硬粒小麥高分子量谷蛋白By8基因及其應用的制作方法

專利名稱：硬粒小麥高分子量谷蛋白By8基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域，特別涉及一種硬粒小麥高分子量谷蛋白By8基因序列、功能鑒定以及基于此基因通過生物技術方法改良小麥品質的應用。
背景技術：
小麥是世界上栽培面積最大、產量最高、地理分布最廣的重要農作物，其種植面積和產量約占谷物種植面積的30％，被廣泛應用于食品加工與家畜飼養上。小麥種子中含有其他糧食作物中所欠缺的面筋蛋白，可制作面包、面條、餅干、糕點和饅頭等多種專用食品。因此，種子蛋白的組成和含量在很大程度上決定小麥加工品質的優劣。
根據溶解特點的不同將小麥種子蛋白分為以下四類清蛋白和球蛋白、麥醇溶蛋白、麥谷蛋白。研究表明，小麥谷蛋白多聚體是自然界最大的蛋白分子。通常所說的小麥貯藏蛋白是指醇溶蛋白和麥谷蛋白，其中麥谷蛋白約占貯藏蛋白的40％左右。根據還原條件下在SDS-PAGE中的遷移率不同，又可將麥谷蛋白分為兩類高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GS)。HMW-GS只占小麥貯藏蛋白的10％，因其在組成高分子聚合體(提供面粉彈性)中起到很重要的作用，所以它的組成和功能可直接影響小麥面粉的烘烤質量。目前已清楚HMW-GS的編碼基因位于第一部分同源群染色體長臂靠近著絲點的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1三個位點上，每個位點有兩個緊密連鎖基因，分別編碼一個分子量大的x-型亞基和分子量較小的y-型亞基，但由于存在基因沉默，有的位點y-型亞基或x-型亞基基因不表達，所以一個品種一般只有3-5個亞基，其中0-1種由Glu-A1編碼(A1位點的Y型亞基基因總是處于“沉默”狀態)、1-2種分別由Glu-B1和Glu-D1編碼。
HMW-GS組成與烘烤品質的關系已較清楚。依據亞基間沉淀值差異對亞基烘烤品質進行了評分，對于緊密連鎖的位點，則以亞基對為參評單位。評分等級最高的是1Dx5+1Dy10亞基對，其后為1Ax1、1Ax2*、1By17+1By18、1By7+1By8，而亞基1Dy2+1Dy12的品質較差，1By6+1By8的評分等級最低，并推測在B組亞基中1By7好于1By6，1By8好于1By9。一些研究還發現1Bx13+1By16、1Bx4+1By12、1Bx14+1By15對品質也具有重要作用。
通過轉基因技術改良小麥品質已被證明是一條有效途徑。因此，優質蛋白基因的分離克隆成為當前國內外的研究熱點。由于小麥高分子量谷蛋白亞基對品質具有重要作用，國內外都試圖克隆優質HMW-GS基因，然后通過基因工程手段定向改良小麥品質。迄今為止，在普通小麥中已克隆了1Dx5、1Dy10、1Ax1、1Ax2*、1By17、1By7等多個對品質有重要作用的HMW-GS基因，并在轉基因優質小麥品種的培育方面取得重要進展。
硬粒小麥(Triticum durum，2n＝4x＝28，AABB)是四倍體種，在歐美等國家有廣泛栽培。例如在意大利，硬粒小麥是制作優質面條、餅干、糕點等食品的重要原料。Simeto是意大利優質硬粒小麥品種，品質評分達到75。該品種HMW-GS組成為1Bx7+1By8，而By8亞基基因一直未能克隆。

發明內容
本發明的目的在于從硬粒小麥中克隆得到一個編碼高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)By8的基因，通過常用基因工程技術，可培育優質轉基因小麥，從而改善小麥品質。
本發明采用的技術方案是一種硬粒小麥高分子量谷蛋白的By8基因，其特征在該基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到2163位所示的核苷酸序列。
上述的硬粒小麥高分子量谷蛋白By8基因具有的核苷酸序列還可以是序列表中SEQ ID NO.1第1位到2163位中因一個或多個核苷酸的缺失、插入或替換而形成的具有功能活性的等位基因。
目前分離谷蛋白基因主要采用建庫篩選和PCR方法，本發明通過等位基因特異PCR技術，結合單、雙向凝膠電泳、毛細管電泳和質譜方法，在硬粒小麥中鑒定、分離了一個新的HMW-GS By8亞基及其基因By8，該基因可顯著增加面筋強度，可以在小麥品質改良中發揮重要作用。
基因結構特征硬粒小麥高分子量谷蛋白亞基的單、雙向凝膠電泳、毛細管電泳和質譜鑒定圖譜如圖1、圖2所示，硬粒小麥simeto只有一個y-型亞基即HMW-GS8，x-型亞基為HMW-GS7。為了克隆編碼HMW-GS8的基因即基因1By8，根據蛋白質N-端保守序列和已發表的基因序列設計不同的AS-PCR引物，其中引物P1+P2+P3用于擴增1By8基因的編碼區，引物P4+P5用于擴增1By8基因上游啟動子序列，分別獲得了2166bp和854bp單一擴增產物，它們正好相對于y-型HMW谷蛋白1By8基因的編碼區和上游啟動子大小，而且從葉片和種子DNA獲得的結果一致，說明所設計的引物特異性高。
兩單一片段經克隆測序與連接后獲得了By8基因共3020bp如序列表SEQID NO.1所示的編碼全序列。該基因包括一個無內含子的2166bp可讀框(編碼720個氨基酸殘基)和854bp的上游序列。By8基因上游區包括一些典型的真核基因序列，如一個TATA框，存在于啟始密碼ATG上游-82到-88bp的位置。另外，還有三個與其它植物基因相似的類CCAAT序列分別位于-112、-188、-226的位置。在啟始密碼ATG上游-206到-243bp，有一個增強子序列GTTTTGCAAAGCTCCAATTGCTCCTTGCTTATCCAGCT，該序列由Thomas和Flavell在1990年鑒定，是基因表達的主要調節因子。從-421to-444bp還存在一個24bp序列，叫做-300元件，且在-549、-571、-594處有三個“-300元件”序列部分區段的重復片段，它在其它貯藏蛋白基因中是保守的。
由DNA序列推導出的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，該氨基酸序列顯示，By8亞基與其它y-型HMW谷蛋白亞基相似，前面是21個信號肽殘基，然后與其它HMW谷蛋白亞基一樣，有三個明顯的結構區域104個殘基的非重復N-端區，553個殘基的中央重復區和42個殘基的非重復C-端區。1By8亞基有7個半胱氨酸殘基N-端5個、C-端1個、重復區末端靠近C-端1個。重復區由六肽(PGQGQQ)和九肽(GYYPTSLQQ)組成的典型y-型HMW谷蛋白結構(無三肽重復)。
By8亞基基因與已克隆的By9亞基基因同源性較高，而與劣質亞基1Dy12基因存在很大差異。與By9亞基相比，只有兩個氨基酸殘基的替換(分別在78處的異亮氨酸/脯氨酸替換和442處的精氨酸/谷氨酸替換)和342處15個氨基酸殘基(QYPASQQQPAQGQQG)的插入。By8基因的這一結構特征很可能對小麥面筋品質具有重要作用。
HMW-GS對面包烘烤品質所起的重要作用已被眾多的研究者所證實(Wrigley，1996)。具有1Dx5+1Dy10亞基(由1D染色體上Glu-D1位點上的基因編碼)的品種面包烘烤品質明顯優于其它亞基組合。研究發現以1或2*亞基代替N，以7+8亞基代替7+9亞基，以5+10亞基代替2+12亞基將顯著改善小麥的烘烤品質。一般認為具有1Dx5+1Dy10亞基組合(品質評分為4)的品種具較好的烘烤品質，其次是1Ax1、1Ax2*、1Bx7+1By8、1Bx17+1By18(品質評分均為3)，而具有亞基組合2+12的品種烘烤品質較差。因此，改善麥谷蛋白的高分子量亞基構成，將是改良我國小麥品種烘烤品質的重要途徑。研究顯示，通過優質谷蛋白基因(包括從硬粒小麥獲得的優質谷蛋白基因)的轉化，培育轉基因小麥可顯著改善面粉品質。


圖1 硬粒小麥Simeto高分子量谷蛋白亞基的單、雙向凝膠電泳鑒定a-SDS-PAGEb-A-PAGEc-A-PAGE x SDS-PAGE圖2 硬粒小麥Simeto高分子量谷蛋白亞基的毛細管電泳和質譜鑒定a-高分子量谷蛋白亞基的毛細管電泳HPCEb-高分子量谷蛋白亞基的質譜鑒定MALDI-TOF-MS圖3 Simeto HMW-GS By8基因上游和編碼區的PCR擴增a.1-1kb DNA ladder Marker2-By8基因上游b.1-1kb DNA ladder Marker2-陰性對照3-By8基因編碼區圖4 By8基因在大腸桿菌E.coli中的表達1-蛋白質分子量標記2-Simeto種子中的By8亞基3-未轉化的BLR-21(DE3)pLysS4-By8重組質粒轉化沒有IPTG誘導的對照細菌培養5-IPTG誘導的By8重組質粒溶菌液圖5 Simeto By8亞基配粉品質檢測和面圖a-10g面粉+6ml水b-10g面粉+6ml水+0.1％乙酸c-10g面粉+6ml水+0.1％乙酸+DTT+碘酸鉀+0.1％SDSd-10g面粉+6ml水+0.1％乙酸+DTT+碘酸鉀+0.1％SDS+10mg By8蛋白
具體實施例方式
實施例1硬粒小麥simeto高分子量谷蛋白HMW-GS8亞基的鑒定(1)植物材料意大利優質硬粒小麥品種simeto。
(2)HMW-GS提取①SDS-PAGE電泳樣品制備半粒種子扎碎后將面粉放入1ml離心管，然后加入0.3ml 55％異丙醇，渦旋1分鐘，65℃水浴振蕩30分鐘，10000rpm離心10分鐘，棄上清。上述處理面粉的操作重復3次，用濾紙吸去殘余上清，將醇溶蛋白去除干凈；加0.1ml 55％異丙醇，0.08M Tris-HCL，pH8.0，含1％二硫蘇糖醇(DTT，新鮮加入)，充分混合，65℃水浴充分振蕩30分鐘；加0.1ml55％異丙醇，0.08M Tris-HCL，pH8.0，含1.4％新鮮混合的4-乙烯基吡啶，混合并在65℃水浴中振蕩30分鐘，12000rpm離心10分鐘；將0.06ml上清轉入新管，加0.06ml樣品緩沖液(2％SDS，0.02％溴酚藍，0.08M Tris-HCl，pH8.0，40％甘油)，65℃水浴中振蕩30分鐘，12000rpm離心10分鐘，作SDS-PAGE上樣用。
②A-PAGE電泳樣品制備余下上清液轉入新管，加0.3ml冷丙酮將谷蛋白沉淀15分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄上清。室溫干燥谷蛋白后用50μl樣品緩沖液(6M尿素，30％甘油和25mM乙酸)，充分混合，12000rpm離心10分鐘，取8-10μl作A-PAGE上樣用。
③毛細管電泳樣品制備如上所述，去掉醇溶蛋白往離心管沉淀中加入50％正丙醇含新鮮加入的1％DTT 800μl，45℃震蕩提取30分鐘，12000rpm離心10分鐘，取上清液600ul轉入干凈1.5ml離心管中，加入預冷分析純丙酮至終濃度40％，室溫靜置沉淀30分鐘，12000rpm離心15分鐘，所得沉淀即為HMW-GS。室溫干燥后加入300μl 20％乙氰和0.1％三氟乙酸(TFA)，充分溶解、離心后即可進行CE分析。
④質譜分析樣品制備一粒種子砸成粉末狀放入1 ml離心管，加入0.5ml70％乙醇，渦旋1/2個到1個小時，13000g離心5min，去上清。加入0.5ml 55％異丙醇，混勻，65℃水浴30min，13000g離心5min，去上清并用濾紙吸干凈，此步驟重復3次。加入0.5ml 50ml異丙醇+8ml 1M Tris-HCl(pH8.0)+42ml ddH2O溶液(新鮮加入β-巰基乙醇達5％)，混勻，65℃水浴30min。取上清加入-20℃預冷的丙酮(丙酮濃度達40％)，沉淀1-2小時，13000g離心5min，去上清，室溫干燥。加入10μl 0.5％TFA+50％乙腈溶液溶解。
(3)用下列5種方法分別對HMW谷蛋白亞基進行鑒定①SDS-PAGE電泳利用Boi-Rad Mini-PROTEAN 3電泳槽、4％濃縮膠、12％分離膠，磷酸-甘氨酸緩沖液系統，10mA電泳2小時，0.1％考馬斯亮藍R-250染色，25％甲醇和乙酸7％脫色，電泳圖譜如圖1中的a圖所示。
②A-PAGE電泳電泳槽同上，利用5％濃縮膠和10％分離膠，0.375％雙丙烯酰胺，2M尿素，0.1％抗壞血酸，0.0007％硫酸亞鐵，冰醋酸-甘氨酸緩沖液系統pH3.1，恒壓500V，電泳1～2小時。1％考馬斯亮藍R-250染色，電泳圖譜如圖1中的b圖所示。
③雙向A-PAGE×SDS-PAGE電泳A-PAGE后，染色1小時，按泳道將膠條切下，做方向標記，在20-50ml孵育液(2％SDS，40％甘油，62.5mMTris-HCl，pH6.8)中孵育30分鐘，然后放在SDS-PAGE膠上(方法同①，在分離膠上端留1cm空)，先15毫安電泳，待樣品進入分離膠后加大至30毫安(電壓80-100伏)，電泳2.5小時。1％考馬斯亮藍R-250染色24小時，電泳圖譜如圖1中的c圖所示。
④高效毛細管電泳(HPCE)采用Bio-Rad公司生產的BioFocus 3000型高效毛細管電泳儀系統。彈性石英毛細管柱由河北省永年光導纖維廠生產，內徑為50μm、長度為25.5cm(檢測長度20cm)，外層涂有聚酰亞胺保護層，內壁均未涂層。電泳緩沖液為100mm磷酸—甘氨酸緩沖液(pH2.50，含20％乙氰和0.05％羥脯氨酰甲基纖維素HPMC)。毛細管柱沖洗方法新毛細管預處理為H2O 5min；1M NaOH 5min；H2O 5min；1M H3PO45min；Buffer 30min。樣品間沖洗程序1M H3PO44min；H2O 2min；Buffer 3min。電泳參數運行電壓12.5kV，毛細管溫度35℃，樣品槽溫度15℃，進樣8kM 5sec，電極由+向-，電泳圖譜如圖2所示。
⑤MALDI-TOF-MS使用島津AX1MA-CFRTMPlus型基質輔助激光解析附電離飛行質譜儀(配有軟件用于系統操作和數據處理)全自動樣品處理，軟件控制精確定位，具有延遲提取(DE)、源后裂解(PSD)功能。
靶板的清洗(384型)用棉球沾取甲醇，擦去靶板上的樣品，B.1％甲酸超聲10-15min，ddH2O沖洗，D.加丙酮超聲10-15min，加甲醇超聲10-15min，加水超聲10-15min，取出靶板，用甲醇沖洗，通風櫥中干燥。
基質的選擇與制備SA(3，5-Dimethexycinnamic acid)，10mg基質溶于1ml50％已睛+0.05％TFA中，避光保存。
標樣的制備與選擇HMW-GS分子量的測定Albumin(66430.09)，0.1％TFA溶解上樣前處理1％TFA平衡ZIPtip，過濾樣品反復抽吸5-10次，1％TFA過濾，0.4ulμElution Buffer洗脫樣品參數的設置大分子量的測定采用線性模式，分子量范圍10000-100000。
點樣(三明治法)基質0.5μl，樣品0.5μl，基質0.5μl。
實施例2硬粒小麥simeto高分子量谷蛋白By8基因的鑒定(1)亞基轉膜與N-端微量測序將雙向電泳凝膠上的蛋白點切下，回收純化后利用毛細管電泳檢測純度，然后通過Bio-Rad MiniTrans-Blot電轉印到PVDF膜上，在ABI cLC 491蛋白質測序儀上進行N-端微量測序。
(2)AS-PCR引物設計根據所得到的HMW谷蛋白N-端序列和已發表的相關基因保守序列設計AS-PCR引物，用以擴增y-型HMW亞基基因的編碼區和上游序列。引物序列如下①編碼區PCR引物P15’-ATGGCTAAGCGGTTGGTCCT-3’P25’-GGCTAGCCGACAATGCGTCG-3’P35’-TCACTGGCTAGCCGACAATG-3’②上游PCR引物P45’-ACCACAGTTTGCTCATATTGTCTTG-3’P55’-ACGTCTACACTTCTGCAAACAATACC-3’(3)葉片與種子基因組DNA提取選取硬粒小麥品種Simeto飽滿種子，用7％次氯酸鈉消毒10分鐘，25℃條件下浸種催芽過夜，黑暗25℃培養7～8天。用0.1克黃化苗按CTAB法提取總DNA。
取20mg砸碎的種子提取gDNA，于1.5ml eppendorf離心管內，加入100μl提取緩沖液(200mM Tris-Hcl，pH7.5，288mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS)浸解。再加入700μl提取緩沖液，渦旋20sec后，12000rpm離心5min。取上清，加入700μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，12000rpm離心10min。保留上清，加入700μl異丙醇，沉淀2min，12000rpm離心15min，棄上清，干燥后向沉淀中加入40μl TE緩沖液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0)，溶解24小時后，電泳檢測DNA濃度，-20℃保存。
(4)HMW-GS編碼基因的PCR擴增引物由上海Sangong公司合成；PCR用酶購自TaKaLa寶生物工程公司；PCR回收Kit購自上海Sangong公司；T-Vector連接Kit為Promega產品。
PCR反應體系①編碼區PCR體系和程序A.50ul體系La Taq酶 2.5U2×GC Buffer II(MgCl2+Plus) 25μldNTP 0.4mM每條引物 0.5μM模板DNA 100ng滅菌蒸餾水 50μlB.反應程序94℃變性2分鐘；94℃變性45秒，63℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，共35個循環；最后72℃延伸10分鐘。用1％瓊脂糖膠檢測PCR產物。
②上游PCR體系和程序A.50ul體系Taq酶2.5U10×PCR Buffer(MgCl2+Plus) 5μldNTP 0.4mM每條引物 0.5μM模板DNA 100ng滅菌蒸餾水 50μlB.反應程序94℃變性2分鐘；94℃變性45秒，64℃退火1分鐘，72℃延伸1.5分鐘，共35個循環；最后72℃延伸10分鐘。用1％瓊脂糖凝膠檢測PCR產物。
Southern雜交利用HMW-GS基因克隆制備探針進行Southern雜交，鑒定PCR產物。
PCR產物的回收①將所需的電泳凝膠切下放于1.5ml離心管中，加入700μl Binding Buffer，并于50℃-60℃水浴使瓊脂糖凝膠充分溶解；
②將UNIQ-10柱放入2ml收集管中，將凝膠溶解物轉移到UNIQ-10柱中，室溫放置2分鐘后以8000rpm離心1分鐘；③取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一收集管中，加入500ul Binding Buffer，8000rpm離心1分鐘；④取下UNIQ-10柱，去掉管中液體，加入500ul Wash Buffer，8000rpm離心1分鐘；重復一次；⑤取下UNIQ-10柱，去掉管中液體，將UNIQ-10柱放入同一收集管中，讓離心管蓋開著，室溫12000rpm離心1分鐘；⑥將UNIQ-10柱放入一新1.5ml離心管中，在柱子膜中央加30μl水到UNIQ-10柱中，室溫或37℃放置2分鐘；⑦室溫12000rpm離心1分鐘后即得到回收產物，可立即使用或-20℃保存。
(5)HMW-GS編碼基因的PCR克隆和鑒定①連接反應體系2*rapid ligation buffer 5μlpGEM-T Vector 0.5μlT4 DNALigase 1μlPCR回收產物3.5μl共10ul體積，4℃連接過夜。
②連接產物轉化大腸桿菌DH-5α感受態細胞A.大腸桿菌感受態細胞DH-5α的制備劃板復壯宿主菌后，挑一單菌落于20ml的LB(Tryptone 10g/L；Yeast extract 5g/L；NaCl 5g/L；pH7.0)液體培養基中，37℃搖至OD600＝0.3-0.4，取出置于冰上20分鐘。將菌液移至一滅菌的50ml離心管中，4℃4000rpm離心10分鐘，回收細胞。將細胞沉淀以10ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸，并置于冰上30分鐘。4℃4000rpm離心10分鐘，棄上清，用4ml冰預冷的0.1mol/L的CaCl2重懸菌體，加入滅菌甘油至終濃度30％，分裝后存于-70℃。
B.重組質粒向宿主菌的轉化取100ul DH-5α感受態細胞0.5ml的離心管中，加入10ul的連接產物并輕旋以混勻內含物，置于冰上30分鐘。42℃熱激90秒，置于冰上1-2分鐘。加入400ul 37℃預熱的LB培養基，37℃ 150rpm，搖培45分鐘。取150ul菌液鋪于涂有IPTG和X-Gal的LB平板上(Amp80ul/ml)，37℃倒置培養12-16小時。
③質粒的提取A.挑取單菌落于10ml LB(Amp 80ul/ml)液體培養基，37℃培養過夜。將菌液移至1.5ml的離心管中，12000rpm離心2分鐘，棄上清，收集菌體；B.加入100ul冰預冷的溶液I(50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8.0、10mMEDTApH8.0)，充分懸浮菌液，室溫放置5分鐘；C.加入新鮮配制的200ul的溶液II(0.2MnaOH、1％SDS)，輕搖菌液，冰上放置5分鐘；D.加入150ul冰預冷的溶液III(60ml 5M乙酸鉀、11.5ml冰乙酸、28.5ml雙蒸水)清搖菌液，冰上放置5分鐘，12000rpm離心10分鐘，移上清至一新離心管；E.加入等體積的酚/氯仿(1∶1)抽提一次，12000rpm離心5分鐘，移上清至一新離心管；F.加入2倍體積的無水乙醇，振蕩，室溫放置5分鐘，12000rpm離心10分鐘；G.用75％乙醇洗滌沉淀兩次，每次12000rpm離心5分鐘；H.吹干，溶于滅菌雙蒸水或TE緩沖液(含0.02mg/mlRNase)，做電泳檢測。
④重組質粒PCR法鑒定與序列測定A.按前述PCR反應體系和程序進行重組質粒鑒定；B.經鑒定的質粒進行DNA序列測定，由TaKaRa Biotech公司完成，得到了By8基因共3020bp，如序列表中SEQ ID NO.1所示的編碼全序列，該核苷酸序列包括一個無內含子的2166bp可讀框(編碼720個氨基酸殘基)和854bp的上游序列。
實施例3硬粒小麥Simeto高分子量谷蛋白By8基因的表達與鑒定(1)PCR產物的純化回收以硬粒小麥Simeto的基因組DNA為模板，擴增By8基因的PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠中進行電泳(穩壓50v)1小時，在紫外燈下將DNA條帶切下，用DNA凝膠純化試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit，Takara)將特異擴增條帶純化回收。
(2)PCR產物和表達載體PET-30a(Novagen)的雙酶切將回收的PCR產物和PET-30a質粒用EcoR I(TaKaRa)及Xho I(TaKaRa)進行雙酶切，酶切3小時后將酶切產物用Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)回收。
(3)連接與鑒定將待插入片段的雙酶切產物和PET-30a質粒的雙酶切產物按質量比3∶1的比例混合，加入T4 DNA連接酶(Promega)，16℃連接，反應過夜。
取連接產物加入大腸桿菌DH-5α感受態細胞中進行轉化，并進行藍白篩選和卡那霉素(Kan)抗性篩選，挑白色單菌落于含Kan(50ug/ml)的LB培養基中在37℃下培養過夜，堿裂解法小量制備質粒，對質粒進行酶切鑒定(EcoR I和Xho I)，以確定插入片段已連接到表達載體上。
(4)轉化及蛋白質表達取已制備的含插入片段的PET-30a質粒加入大腸桿菌BL-21(DE3)感受態細胞中轉化，挑取白色單菌落于含Kan(50ug/ml)的LB培養基中培養過夜獲得飽和培養物，取飽和培養物100ul加入10ml含Kan(50ug/ml)LB培養基中37℃培養3小時，向其中加入IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)使其在菌液中終濃度為1mmol/L，對培養物進行誘導，繼續培養三小時。
(5)表達蛋白提取與鑒定表達培養結束后，取菌液提取蛋白進行SDS-PAGE(方法同實施例1中所述)鑒定或者免疫印跡雜交鑒定(Immunobloting)，可以確定By8亞基基因編碼的蛋白已經表達。
實施例4硬粒小麥Simeto高分子量谷蛋白By8基因功能初步鑒定從硬粒小麥品種Simeto以及大腸桿菌表達蛋白中回收純化By8亞基，通過10g和面儀(10g面粉+10mg回收蛋白)測定揉面特性，初步鑒定By8基因的功能特性。分析結果圖5所示。從圖中可以看出添加By8亞基后，形成時間加長(添加后形成時間為4.5分鐘，比對照增加了2.1分鐘)。同時衰落角減小，10分鐘時的尾高和尾寬也都明顯增加，揉面特性變好。可以初步得出結論By8亞基可明顯改善面粉的揉面特性，具有改善小麥品質的作用，屬于優質亞基。
實施例5高分子量谷蛋白By8基因的應用通過基因表達和免疫印跡雜交鑒定，證實基因By8可在E.coli高效表達，并具有功能活性。利用基因工程技術可對高分子量谷蛋白By8基因加以轉移利用，如通過基因槍、花粉管通道、農桿菌轉化等方法轉化該基因，進而培育品質優良的轉基因小麥。
序列表<160>2<210>1<211>2163<212>DNA<213>小麥屬硬粒小麥(Triticum durum)<220>
<221>CDS<222>(1)…(2163)<400>1atggctaagc ggttggtcct ctttgcgaca gtagtcatca ccctcgtggc50tctcactgct gctgaaggtg aggcctctag gcaactacag tgtgagcgcg 100agctccagga gagctcgctt gaggcatgcc gacaggtcgt ggaccaacag 150ttggccggtc ggctgccatg gagcacgggg ctccagatgc gatgctgcca 200gcagctccga gatgttagcg ctaagtgccg cctcgtcgcc gtcagccaag 250tcgtaagaca atatgagcaa accgtggtgc cgcccaaggg cggatccttc 300taccctggcg agaccacacc actgcagcaa ctccaacaag taatattttg 350gggaacatct tcacaaacag tacaagggta ttacccaagc gtaagttctc 400ctcagcaggg gccatattat ccaggccaag cttctccaca acagccagga 450caagggcaac agccaggcaa atggcaagaa ctgggacaag ggcaacaagg 500gtactaccca acttctctgc atcagtcagg acaaggacaa caagggtact 550acccatcttc tctgcagcaa ccaggacaag ggcaacagat aggacaaggg 600caacaaggat actacccaac ttctctgcag cagccaggac aagggcaaca 650gataggacaa ggacaacaag ggtactaccc aacttctccg caacacccag 700gacaaaggca acaaccagga caagggcagc aaataggaca agggcaacaa 750ctaggacaag ggcggcaaat aggacaaggg caacaatcag gacaagggca 800acaagggtac tatccaactt ctccacagca gctaggacaa gggcaacaac 850caggacaatg gcaacaatca ggacaagggc aacaagggta ctacccaact 900tctcagcagc agccaggaca agggcaacaa gggcagtacc cagcttctca 950gcagcagcca ggacaagggc aacaagggca gtacccagct tctcagcagc 1000agccaggaca agggcaacaa gggcagtacc cagcttctca gcagcagcca 1050gcacaagggc aacaagggca gtacccagct tctcaacaac agccaggaca 1100agggcaacaa gggcactacc tagcttctca gcagcagcca ggacaagggc 1150aacaacggca ctacccagct tctctgcagc aaccaggaca agggcaacaa 1200gggcattaca cagcttctct gcagcaacca ggacaagggc aacaagggca 1250ttacccagct tctctgcagc aggtaggtca aggacaacaa ataggacagc 1300taggacaaag gcaacaacca ggacgagggc aacaaacaag acaagggcaa 1350caactagaac aagggcaaca accaggacaa gggcaacaaa caagacaagg 1400gcaacaacta gaacaagggc aacaaccagg acaagggcaa caagggtact 1450atccaacttc tccacaacag tcgggacaag ggcaacaacc aggacaatca 1500caacaaccag gacaagggca acaagggtac tactcaagtt ctctacaaca 1550gccaggacaa gggctacaag ggcactaccc agcttctctg cagcagccag 1600
gacaaggaca tccaggacaa aggcaacaac caggacaagg gcaacaacca 1650gaacaagggc aacaaccagg acaggggcaa caagggtatt atccaacttc 1700tccgcagcag ccaggacaag ggaaacaact aggacaaggg caacaagggt 1750actacccaac ttctccgcaa cagccaggac aagggcaaca accaggacaa 1800gggcaacaag ggcactgccc aacttctccg cagcagacag gacaagcgca 1850acaaccagga caaggccaac aaataggaca agtgcaacaa ccaggacaag 1900ggcaacaagg gtactaccca atttctctgc aacagtcagg acaagggcaa 1950cagtcaggac aagggcaaca atcaggacaa ggacaccaac taggacaagg 2000gcagcaatca ggacaagagc aacaaggcta cgacaaccca taccatgtta 2050acacagagca gcaaacggcc agcccaaagg tggcaaaggt gcagcaaccc 2100gcgacacagc tgccgataat gtgtcggatg gaggggggcg acgcattgtc 2150ggctagccag tga 2163<210>2<211>720<212>PRT<213>小麥屬硬粒小麥(Triticum duruum)<400>2Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Ala Thr Val Val Ile Thr Leu1 5 10 15Val Ala Leu Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ala Ser Arg Gln Leu Gln20 25 30Cys Glu Arg Glu Leu Gln Glu Ser Ser Leu Glu Ala Cys Arg Gln35 40 45Val Val Asp Gln Gln Leu Ala Gly Arg Leu Pro Trp Ser Thr Gly50 55 60Leu Gln Met Arg Cys Cys Gln Gln Leu Arg Asp Val Ser Ala Lys65 70 75Cys Arg Leu Val Ala Val Ser Gln Val Val Arg Gln Tyr Glu Gln80 85 90Thr Val Val Pro Pro Lys Gly Gly Ser Phe Tyr Pro Gly Glu Thr95 100 105Thr Pro Leu Gln Gln Leu Gln Gln Val Ile Phe Trp Gly Thr Ser110 115 120Ser Gln Thr Val Gln Gly Tyr Tyr Pro Ser Val Ser Ser Pro Gln125 130 135Gln Gly Pro Tyr Tyr Pro Gly Gln Ala Ser Pro Gln Gln Pro Gly140 145 150Gln Gly Gln Gln Pro Gly Lys Trp Gln Glu Leu Gly Gln Gly Gln155 160 165Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu His Gln Ser Gly Gln Gly Gln170 175 180Gln Gly Tyr Tyr Pro Ser Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln185 190 195
Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln200 205 210Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr215 220 225Tyr Pro Thr Ser Pro Gln His Pro Gly Gln Arg Gln Gln Pro Gly230 235 240Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gly Arg245 250 255Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr260 265 270Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly275 280 285Gln Trp Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr290 295 300Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala305 310 315Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala320 325 330Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala335 340 345Ser Gln Gln Gln Pro Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala350 355 360Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Leu Ala365 370 375Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Arg His Tyr Pro Ala380 385 390Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Thr Ala395 400 405Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ala410 415 420Ser Leu Gln Gln Val Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln Leu Gly425 430 435Gln Arg Gln Gln Pro Gly Arg Gly Gln Gln Thr Arg Gln Gly Gln440 445 450Gln Leu Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Thr Arg455 460 465Gln Gly Gln Gln Leu Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln470 475 480Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln485 490 495Gln Pro Gly Gln Ser Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr500 505 510Tyr Ser Ser Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Leu Gln Gly His515 520 525Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly His Pro Gly Gln530 535 540Arg Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Gly Gln Gln545 550 555Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln560 565 570
Pro Gly Gln Gly Lys Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr575 580 585Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln590 595 600Gly Gln Gln Gly His Cys Pro Thr Ser Pro Gln Gln Thr Gly Gln605 610 615Ala Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln Val Gln Gln620 625 630Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Ile Ser Leu Gln Gln635 640 645Ser Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln650 655 660Gly His Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Glu Gln Gln665 670 675Gly Tyr Asp Asn Pro Tyr His Val Asn Thr Glu Gln Gln Thr Ala680 685 690Ser Pro Lys Val Ala Lys Val Gln Gln Pro Ala Thr Gln Leu Pro695 700 705Ile Met Cys Arg Met Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ser Gln710 715 720End72權利要求
1.一種硬粒小麥高分子量谷蛋白By8基因，其特征在該基因具有序列表中SEQ ID NO.1第1位到2163位所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的硬粒小麥高分子量谷蛋白By8基因，其特征在于所述基因具有的核苷酸序列還可以是序列表中SEQ ID NO.1第1位到2163位中因一個或多個核苷酸的缺失、插入或替換而形成的具有功能活性的等位基因。
3.一種含有權利要求1或2所述的硬粒小麥高分子量谷蛋白By8基因的質粒。
4.一種含有權利要求1或2所述的硬粒小麥高分子量谷蛋白By8基因的植物表達載體。
5.權利要求1或2所述的硬粒小麥高分子量谷蛋白By8基因在培育轉基因小麥方面的應用。
全文摘要
本發明屬于生物基因工程技術領域，特別涉及一種硬粒小麥高分子量谷蛋白By8基因以及基于此基因通過生物技術方法改良小麥品質的應用。目前分離谷蛋白基因主要采用建庫篩選和PCR方法，本發明通過等位基因特異PCR技術，結合單、雙向凝膠電泳和毛細管電泳方法，在硬粒小麥中分離了一個新的高分子量谷蛋白亞基HMW－GS By8及其編碼基因By8，該基因序列能顯著增加面筋強度，可以在小麥品質改良中發揮重要作用。
文檔編號C12N15/29GK1712531SQ200510072140
公開日2005年12月28日 申請日期2005年5月25日 優先權日2005年5月25日
發明者晏月明, 姜怡, 安學麗, 肖英華, 裴玉賀, 司曉敏, 胡英考 申請人:首都師范大學