一種擴增NSCs并抑制其向神經膠質細胞分化的方法及其用途的制作方法

專利名稱：一種擴增NSCs并抑制其向神經膠質細胞分化的方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及一種擴增神經干細胞(neuralstem cells，NSCs)并抑制其向神經膠質細胞分化的方法及其用途。
背景技術：
神經系統的疾病如帕金森氏病、癲癇、阿爾茲海默病、漢庭頓舞蹈病、LouGehrig氏病、脊索損傷、多發性側索硬化、代謝混亂及視網膜主神經病(majorretinal diseases)等，包括神經軸突的損傷和神經細胞的損傷缺失，都是由于神經元的持續損失又無從替代導致的。對于神經系統的疾病，由于血腦屏障的存在，常規的治療手段常難奏效。同時，由于神經系統的遺傳、代謝及感染性疾病，常是廣泛性甚至全腦性的病變，一般意義上的腦細胞或組織移植不能解決根本問題。補充神經干細胞就成為最有可能治愈這些疾病的手段之一。
神經干細胞是指神經系統中處于較早發育階段的細胞群體，它們可以通過自身的對稱性或不對稱性分裂方式進行自我復制，產生神經組織中不同發育階段不同分化方向的細胞，最終生成具有一定細胞數目和多種細胞類型的神經組織。神經干細胞的生物學特點包括多向分化潛能(向多種細胞表型分化的能力)、分裂增殖、長期自我更新維持自身數量穩定(保持未分化的特性)及對疾病、損傷的反應能力，其中最基本的屬性為自我更新和多向分化潛能。神經巢蛋白-nestin在神經胚形成時即起始表達，但隨著神經細胞分化的完成而停止表達，因此被廣泛用做神經干細胞的標志。神經干細胞將是細胞替代療法促進神經組織再生的重要種子細胞。隨著干細胞技術的不斷突破，人類有可能自主地在體內外培養、擴增NSCs，定向誘導其分化為所需要的各種神經細胞，或作為種子細胞用于組織工程以供臨床所需，或使神經系統中的NSCs直接增殖、遷移和分化代償受損組織，以此為目的的干細胞工程將成為神經系統損傷治療的一種重要手段。
由于移植的NSCs可在不同的時間及空間環境下遷移并在不同的部位產生相應的神經元和膠質，與宿主細胞整合，表現與宿主細胞一致的功能特性，參與發育并替代死亡的神經細胞，而且自身NSCs大量增殖后的移植可解決棘手的免疫排斥反應，故NSCs移植對治療腦損傷與神經退行性病變有重要意義。在病灶部位誘導NSCs遷移并大量增殖和分化，對損傷程度較輕的神經系統病變的治療則更為便利。此外，NSCs還可作為基因轉染的載體，將外源目的基因轉導入神經組織并使其有效表達，一方面可用于研究腦的發育機制，神經系統疾病發生、發展的影響因素，另一方面可進行基因治療，干擾神經退變，刺激修復以及對顱內腫瘤進行治療。
體外培養擴增NSCs，常規使用無血清培養體系，而獲得所需的特定神經細胞則通過添加血清和細胞因子誘導實現。目前NSCs移植治療的動物實驗暴露出該療法的一個主要障礙，即大部分NSCs在誘導分化過程中大部分分化為神經膠質細胞，只有少量NSCs分化成能傳遞神經生物電的神經元細胞。因此誘導NSCs向神經元細胞分化，是干細胞替代療法需要解決的關鍵問題。影響NSCs分化的細胞因子主要有成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)。它們一方面可以保持NSCs的未分化狀態，另一方面在一定程度上影響NSCs的分化。bFGF主要起有絲分裂原的作用，誘導增殖時抑制NSCs的分化，改變其濃度也可促進細胞分化并決定分化方向。EGF可調節神經前體細胞分裂增殖，特別是刺激膠質前體細胞的增殖。bFGF和EGF的聯合應用已成為NSCs培養擴增的常規方法。近年來的研究發現，添加其他細胞因子對NSCs的增殖和分化也能產生明顯的影響。在人的NSCs培養基中除bFGF、EGF外再添加LIF就能明顯地促進干細胞的增殖。
豆類凝集素FRIL(Flt3 receptor interact lectin)在1997年被發現，我們也于中國的眉豆種子中高效提取純化到了這種特殊的凝集素。FRIL主要是通過作用于它的受體Flt3，隨后影響一系列的信號通路而發揮作用，體外實驗證實，FRIL能在不更換培養基的情況下維持造血干祖細胞的活存和多潛能性達一個月，是一種新型的、有效的細胞因子。Flt3受體不僅在造血干祖細胞表面表達，在NSCs的表面也有表達。在我們的研究中已證實，FRIL對NSCs有很高的親和性，它也是NSCs增殖分化的調控因子之一。將FRIL與常規的NSCs培養擴增體系相結合，我們獲得了一種新的、更為有效的神經干細胞擴增和向有功能的神經元優勢分化的培養體系。
在胚胎發育過程中，很多部位，包括大腦皮層、紋狀體、小腦等均存在一定數量的神經干細胞，這已由體外細胞培養所證實。目前的研究已分別從胎鼠的端腦半球、中腦、海馬、皮層、紋狀體、坐骨神經和腦室區分離培養出NSCs。Vescovi等(Trends Neurosci.1996，19(9)387-393.Review；Exp Neurol.1999，156(1)71-83.)也從胚胎期人腦皮層和紋狀體中分離并克隆出NSCs，證實了它能自我更新，持續自發分化為神經元、星形和少突膠質細胞，這些長時間培養的NSCs通過移植可在大鼠損傷的紋狀體中有效地生存。
目前，國內外對于神經干細胞的研究僅證實了它的存在，實現了它的體外擴增和一定程度的定向誘導分化，但將其真正應用于臨床尚有待時日，特別還需要克服其數量不足和向有功能的神經元細胞方向分化不足的問題。

發明內容
本發明所要解決的關鍵技術問題是建立一種擴增神經干細胞并抑制其向神經膠質細胞分化的方法。
為解決上述技術問題，本發明利用NSCs具有自我增殖多向分化的潛能，采用新型培養體系擴增NSCs，為神經細胞移植及微囊化神經細胞制劑等的制備提供種子細胞，同時抑制NSCs向神經膠質細胞分化，為NSCs定向誘導分化為有功能的神經元細胞奠定了基礎。
本發明中運用的新型培養體系，是聯合應用細胞因子bFGF、EGF及豆類凝集素FRIL的培養體系，支持神經干細胞的增殖、維持神經干細胞的狀態并抑制其向神經膠質細胞分化。
本發明中運用的體外增殖、誘導方法，是利用添加細胞因子bFGF、EGF及豆類凝集素FRIL的無血清培養體系，以B27作為血清替代品，體外支持神經干細胞的增殖、維持神經干細胞的狀態并抑制其向神經膠質細胞分化。
本發明中運用的凝集素FRIL是由中國眉豆中提取純化的糖蛋白。
本發明中的神經干細胞包括人或哺乳動物胚胎的端腦半球、中腦、海馬、大腦皮層、紋狀體、坐骨神經和腦室區以及成體的紋狀體、海馬、皮層和腦室室管膜或室管膜下層等來源的nestin+神經干細胞。
本發明利用添加細胞因子bFGF、EGF及豆類凝集素FRIL的無血清培養體系，可支持人和哺乳動物胚胎端腦半球、中腦來源的nestin+神經干細胞的增殖并向有功能的神經元細胞優勢分化。
本發明利用神經干細胞擴增、維持其狀態和抑制其向神經膠質細胞分化前后細胞表面表達蛋白的差異進行比較鑒定。
本發明中體外擴增并抑制分化的神經干細胞可作為種子細胞用于神經細胞移植及微囊化神經細胞制劑等的制備，還可作為體外的藥代動力學模型用于細胞藥物篩選或作為基因治療的有效載體細胞。
本發明中的細胞因子組合不僅可以促進神經干細胞的增殖、抑制其向膠質細胞分化，而且為神經干細胞定向誘導分化為有功能的神經元細胞奠定了基礎。
具體實施方案如下
1.神經干細胞的分離。取哺乳動物或人胚胎的端腦和中腦組織，剝離腦膜后剪碎，2～10ml胰酶消化組織塊，通過篩網收集單細胞懸液，培養于含bFGF和EGF的常規培養基中，傳代純化神經干細胞。
2.凝集素FRIL的提取。將中國眉豆Dolichos lablab的干種子在緩沖液中勻漿，分別以酸、堿溶液抽提雜蛋白，再利用凝集素對特定糖基高親和力的特性加以親和層析純化。
3.采用細胞因子EGF 10～20ng/ml終濃度、bFGF10～20ng/ml終濃度、FRIL 40～1000ng/ml終濃度的不同組合分別培養擴增神經干細胞，細胞以相同密度接種于培養基中，定時換液及傳代。
4.倒置顯微鏡下對體外培養的神經干細胞從形態學上進行比較鑒定。
5.培養的神經干細胞用胰酶消化成單細胞懸液，臺盼藍染色后計數臺盼藍拒染細胞數，計算細胞的增殖效率。
6.培養的神經干細胞分別用nestin、GFAP、NSE抗體檢測表達相應蛋白的細胞，檢測相應的神經干細胞、膠質細胞和神經元細胞的形態和比例。
本發明的有益效果是1.按照本發明提供的技術方法，可以將人或哺乳動物胚胎、成體不同來源的神經干細胞進行大量擴增并有助于向成熟的、有功能的神經元細胞優勢誘導；2.按照本發明技術方法得到的體外擴增并抑制分化的神經干細胞，可作為種子細胞應用于神經細胞移植及微囊化神經細胞制劑的制備；3.按照本發明技術方法得到的體外擴增并抑制分化的神經干細胞誘導分化后，可作為體外的藥代動力學模型用于細胞藥物的篩選或作為基因治療的有效載體細胞；4.按照本發明提供的技術方法，可在發生缺損的神經組織誘導神經干細胞的遷移、擴增并向有功能的神經元細胞優勢分化，代償損失的神經細胞。
5.本發明所建立的方法將在以基因工程、細胞工程乃至組織工程等為基礎的再生醫學中具有極佳的應用前景，并將產生巨大的社會效益和經濟效益。


圖1分離培養的大鼠神經干細胞A光鏡下觀察大鼠神經干細胞球；Bnestin抗體染色陽性神經干細胞圖2 15％SDS-PAGE檢測親和層析純化的凝集素FRIL。
MProtein molecular weight marker；F純化后的多亞基FRIL蛋白。
①97.4Kd；②66.2kD；③43kD；④31kD；⑤20.1kD；⑥14.4kD。
1-4FRIL α亞基；5FRIL β亞基。
圖3 HRP-FRIL檢測神經干細胞、造血干細胞、骨髓基質細胞與FRIL的親和性。
3a大鼠神經干細胞球呈FRIL反應強陽性；3b人CD34+造血干細胞部分呈FRIL反應陽性；3c人骨髓基質細胞HFCL呈FRIL反應陰性。
圖4不同培養因子分組計數結果圖5不同培養因子分組形態學觀察結果圖6神經元分化情況檢測綠色nestin，神經干細胞表面標志藍色DAPI，細胞核染色紅色NSE(神經烯醇化酶)，神經元表面標志圖7神經元分化比例圖8神經膠質細胞分化情況檢測綠色nestin，神經干細胞表面標志藍色DAPI，細胞核染色紅色GFAP(膠質纖維酸性蛋白)，神經膠質細胞表面標志圖9神經膠質細胞分化比例具體實施方式
實施例1、大鼠神經干細胞的分離、培養取懷孕的Wistar大鼠，待仔鼠達到孕14±1d，用戊巴比妥肌注麻醉孕鼠，無菌條件下剖腹并剪開子宮，取出胎鼠，剝離胞膜，用D-Hanks液輕輕沖洗；乳鼠全身消毒后分層剪開頭皮和顱骨，暴露兩側大腦半球，取出端腦和中腦，用D-Hanks液清洗腦組織塊并去除血管等結締組織后剪碎成糊狀，離心吸棄上清，轉入8ml 0.125％胰酶中，細口吸管輕輕吹打幾次后置37℃消化30min，每5min振蕩1次。加入100μl血清、10μl DNase I混勻，將細胞懸液過200目細胞篩，200g離心10min，棄上清液，沉淀用1ml無血清培養液重懸，培養。神經干細胞形態如圖1。
實施例2、人腦神經干細胞的分離、培養取3～4月齡胚胎，并取出端腦和中腦，小心剝離腦膜，用D-Hanks清洗腦組織塊并去除血管等結締組織后剪碎成糊狀，離心吸棄上清，轉入8ml 0.125％胰酶中，細口吸管輕輕吹打幾次后置37℃消化30min，每5min振蕩1次。加入100μl血清、10μl DNase I混勻，將細胞懸液過200目細胞篩，200g離心10min，棄上清液，沉淀用1ml無血清培養液重懸，培養。
實施例3、凝集素FRIL的親和層析純化將眉豆研磨成粉，以5倍體積Tris緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，1mmol/LMgCl2，1mmol/L CaCl2，pH8.0)勻漿，4℃平衡4小時以上；4℃20000g離心20min，取上清；以冰醋酸調pH至4.0，4℃20000g高速離心20min，取上清；40％NaOH調pH至8.0，4℃ 20000g高速離心20min，取上清得到凝集素粗提液。粗提液與Tris緩沖液平衡后的親和層析介質(mannose-Sepharose matrix，Pharmacia公司)結合，4℃反應4小時以上，接著用Tris緩沖液洗滌至沒有蛋白流出，再以200mmol/Lα-甲基α-D-甘露糖苷洗脫得到凝集素FRIL純溶液。15％SDS-PAGE結果如圖2所示，從圖中可以看出在10kD～25kD范圍內有5條明顯的條帶，是所分離的植物凝集素的5個亞基。凝集素FRIL的提取方法在我們已申請的國家發明專利200410074027.1中已有詳細描述。
實施例4、FRIL對神經干細胞的親和能力檢測將純化獲得的FRIL以常規方法用辣根過氧化物酶HRP標記，作為組織化學檢測的探針。對黏附于玻片上的神經球用HRP-FRIL孵育反應室溫2h，再加入DAB底物顯色。分別設造血干細胞和人骨髓基質細胞HFCL為陽性、陰性對照。結果如圖3所示。圖3顯示出，FRIL對神經干細胞有很強的結合能力，能特異性針對神經干細胞發揮作用。
實施例5、大鼠神經干細胞的體外分組培養以不同的細胞因子組合分別擴增培養神經干細胞，培養分組包括含2％B27的無血清DMEM/F12(1∶1)基本培養基，A組基本培養基添加20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF，B組基本培養基添加20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF和300ng/mlFRIL。細胞以2×105/ml接種于各組培養基中，每隔3d半量換液，5～7d以1∶2的比例傳代。
實施例6、培養神經干細胞的增殖計數以不同的細胞因子組合分別擴增培養神經干細胞，各組細胞每次傳代前以胰酶消化成單細胞懸液，重懸在生理鹽水中，按9∶1的比例加入0.4％的臺盼藍染液，5min內計數拒染的活細胞數。多次傳代后，繪制細胞的增殖曲線，如圖4所示，基本培養基添加20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF和300ng/ml FRIL的培養體系可令神經干細胞獲得最大的增殖率，平均每代增殖3.1倍。
實施例7、培養神經干細胞的形態觀察倒置顯微鏡下觀察各組培養的神經干細胞，7d后基本培養基添加20ng/mlbFGF和20ng/ml EGF的神經球內含50～200個細胞，球邊緣出現放射形生長的長梭狀貼壁細胞，基本培養基添加20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF和300ng/ml FRIL出現大量貼壁生長的神經球，每球含細胞少，細胞的突觸明顯。如圖5。
實施例8、各組培養細胞的免疫熒光檢測將各組培養達1周、2周、3周后的神經細胞吹打成均勻懸液，加到包被了多聚賴氨酸的玻片上，過夜細胞黏附后取出玻片，用PBS沖洗后，4％多聚甲醛固定20min、0.3％Triton X-100透膜20min、10％山羊血清封閉30min，再分別加入抗大鼠nestin、GFAP、NSE的一抗37℃反應2h，熒光二抗37℃反應30min，在熒光顯微鏡下觀察各類神經細胞的形態并計數，計算出各類細胞所占的比例。其中nestin陽性的是神經干細胞，GFAP陽性代表膠質細胞，NSE則是神經元細胞的特異標志。基本培養基添加20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF和300ng/ml FRIL的培養體系與常規培養使用的基本培養基添加20ng/ml bFGF和20ng/ml EGF培養體系的結果比較，神經元細胞的比例基本不變，神經膠質細胞的比例下降，神經干細胞的比例無顯著性差異，如圖6、7、8、9。可見新的培養體系維持了較多的神經干細胞和神經元細胞。
權利要求
1.一種培養擴增神經干細胞并抑制其向神經膠質細胞分化的方法，其特征在于利用神經干細胞具有自我增殖和多向分化的潛能，通過誘導體系擴增神經干細胞的數量并抑制其向神經膠質細胞分化，其用途在于擴增并抑制分化的神經干細胞可為神經細胞移植、微囊化神經細胞制劑等的制備提供種子細胞，或者運用本方法在體內輔助發生神經退行性病變的組織補充神經元細胞，擴增并抑制分化的細胞還可作為體外藥物代謝動力學模型用于細胞藥物的篩選。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于利用組合的細胞因子支持神經干細胞擴增的同時可抑制神經干細胞向神經膠質細胞分化。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于用于擴增并抑制神經干細胞分化的培養基可以含有豆類凝集素FRIL、堿性成纖維細胞生長因子、表皮生長因子及其組合物。
4.根據權利要求1或2、3所述的方法，其特征在于所述神經干細胞具有自我增殖和多向分化潛能，包括人或哺乳動物胚胎、神經系統以及其它組織來源的神經干細胞。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于利用無血清培養基添加包括但不限于堿性成纖維生長因子、表皮生長因子、豆類凝集素FRIL及其組合的培養系統，體外支持神經干細胞在增殖同時向成熟的神經元細胞優勢分化。
6.根據權利要求1或2、3所述的方法，其特征在于利用神經干細胞在不同的培養體系中擴增、狀態的維持以及分化前后細胞表面蛋白表達的差異進行比較鑒定。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于擴增和抑制分化后的神經干細胞可作為種子細胞用于神經細胞移植、微囊化神經細胞制劑等的制備。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于神經干細胞向神經膠質細胞分化的抑制有利于神經干細胞的體外大量擴增以及后期向神經元的定向誘導分化。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征還在于擴增和誘導分化后的神經細胞還可作為體外藥物代謝動力學模型用于細胞藥物的篩選或作為基因治療的有效載體細胞。
全文摘要
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是涉及一種誘導神經干細胞擴增并抑制其向神經膠質細胞分化的方法及其用途。本發明利用含有一種新型豆類凝集素的無血清培養體系，誘導神經干細胞擴增并抑制其向神經膠質細胞分化。該擴增和抑制分化體系的建立不僅為“神經細胞可再生”的理論提供佐證，而且可為神經細胞移植、微囊化神經細胞制劑等的制備提供種子細胞，同時該細胞因子組合能直接用于體內，對神經退行性病變的組織進行細胞代償補充，誘導分化的神經細胞還可作為體外的藥代動力學模型用于細胞藥物篩選。此方法的建立將在以基因工程、細胞工程乃至組織工程等為基礎的再生醫學中具有極佳的應用前景，并將產生巨大的社會效益和經濟效益。
文檔編號C12N5/06GK1891817SQ20051008049
公開日2007年1月10日 申請日期2005年7月6日 優先權日2005年7月6日
發明者裴雪濤, 謝小燕, 李艷華, 陳琳, 師偉, 姚海雷 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所