專利名稱：制備有義rna長鏈的方法
技術領域：
本發明涉及產生長的有義(sense)RNA鏈的方法。
背景技術：
人類基因組完整序列的完成提供了用于生物學研究的大量的DNA序列信息。人類基因組信息最顯著的應用之一是微陣列技術。利用寡核苷酸或互補DNA(cDNA)的高密度陣列，可以從與疾病、癌癥、細胞循環、與環境接觸等有關的細胞活性產生大量的基因表達圖譜。
微陣列可以由cDNA、基因組DNA制得，最近發現可以由寡核苷酸引物制得。見例如Lockhart等，Nature 105827-836(2000)。先前，DNA片段被點在尼龍膜上，與放射性標記的探針雜交以篩選不同表達的基因。近來，采用玻璃片作為DNA點陣的基質，用熒光進行更有效的檢測。研究顯示基于寡核苷酸的微陣列比基于cDNA的微陣列在靶序列設計和檢測方面有更好的特異性。
至少有三種方法被用于制備測量基因表達的標記物質。例如，RNA可直接用光生物素化方法標記。或者，被標記的核苷酸可在逆轉錄反應中摻入cDNA，或者被標記的核苷酸可通過體外轉錄摻入反義RNA中。見例如Van Gelder等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871663-1667(1990)。
在此研究領域的一大困難是在制備用于陣列分析的標記物質時需要大量的RNA。見例如Wang等，Nature Biotech.18457-459(2000)。而大量的RNA不利于樣品的微陣列雜交分析。
現有的由少量起始材料制備RNA表達序列的技術擴增反義RNA，并通過將啟動子引物摻入mRNA的polyA尾部(3’端)或第一鏈cDNA的5’端。此方法限制了可獲得的RNA的質量。從被摻入polyA尾部的轉錄啟動子進行轉錄的一個問題是大量RNA序列不能以全長形式出現，甚至完全沒有出現，原因是5’外顯子序列沒有被轉錄，部分原因是在合成cDNA的第一鏈之前，發生了內含子剪切，并且3’未翻譯區的長度是高度可變的，由幾百個堿基對至幾千個堿基。此外，由于大多數市售的合成寡核苷酸微陣列被設計為含有基因的編碼序列，在這樣的微陣列中從3’端擴增的反義mRNA很可能無法充分地表述表達的序列。最終的結構是在RNA群體中不能表示豐富的mRNA序列。本發明致力于解決這一問題。
發明內容
本發明提供產生長的有義RNA鏈(lsRNA)的方法。本發明的方法包括提供包含5’和3’末端的第一cDNA鏈；將包含啟動子調節元件的啟動子引物摻入第一cDNA鏈的3’端；合成與第一cDNA鏈互補的第二cDNA鏈；由此將啟動子引物摻入雙鏈cDNA；起始cDNA轉錄，由此產生長的有義RNA鏈。
在一個實施方案中，摻入啟動子引物是連接所述啟動子引物。在一個實施方案中，通過逆轉錄摻入啟動子引物。
在一個實施方案中，第一cDNA鏈是從分離自生物樣品的第一有義RNA鏈序列合成的。在進一步的實施方案中，生物樣品包含微克量級以下的總RNA。
在某些實施方案中，啟動子調節元件新來自選自T7、T3和SP6的啟動子。在某些方面，此方法進一步包括從有義RNA鏈合成第一cDNA鏈，并重復上述步驟。
在一個實施方案中，第二cDNA鏈是通過PCR擴增合成的。在另一實施方案中，第二cDNA鏈是通過引物延伸合成的。
在優選的實施方案中，產生的長的有義RNA鏈是全長RNA序列的轉錄物。
具體實施例方式
實施例1RNA分離按照標準的方法(例如用Life技術公司的Trizol試劑)，利用激光俘獲顯微術從細胞培養物或組織樣本分離總RNA。用無RNA酶的DNA酶處理總RNA，以去除DNA污染物。用乙醇沉淀總RNA，將其溶解于無核酸酶的水中。用寡(dT)纖維素層析或用Oligotex mRNA分離試劑盒(Qiagen)從總RNA分離poly(A)RNA。
第一cDNA鏈的合成在小的反應體積(5μl)中進行逆轉錄酶反應。簡要地說，1μl的RNA與4μl的主混合物溶液混合。將混合物短暫地離心，在42℃下溫育60分鐘，在50℃下溫育30分鐘，然后在65℃下溫育10分鐘，使酶滅活。
第一cDNA鏈的純化在逆轉錄酶反應之后，通過RNA酶處理去除RNA。然后將cDNA在92℃下加熱2分鐘，立即在冰上冷卻2分鐘，再短暫離心。向cDNA中加入一種混合物，每一毫升的混合物含有0.1單位的Rnase I，和0.2的單位的Rnase H。在37℃下溫育20分鐘以進行RNA消化。然后加入2.5倍體積的冷乙醇(15μl)，用攪拌器(vortex)混合。在-80℃下或在干冰中保溫5分鐘后，在4℃，16000g下離心15分鐘，使cDNA沉淀。用70％冷乙醇洗滌沉淀物，在空氣中干燥，在蒸餾水中重新溶解。
T7啟動子引物連接如下設計T7啟動子對于用T4 DNA連接酶的雙鏈引物連接，使用以下兩種互補引物退火。所述引物含有T7 RNA聚合酶啟動子序列(下劃線)T7N6 (+)5’-NH2-CGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTA-TAGGCGCNNNNNN-NH2-3’T7-P-N (-)5’-P-GCGCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCACT-GGCCGTGTTT-NH2-3’
引物T7N6在3’端含有簡并序列。在引物合成時T7N6引物的兩個末端都被氨基封閉。引物T7-P-N在5’端含有用于連接的磷酸基團，在3’端被氨基封閉。兩種引物在92℃下退火2分鐘，緩慢冷卻至室溫。用T4 RNA連接酶將T7啟動子序列連接至3’cDNA末端。
實施例2通過引物延伸合成第二鏈用于引物延伸或PCR擴增的引物包括T7PR-25’-AAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGG-3’此引物用于引物延伸或PCR擴增以將單鏈的第一cDNA鏈轉變為雙鏈cDNA。
設計另一引物T7PR-2-Bio來進行引物延伸或PCR擴增，以將單鏈的第一cDNA鏈轉變為雙鏈cDNA。引物T7PR-2-Bio與T7PR-2相同，但含有5’生物素基團，此引物產生帶有5’末端生物素標記的雙鏈cDNA。
通過引物延伸來合成第二cDNA鏈。
實施例3用PCR合成第二鏈用聚合酶鏈式反應合成第二cDNA鏈。為了避免過多擴增造成樣品失真，只進行有限次的PCR循環。PCR擴增后，將十分之一的PCR產物在用溴乙錠染色的1×TAE緩沖液中，在瓊脂糖凝膠上進行分析。剩余的PCT產物用1μl的蛋白酶K在50℃下消化15分鐘，用酚/氯仿抽提。
實施例4本發明的有義mRNA鏈擴增方法與商業上可獲得的反義mRNA擴增方法的比較純化雙鏈cDNA。商業上可獲得的反義mRNA擴增方法可用例如Ambion公司或Arcturus公司的試劑盒進行。第一輪RNA擴增用Arcturus公司的試劑盒，進行大約8小時。對兩種市售試劑盒而言，第一和第二輪擴增至少需要約2-3天。而本發明的方法僅需要大約8小時。在產生的mRNA的凝膠比較中，Ambion法或Arcturus法在第一輪的擴增后產生的最長反義mRNA鏈是大約1.5kb，在第二輪的擴增后產生的最長反義mRNA鏈是大約0.6kb。而本發明的方法在第二輪的擴增后產生的最長有義mRNA鏈是大約2.2kb。因此，本發明的方法比其他方法產生了長得多的mRNA序列。
權利要求
1.一種產生長的有義RNA鏈的方法，該方法包括提供包含5’和3’端的第一cDNA鏈；將包含啟動子調節元件的啟動子引物摻入第一cDNA鏈的3’端；起始從cDNA的轉錄，由此產生長的有義鏈。
2.權利要求1的方法，其中啟動子引物是雙鏈的。
3.權利要求2的方法，其中摻入啟動子引物是通過T4DNA連接酶將所述啟動子引物與第一cDNA鏈連接。
4.權利要求2的方法，其進一步包括在起始從cDNA的轉錄之前，合成與第一cDNA鏈互補的第二cDNA鏈。
5.權利要求1的方法，其中啟動子引物是單鏈的，所述方法進一步包括在起始cDNA轉錄之前，合成與第一cDNA鏈互補的第二cDNA鏈，由此將啟動子引物摻入雙鏈cDNA。
6.權利要求1的方法，該方法進一步包括雙鏈cDNA的PCR擴增。
7.權利要求1的方法，其中啟動子調節元件是選自T7、T3和SP6的啟動子。
8.權利要求1的方法，其中引物是生物素標記的。
9.權利要求5的方法，其中雙鏈cDNA是用磁珠純化的。
全文摘要
本發明提供一種合成并擴增有義RNA鏈的方法。本發明的方法包括合成探針，所述特征可用于探測寡核苷酸和cDNA微陣列，以及減法和標準化文庫。
文檔編號C12N15/10GK1896234SQ20051008304
公開日2007年1月17日 申請日期2005年7月13日 優先權日2005年7月13日
發明者許軍普, 秦曉華, 趙峰 申請人:北京雅康博生物科技有限公司