口排出。本實例中，關于補料控制也可通過控制培養液的光密度、葡萄糖濃度得以實現；pH可控制在1-7的范圍內，液位控制則可設定在罐內的任何液位。
2.連續式高密度培養，首先在清洗好的生物反應器內加入合適培養基，按常規方法對生物反應器2及與罐體相通的管路進行熱滅菌的，通過夾套冷卻水冷卻后即可接入種子液一定條件(常規方法)下進行培養。培養結束前，在K2K3K4關閉的情況下，打開K1K6K8用蒸汽對無機膜組件及泵4和與之相連接的管道進行滅菌后，關閉K6K7K8并適當冷卻，當生物反應器內細菌濃度達到105cfu/ml-108cfu/ml時，打開K2K1K5，開啟泵4，經膜管循環過濾，通過清液出口E棄去清液，濃縮菌液通過閥門K5，重新回到生物反應器內，經循環過濾后，使生物反應器內菌體濃度提高1-10倍后，將補料罐內已滅菌冷卻的新鮮培養基(與初始開入生物反應器內的培養基相同)通過蠕動泵5加入到發酵罐內到起始培養時液位，并在相同條件下開始新一輪培養。當完成從過濾到補料再到重新培養的循環1-4次后進入連續培養，即利用生物反應器內的pH控制系統，當pH低于設定值時(設定值范圍為1-7)，與補料罐相連接的蠕動泵自動開啟，新鮮培養基加入到生物反應器內，當pH回升到設定值后，蠕動泵將自動關閉。與此同時，當罐內的培養液超過設定的液位值時，由液位控制計控制的回路開始工作，即K3閥自動開啟，109cfu/ml-1013cfu/ml培養液由料液出口G直接排出，當液位低于設計值時，K3將自動關閉。通過pH及液位控制的聯動，可實現乳酸菌的高密度連續式培養。本實例中，關于補料控制也可通過控制培養液的光密度、葡萄糖濃度得以實現；pH可控制在1-7的范圍內，液位控制則可設定在罐內的任何液位。
具體實施例方式
以下通過具體實施例對本發明的技術方案進行進一步詳細描述。
實施例1乳酸菌循環式的高密度培養首先在清洗好的生物反應器內加入牛肉膏1％，蛋白胨1％，酵母膏1％，葡萄糖15％，吐溫80 0.05％pH6.5培養基，按常規方法對生物反應器2及與罐體相通的管路進行熱滅菌的，通過夾套冷卻水冷卻后即可接入種子液的在30℃下進行培養。培養結束前，在K2K3K4關閉的情況下，打開K1K6K8用蒸汽對無機膜組件及泵4和與之相連接的管道進行滅菌后，關閉K6K7K8并適當冷卻到室溫，當生物反應器內乳酸菌濃度達到105cfu/ml-108cfu/ml時，打開K2K1K5，開啟泵4，經膜管循環過濾，通過清液出口棄去清液，濃縮菌液重新回到生物反應器內，經循環過濾后，使生物反應器內菌體濃度提高5-10倍后，將補料罐內已滅菌冷卻的新鮮培養基(與初始開入生物反應器內的培養基相同)通過蠕動泵5加入到發酵罐內到起始培養時液位，并在相同條件下開始新一輪培養。依據所要求的培養液中菌體濃度1011cfu/ml，決定上述從過濾到補料再到重新培養的循環次數，本實驗使用2-3次，從而實現乳酸菌的高密培養。所要求的培養液中菌體濃度指1011cfu/ml-1013cfu/ml。當循環培養結束后，發酵液可通過料液出口直接排出，亦可通過膜組件過濾后由濃縮液出口排出。
實施例2大腸桿菌連續式的高密度培養首先在清洗好的生物反應器內加入乳糖0.5％，胰蛋白胨2％，磷酸二氫鉀0.275％，磷酸氫二鉀0.275％，NaCl0.5％，十二烷基硫酸鈉0.05％ pH6.6-7.0培養基，按常規方法對生物反應器2及與罐體相通的管路進行熱滅菌的，通過夾套冷卻水冷卻后即可接入種子液一定條件下進行培養。培養結束前，在K2K3K4關閉的情況下，打開K1K6K8用蒸汽對無機膜組件及泵4和與之相連接的管道進行滅菌后，關閉K6K7K8并適當冷卻，當生物反應器內大腸桿菌濃度達到105cfu/ml-108cfu/ml時，打開K2K1K5，開啟泵4，經膜管循環過濾，通過清液出口棄去清液，濃縮菌液重新回到生物反應器內，經循環過濾后，使生物反應器內菌體濃度提高5-10倍后，將補料罐內已滅菌冷卻的新鮮培養基(與初始開入生物反應器內的培養基相同)通過蠕動泵5加入到發酵罐內到起始培養時液位，并在相同條件下開始新一輪培養。當完成從過濾到補料再到重新培養的循環1-4次后進入連續培養，即利用生物反應器內的pH控制系統，當pH下降到5-6，與補料罐相連接的蠕動泵自動開啟，新鮮培養基加入到生物反應器內，當pH回升到設定值后，蠕動泵將自動關閉。以此同時，當罐內的培養液超過設定的液位值時，由液位控制計控制的回路開始工作，即K3閥自動開啟，1011cfu/ml-1013cfu/ml培養液由料液出口G直接排出，當液位低于設計值時，K3將自動關閉。通過pH及液位控制的聯動，可實現大腸桿菌的高密度連續式培養。本實例中，關于補料控制也可通過控制培養液的光密度得以實現；pH可控制在0-7的范圍內，液位控制則可設定在罐內的任何液位。
實施例3酵母菌連續式的高密度培養首先在清洗好的生物反應器內加入麥芽汁(2％-12％)，按常規方法對生物反應器2及與罐體相通的管路進行熱滅菌的，通過夾套冷卻水冷卻后即可接入種子液一定條件下進行培養。培養結束前，在K2K3K4關閉的情況下，打開K1K6K8用蒸汽對無機膜組件及泵4和與之相連接的管道進行滅菌后，關閉K6K7K8并適當冷卻，當生物反應器內酵母菌濃度達到105cfu/ml-108cfu/ml時，打開K2K1K5，開啟泵4，經膜管循環過濾，通過清液出口棄去清液，濃縮菌液重新回到生物反應器內，經循環過濾后，使生物反應器內菌體濃度提高5-10倍后，將補料罐內已滅菌冷卻的新鮮培養基(與初始開入生物反應器內的培養基相同)通過蠕動泵5加入到發酵罐內到起始培養時液位，并在相同條件下開始新一輪培養。當完成從過濾到補料再到重新培養的循環1-4次后進入連續培養，即利用生物反應器內的葡萄糖控制系統，當葡萄糖濃度下降到1-10，與補料罐相連接的蠕動泵自動開啟，新鮮培養基加入到生物反應器內，當葡萄糖回升到設定值后，蠕動泵將自動關閉。以此同時，當罐內的培養液超過設定的液位值時，由液位控制計控制的回路開始工作，即K3閥自動開啟，1011cfu/ml-1013cfu/ml培養液由料液出口G直接排出，當液位低于設計值時，K3將自動關閉。通過葡萄糖及液位控制的聯動，可實現大腸桿菌的高密度連續式培養。本實例中，關于補料控制也可通過控制培養液的光密度得以實現；葡萄糖可控制在1-10的范圍內，液位控制則可設定在罐內的任何液位。
權利要求
1.一種高密度細胞培養方法，其步驟包括A、將新鮮培養基通過物料進口(I)加入生物反應器(2)中進行細胞培養，待生物反應器(2)中活細胞數達到105cfu/ml-108cfu/ml時，發酵液經閥門K2、K1和泵(4)通過無機膜過濾組件(3)過濾濃縮，棄去清液，濃縮菌液通過閥門K5返回到生物反應器(2)中，并通過補料罐(1)重新補加新鮮培養基后再次進行培養；B、從過濾到補料再到重新培養稱為一個循環，當培養液中菌體濃度達到109cfu/ml-1013cfu/ml，培養液經過閥門K2、K4由出料口(G)直接排出，為循環式高密度細胞培養；或當培養液達到109cfu/ml-1013cfu/ml后，進入連續培養，新鮮培養液從補料罐(1)由蠕動泵進入生物反應器(2)中，高密度培養液經閥門K3、K4由出料口(G)以排出，整個過程由自動系統控制，為連續式高密度細胞培養。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于每次循環中過濾要求的發酵液濃縮倍數為1-10倍。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于循環次數為1-4次。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于在連續培養過程中，可通過控制pH、培養液的光密度值或葡萄糖濃度來進行補料，其中pH可控制在1-7的范圍內、光密度可控制在0.1-2.0、以培養基為基準葡萄糖質量百分濃度控制在1％-10％范圍。
5.一種如權利要求1所述方法的高密度細胞培養生物反應裝置，其特征在于該裝置由生物反應器(2)、無機膜過濾組件(3)和補料罐(1)通過控制回路將三者連接而成。
6.根據權利要求5所述的反應器裝置，其特征在于無機膜分離過濾組件(3)由無機膜管和膜管支撐架組成。
7.根據權利要求5所述反應裝置，其特征在于無機膜管為陶瓷膜管、金屬材料膜管或它們的復合材料膜管。
8.根據權利要求5所述的反應裝置，其特征在于補料罐(1)通過管道同生物反應器(2)相連，它的補料方式是通過控制pH、培養液的光密度值或葡萄糖濃度，并通過液位控制來實現培養液的自動排放。
全文摘要
本發明涉及一種細胞培養方法及其生物反應裝置，尤其涉及一種細胞高密度循環式或連續式培養方法及其生物反應裝置。其特征是在生物反應器上加裝無機膜過濾組件及補料罐，并通過一定的控制回路將三者連接為一個可用于細胞循環式高密度培養或高密度連續式培養的生物反應器系統，即將細胞培養和膜過濾濃縮結合在一起，在截留活細胞的同時去除有害或分離所需的代謝產物，進而達到細胞的高密度培養或利用高密度培養生產所需代謝產物。在實現細胞高密度培養的同時，縮短反應時間、大幅度提高生產效率、降低操作費用。
文檔編號C12N5/00GK1778887SQ20051009473
公開日2006年5月31日 申請日期2005年10月9日 優先權日2005年10月9日
發明者熊曉輝, 熊強, 陸利霞, 韓亦龍 申請人:南京工業大學