專利名稱：用于食物中毒病原菌檢測的染色指引法的制作方法
技術領域：
本發明屬于病原菌檢測技術，特別是用于食物中毒病原菌快速檢測的新方法。
背景技術：
由病原菌(霉菌)污染食品引起的食物中毒是當今世界上發生最廣泛、最常見的疾病之一。在食品工業化生產和食品貿易日益規模化、全球化的今天，病原菌污染食品的來源和方式也越來越顯隱蔽性、復雜性和可塑性。同時，由于人口和環境的變化、人類生活和行為方式的改變等原因，食物中毒的流行病學也正在發生迅速變化，老的病原菌引發食物中毒的發病率在不斷上升，新的病原菌引發食物中毒又不斷出現，致病菌耐藥性也在不斷增強。食物中毒發生分布的廣泛性，對世界各國都存在嚴重威脅，因而病原菌污染食品和引發食物中毒已成為一個共同關注的世界性公共衛生問題，直接威脅著人類，特別是對兒童的健康危害最大，同時，也直接或間接造成不同程度的經濟損失。
目前資料表明，食物中毒病原菌的檢測方法還沒有一個標準的統一規程，迄今仍參照國家制定的食品衛生微生物檢測方法(國標)進行。各地在食物中毒的流行病學調查中對病原菌的監測、病原檢測、病原溯源分析最常見的方法是采取假設的做盡可能多的多線培養檢測，檢樣首先選擇性增菌培養→劃種選擇性培養基→涂片染色鏡檢→血清學生化鑒定→動物毒力試驗。結果，病原菌項目檢測局限，盲目性大，而且有可能對調查產生誤導。同時，也存在漏檢率高，不易發現新病原菌(霉菌)，檢測時間長，檢出率低，耗材料，工作量大等諸多問題，從而明顯制約了及時準確處理突發性食物中毒事件的時效性。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡化、準確、高效確定食物中毒致病原菌檢測的新方法。
本發明檢測方法，也稱“染色指引法”，按以下檢測步驟進行a、將食物中毒樣本直接進行懸滴、涂片、革蘭氏染色鏡檢；b、確定檢樣中的優勢菌系和非優勢菌系；c、將優勢菌直接接種于選擇對口培養基，將培養出的優勢菌落作生化、血清學檢測后作出初步報告，并進行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告；d、補漏檢測，對確定的非優勢菌系先結合流行病學特征與相關臨床癥狀作選擇性增菌，然后進入對口培養基，將培養出的非優勢菌系作涂片染色鏡檢、定科生化試驗作出初步報告，并再進行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。
所述優勢菌是指同一形態、染色、動力占整個視野的60％以上。
培養出的非優勢菌系作定科生化試驗后進行一次定屬、群、種、型生化和血清學測定作出初步報告，并再進行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。
本發明“染色指引法”的優點1、對檢樣先進行直接涂片染色鏡檢觀察，根據病原菌的染色反應與形態，確定篩選優勢菌和甄別非優勢菌，而后選擇對口培養基，減少盲目性，提高了陽性檢出率，減少了漏檢率。
2、檢測效率和準確性明顯提高。尤其是通過直接涂片快速確定優勢菌，可及時有效對食物中毒現場及病人作出針對性處理。通過對58起疑難病原菌食物中毒的現場應用驗證表明，利用本發明方法檢測，其食物中毒的病原菌陽性檢出率高達88.89％，如果現場流行病學調查人員樣本采集及時、正確，方法規范，則病原菌陽性檢出率可達100％。經國內外文獻報道檢索表明，本方法效果顯著高于國內外同類實驗室報道的食物中毒病原菌為40-60％的陽性率水平。
3、檢測時間與“國標”方法比較明顯縮短二分之一(“國標”法需5-6天)，同時又節約材料，明顯減少工作量。
附圖表示了本發明所述檢測流程圖。
具體實施例方式參照附圖，首先采集樣品，比如涉嫌食物、病人嘔吐物、糞便等。一般常見的病原菌包括G+球菌，如金黃色葡萄球菌+計數、溶血性鏈球菌、糞鏈球菌；G+粗桿菌有芽胞，如臘樣芽胞桿菌+計數、肉毒梭菌、產氣莢膜梭菌；G+短小桿菌，如單核細胞增生李斯特菌；有動力G-桿菌，如沙門菌、致瀉大腸埃希菌、變形桿菌、椰毒假單胞菌酵米面亞種、氣單胞菌、鄰單胞菌；無動力G-桿菌，如志賀菌；G-彎曲菌(細長)，如空腸彎曲菌；G-弧菌，如副溶血性弧菌、溶藻性弧菌；菌絲或孢子，如酵母菌、霉菌。
將食物中毒樣本直接進行懸滴、涂片、革蘭氏染色鏡檢，對于同一形態、染色、動力占整個視野的60％以上的菌落認定為優勢菌系，對其余小比例的各種菌落認定為非優勢菌系；
然后，選擇對口培養基，將培養出的優勢菌落作生化、血清學檢測后作出初步報告，并進行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告；將檢測出的非優勢菌系結合流行病學特征與相關臨床癥狀作選擇性增菌，然后進入對口培養基，將培養出的非優勢菌作涂片染色鏡檢、定科生化試驗、定屬、群、種、型生化和血清學試驗后作出初步報告，并再進行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。
實施例145起微生物性食物中毒病原菌檢測結果。45起微生物性食物中毒檢出病原菌40起，檢出率為88.89％，其中細菌性38起(2起均由金黃色葡萄球菌與嘔吐型臘樣芽胞桿菌混合感染)，霉菌性2起。被檢出的40起微生物性食物中毒共分離到菌株42株13種，其中細菌性40株，分別為嘔吐型臘樣芽胞桿菌7株；金黃色葡萄球菌與副溶血性弧菌各6株；腹瀉型臘樣芽胞桿菌與大腸埃希菌(ETEC)各4株；溶藻性弧菌與大腸埃希菌各3株；普通、奇異變形桿菌、鼠傷寒沙門菌各2株；大腸埃希菌1株。霉菌性2株，分別為雜色曲霉與圓弧青霉，而這種霉菌用常規方法是無法檢出的。
實施例245起微生物性食物中毒優勢菌與非優勢菌檢測結果。45起微生物性食物中毒樣本經直接涂片染色，鏡檢下找出優勢菌37起，非優勢菌8起。37起優勢菌經培養，病原菌作科、屬、群、種(型)鑒定，檢出率為100％。8起非優勢菌經選擇性增菌、培養，病原菌經科、屬、群、種(型)鑒定，檢出病原菌3起，檢出率37.50％。
實施例313種病原菌與食物中毒樣本侵染關系。檢出病原菌的40起微生物性食物中毒，共采集到樣本761份，其中嘔吐物122份，糞便180份，可疑殘余食物388份、餐具47份、砧板2份、菜刀2份、抹布14份、炊事員糞便6份。結果，嘔吐物122份。檢出病原菌102份，占83.61％，其中金黃色葡萄球菌、嘔吐型臘樣芽胞桿菌檢出率分別為100％、93.02％。糞便180份，檢出病原菌153份，占85.00％，其中副溶性弧菌、嘔吐型臘樣芽胞桿菌、大腸埃希菌EIEC和圓弧青霉檢出率均為100％；大腸埃希菌ETEC、奇異變形桿菌、腹瀉型臘樣芽胞桿菌、大腸埃希菌EPEC、鼠傷寒沙門菌檢出率分別為93.10％、88.89％、83.33％、82.14％、80.00％。388份可疑殘余食物樣本13種病原菌均被檢出，檢出率為100％。餐具47份，檢出病原菌27份，占57.45％，其中副溶血性弧菌、溶藻性弧菌、雜色曲霉檢出率均為100％。砧板2份，檢出病原菌2份，分別為溶藻性弧菌和大腸埃希菌EPEC。菜刀2份，檢出病原菌1份，為普通變形桿菌。抹布14份，檢出病原菌10份，占71.43％，分別檢出金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、普通變形桿菌與大腸埃希菌EIEC。炊事員糞便6份，檢出病原菌2份，分別為鼠傷寒沙門菌與大腸埃希菌(ETEC)。
實施例413種病原菌毒素動物毒力試驗結果。將檢測獲得的13種病原菌毒素分別選擇幼貓、家兔、乳鼠、小白鼠、豚鼠作毒力試驗。結果，幼貓腹腔注射金黃色葡萄球菌、臘樣芽胞桿菌嘔吐型毒素試驗，陽性檢出率為100％。鼠傷寒沙門菌、大腸埃希菌(EPEC、ETEC)、臘樣芽胞桿菌、副溶血性弧菌、溶藻性弧菌與圓弧青霉毒素作家兔回腸段結扎試驗；小白鼠腹腔注射傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、溶藻性弧菌、臘樣芽胞桿菌、奇異變形桿菌、大腸埃希菌、圓弧青霉與雜色曲霉毒素、大腸埃希菌(EIEC)致瀉毒素作豚鼠角膜試驗陽性率均為100％。
實施例5109份食物中毒病人急性、恢復期血清抗體測定比較結果。將食物中毒樣本檢測分離到的病原菌菌株與109份病人急性期、恢復期血清作試管定量凝集試驗，結果，恢復期比急性期抗體滴度高出四倍以上有87例。
權利要求
1.一種用于食物中毒病原菌檢測的染色指引法，其特征在于按以下檢測步驟進行a、將食物中毒樣本直接進行懸滴、涂片、革蘭氏染色鏡檢；b、確定檢樣中的優勢菌系和非優勢菌系；c、將優勢菌直接接種于選擇對口培養基，將培養出的優勢菌落作生化、血清學檢測后作出初步報告，并進行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告；d、補漏檢測，對確定的非優勢菌系先結合流行病學特征與相關臨床癥狀作選擇性增菌，然后進入對口培養基，將培養出的非優勢菌系作涂片染色鏡檢、定科生化試驗作出初步報告，并再進行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。
2.根據權利要求1所述的用于食物中毒病原菌檢測的新方法，其特征在于所述優勢菌是指同一形態、染色、動力占整個視野的60％以上。
3.根據權利要求1所述的病原菌檢測的染色指引法，其特征在于對培養出的非優勢菌系作定科生化試驗后進行一次定屬、群、種、型生化和血清學測定作出初步報告，并再進行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。
全文摘要
本發明是一種用于食物中毒病原菌檢測的染色指引法，按以下檢測步驟進行將食物中毒樣本直接進行懸滴、涂片、革蘭氏染色鏡檢；確定檢樣中的優勢菌系和非優勢菌系；將培養出的優勢菌落作生化、血清學檢測后作出初步報告，并進行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告；將培養出的非優勢菌系作涂片染色鏡檢、定科生化試驗作出初步報告，并再進行動物毒力試驗或基因毒素測定后作出確診報告。本發明可減少盲目性，提高陽性檢出率，減少漏檢率，檢測效率和準確性明顯提高，尤其是通過快速確定優勢菌，可及時進行針對性診療。
文檔編號C12Q1/02GK1793848SQ20051006166
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月22日 優先權日2005年11月22日
發明者葛素君, 馮濟富, 許際華, 裘丹紅 申請人:臺州市疾病預防控制中心