綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的制作方法

專利名稱：綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新穎的微生物菌株。具體而言，本發明涉及一種綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株。本發明也涉及該綠膿桿菌菌株的培養、處理、用途和使用方法。本發明還涉及利用該綠膿桿菌菌株制備的醫療用產品。
背景技術：
綠膿桿菌是臨床上常用名稱，其學名是銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。在分類學上，銅綠假單胞菌屬于假單胞菌屬(PseudomonasMigula 1894)，參見R.E.布坎南，N.E.吉本斯，等編，伯杰細菌鑒定手冊，第八版，科學出版社(1984)，第274頁到第279頁。依據本領域的通常理解，術語“綠膿桿菌”和“銅綠假單胞菌”是同一種物種在不同場合下的稱呼。在本申請中，較多使用了術語“綠膿桿菌”，必要時候也使用術語“銅綠假單胞菌”，這種術語使用上的差別并不構成所指微生物的差別。就實質意義而言，本申請中的術語“綠膿桿菌”都可以替換為“銅綠假單胞菌”。
綠膿桿菌大小約1.5～3.0um長，0.5～0.8um寬，外形為桿狀。革蘭氏染色陰性。具有運動性，大多數為單端鞭毛。能從土壤和水中分離到，通常從臨床樣品中分離，例如傷口、燒傷和尿道感染中分離。最適培養溫度約為37℃度。重要的特征包括產生膿青素，氧化酶試驗陽性，能夠液化明膠，微弱的分解脂肪，41℃生長4℃不生長，分解葡萄糖，精氨酸雙水解酶試驗陽性，等等參見R.E.布坎南，N.E.吉本斯，等編，伯杰細菌鑒定手冊，第八版，科學出版社(1984)，第278頁。由于能夠產生膿青素，所以感染傷口時形成綠色膿液，故而被稱為綠膿桿菌或者綠膿假單胞菌。
對哺乳動物，尤其人類而言，綠膿桿菌是一種條件致病菌。長期應用激素、免疫抑制劑、腫瘤化療、放射治療等導致患者免疫功能低下(失衡)，以及手術后或某些治療操作后(氣管切開、保留導尿管等)的患者易罹患本菌感染。另外，綠膿桿菌對外界環境抵抗力較強，在潮濕處能長期生存，對紫外線不敏感，濕熱55℃1小時才被殺滅。正常人皮膚，尤其潮濕部位如腋下、會陰部及耳道內，呼吸道和腸道均有該菌存在。醫院內多種設備及器械上均曾分離到本菌，通過各種途徑傳播給病人、病人與病人的接觸也為傳播途徑之一。綠膿桿菌還可引起與醫院環境無關的感染，近年來對此已有更多的認識，它已成為足穿刺感染、心內膜炎、濫用藥物所致的骨髓炎、眼部感染、新生兒感染性外耳炎、游泳池等引起皮膚病等的主要病原菌。
綠膿桿菌可以產生多種與毒力有關的物質，例如內毒素、外毒素A、彈性蛋白酶、膠原酶、胰肽酶等。綠膿桿菌菌株類型較多，按照O-抗原可以分為12個血清型，按照Fisher免疫型可以分成7類。在采用青霉素類、頭胞類等抗生素的預防或者治療方法中，不斷出現耐藥菌株。也已探索了增強調控宿主的免疫系統的方法，比如，中國專利86108380，申請日1986年12月10日，申請人遺傳學系統公司，其中公開了能結合銅綠假單胞菌的脂多糖分子的單克隆抗體的生產和應用；中國專利申請87104581，申請日1987年8月25日，申請人遺傳學系統公司，其中公開了能識別銅綠假單胞菌鞭毛的單克隆抗體。在中國專利申請94190491.1，申請日1994年6月2日，申請人第一制糖株式會社，其中公開了通過重復純化過程培養減毒銅綠假單胞菌株和制備含有細胞壁蛋白的免疫疫苗，該技術方案的目的在于克服與銅綠假單胞菌菌株自身毒性相關的問題，例如在用末減毒普通銅綠假單胞菌提取細胞壁蛋白作為抗原時，會有異源核酸和毒性高分子物質，脂多糖(LPS)等混入其中，從而限制了細胞壁蛋白免疫疫苗的用途。該技術方案通過培養減毒銅綠假單胞菌菌株可以克服銅綠假單胞菌菌株自身內在毒性所產生的危險。
近年來，假單胞菌發病率有所增加。研究表明，假單胞菌菌屬種類高達140種以上，大部分為腐生菌或能導致植物病害，約有二十五種會感染人類。由于假單包菌在分類學上屬于好氧或兼性厭氧非發酵革蘭氏陰性桿菌，基于結構上的共性，也有采用多種假單胞菌的活性蛋白提取物用于預防和治療慢性肺心病肺部感染和各種假單胞菌感染，參見中國專利ZL95119866.1，申請日1995年12月7日，專利權人余國華，授權公告日2002年6月26日，其中描述了包括微粒蛋白、內毒素蛋白、粘液蛋白和類毒素的假單胞菌活性蛋白，實施中需要使內毒素脫毒、并使外毒素變成類毒素。在InfectImmun1980；40:670上報導了日本學者本間遜，曾發現綠膿桿菌的死菌體有免疫調節作用，其死菌體注射到動物體內能激發體液免疫和細胞免疫狀態，誘導生成干擾素并具有分裂原作用，還能誘導動物抵抗接種的癌細胞的生長，但是由于該菌體毒性太大、免疫效價低，故而無法實際應用。
因此，需要尋找和提供具有廣譜的、高免疫原性的、低毒性的物質，用于預防和/或治療與細菌感染有關的疾病。但是，現有技術中記載的綠膿桿菌難以滿足需要。
如上所述，綠膿桿菌是革蘭氏染色陰性細菌(G-)。細胞壁內層為肽聚糖層，外層為非對稱的雙層脂膜。外層中含有脂多糖(LPS，也稱為內毒素endotoxin)，蛋白質和磷脂。脂多糖等有毒成分所帶來的副作用限制了對綠膿桿菌的利用。
如上所述，綠膿桿菌具有鞭毛。鞭毛主要由一種稱為鞭毛蛋白(flagellin)的蛋白構成。
自然界分離得到的綠膿桿菌有些沒有菌毛，有些具有叢毛性菌毛。
菌毛是菌體表面極其纖細的蛋白微絲，須用電鏡觀察。特點是細、短、直、硬、多，一般認為菌毛與細菌運動無關，根據形態、結構和功能可分為普通菌毛和性菌毛兩類。前者與細菌粘附和侵染宿主有關，后者為中空管子，與傳遞遺傳物質有關。
另有報導，菌毛與抽動運動型(TWiching motility)有關，(請參閱①Med.Mrobiol.，29321～330，1998.<淋病球菌>
②Gene，192109～113，1997，<綠膿桿菌>目前認為二菌均多屬IV型普通菌毛(屬非甘露糖敏感血凝普通菌毛)。)在Sharon N，Eshdat Y，Silverblatt F J，Ofek I，Bacterial adherenceto cell surface sugars，ciba Found Symp.1981；80119～141中，說明了大腸桿菌和沙門氏菌的菌毛中存在與宿主細胞發生粘附的物質，并且該粘附會受到糖，例如D-甘露糖的抑制；而且糖蛋白介導的粘附是普遍的廣泛的。在Wim Gaastra and Frist K.de Graaf，Host-SpecificFimbrial Adhesions of Noninvasive Enterotoxigenic Escherichiacoli Strains，Microbiological Reviews，June 1982，Vol.46，No.2，P.129～161中討論了大腸桿菌的多種菌毛的性質也討論了甘露糖敏感血細胞凝集(Mannose-sensitive hemagglutination，甘露糖敏感血凝)和甘露糖抗性血細胞凝集(MRHA)以及非血細胞凝集(Non-HA)在SpeertDP，Lon BA，Eftekbar F，Opsonin-independent phagocytosis ofPseudomonas aeruginosa，Antibiot Chemother.985；3688～94，提示了菌毛部分的介導了人嗜中性粒細胞對假單胞菌的吞噬作用。關于菌毛的綜合性論述，參見，牟希亞，細菌菌毛及有關粘附素研究的新進展，微生物學雜志，第4卷，第3期，1984年11月，第14頁到第17頁。上述公開出版物提示具有甘露糖敏感血細胞凝集(甘露糖敏感血凝)性質的菌毛可能存在于多種屬細菌上，比如腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的最常見的菌毛是I型普通菌毛(即甘露糖敏感血凝菌毛)。從菌毛蛋白質編碼來看，有多種形式。比如I型普通菌毛蛋白質編碼受核質基因控制，性菌毛蛋白質編碼受質粒控制。
在分離到的綠膿桿菌中，如果具有叢毛性菌毛或者端毛性菌毛，則除了性菌毛受質粒控制外，其他菌毛的遺傳基因也可定位在染色體上。有些普通菌毛不具有甘露糖敏感血細胞凝集(甘露糖敏感血凝)性質。1980年到1981年，以色列學者Gitboa-Garber教授(In adhesion andmicroorganism pathogenicy ciba foundation symposium 80.PitmanMedical p119～141)發現綠膿桿菌的染色體上帶有形成甘露糖敏感血凝菌毛的功能基因，但只能在綠膿桿菌體內合成甘露糖敏感血凝蛋白質，不能將甘露糖敏感血凝蛋白質分泌到菌體外，也不能在細胞表面形成甘露糖敏感血凝菌毛。
Gitboa-Garber教授用超聲波法破碎細菌菌體后提取甘露糖敏感血凝蛋白質抗原，但產量低，且不易保持純度。在Sharon N，Eshdat Y，Silverblatt FJ，Ofek I，Bacterial adherence to cell surface sugars，ciba found Symp.1981；80119～141中對Gitboa-Garber教授實驗結果有敘述。
基于以上所述，欲使綠膿桿菌，或者其菌體提取物，或者其代謝物成為有用的、安全的產品，比如作為免疫調節劑，必須克服其毒性。同時，為了增加其廣譜作用性能，應該促使其表達多種細菌的共同免疫原，比如在細菌細胞的表面形成甘露糖敏感血凝菌毛。為了達到較佳的效果，還應該注意利用免疫原性的保留或進一步予以增強。
本發明通過菌種選育和改造，得到了一種新穎的綠膿桿菌菌株，滿足了上述需要。
發明概述第一方面，本發明提供了一種綠膿桿菌菌株，命名為綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株，也稱作銅綠假單胞菌甘露糖敏感血凝菌毛株(Pseudomonas aeruginosa mannose-sensitive hemagglutination pilusstrain)。在分類學上，該菌株屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)的銅綠假單胞菌的一種新型菌株。該菌株已經于1993年2月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址中國北京市海淀區中關村北一條13號中國科學院微生物所。CGMCC是布達佩斯條約承認的生物材料樣品國際保藏單位。該菌株的編號是CGMCC No.0190，分類命名是銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。
綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的特征在于a.在菌體周圍有許多纖細而剛直的菌毛，b.甘露糖敏感血凝試驗呈現強陽性，c.平板菌落粘附紅細胞試驗強陽性，d.酵母菌的直接凝集試驗呈MS血凝。
第二個方面，本發明提供了影響細菌核DNA編碼和表達甘露糖敏感血凝菌毛的質粒。綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株中含有協助細菌細胞核DNA編碼表達甘露糖敏感血凝菌毛蛋白質的質粒。采用常規辦法從該菌株提取的質粒協助細菌核DNA編碼表達，也包括在本發明之內。進一步地，采用該質粒幫助轉化本屬或者其他細菌所得到的菌株也是在本發明之內。通過菌體接合過程，使綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株中的質粒進行轉移及核染色體DNA整合，以及如此所得的包含該質粒的微生物也在本發明之內。所以采用本領域的常規技術手段得到的分離的編碼甘露糖敏感血凝菌毛的基因，以及以質粒中的存在形式或者染色體中的存在形式存在的該基因也在本發明的范圍之內。
第三個方面，本發明提供了綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的死菌體，菌體制備物，提取物，分離自菌體的物質。綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的細胞包括細胞壁、細胞質膜、細胞質和細胞器、核區或類核等結構，細胞壁又包括內層和外層，細胞外有一端生有鞭毛，并具有周身菌毛。菌毛種類多樣，其中包括甘露糖敏感血凝菌毛，非甘露糖敏感血凝菌毛和性菌毛。從成分而言，有DNA分子，RNA分子，蛋白質，脂類分子等等。培養過程中，也可以產生代謝產物。
在一個實施方案中，以本發明的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株為基礎，經過培養和滅活，得到死菌體。死菌體可以作為動物體包括人體的機體免疫系統刺激物，獲得有益效果。優選的，死菌體可以從培養基或者培養液中純化后使用。也可以在其中加入其他試劑或者藥劑、佐劑、輔劑等，獲得更好的免疫刺激或調控效果。
在一個實施方案中，以本發明的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株為基礎，經過培養、提取、純化等步驟可以得到上述結構或者上述物質中的某一種或者幾種或者任意組合，用作動物體包括人體的機體刺激物，獲得有益的效果。
關于本發明的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的用途。本發明的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株毒性低，免疫作用強，而且具有廣譜作用的特性。用該菌株制備的菌苗或者免疫調節劑可以全面激活調控人體的細胞免疫和體液免疫系統，對多種細菌產生抵抗作用。免疫調節活性和抗腫瘤作用均具明顯效果。
附圖簡述本發明的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的有關保藏信息如下保藏日期1993年2月5日保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏單位簡稱CGMCC保藏編號0190

圖1是從自然界分離的綠膿桿菌電子顯微鏡照片，顯示現有技術中所描述的綠膿桿菌的形態特征(叢毛性、非甘露糖敏感血凝菌毛)。
圖2是本發明綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的電子顯微鏡照片，顯示本發明的綠膿桿菌菌株的形態特征(周毛性、甘露糖敏感血凝菌毛)。
圖3是本發明綠膿桿菌與其它菌的氧化酶對比結果照片，其中上半部分顯示對照細菌氧化酶實驗為陰性；下半部分表示本發明綠膿桿菌氧化酶試驗陽性。
圖4是本發明綠膿桿菌的色素對比結果照片。左邊的平板顯示對照細菌不能形成銅綠色綠色素；右邊的平板顯示本發明的綠膿桿菌具有形成銅綠色素的特征。
圖5表明本發明綠膿桿菌菌株在葡萄糖硝酸鹽培養基中形成N2，表現陽性，而對照細菌均為陰性結果；也表明在半固體運動試驗中呈現陽性。在圖5中，從左到右，1號試管表示正常培養基對照，2號試管表示本發明的綠膿桿菌形成了氣泡，3號和4號試管表示對照細菌；5號試管表示本發明的綠膿桿菌在半固體培養基中的生長狀況。
圖6是本發明綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的甘露糖敏感血凝玻片凝集直接觀察，呈現甘露糖敏感血凝陽性照片。
圖7是本發明綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的甘露糖敏感血凝受甘露糖抑制后，呈現甘露糖敏感血凝陰性結果照片。
發明祥述1.定義和解釋在本申請中，對下述術語和解釋予以特別說明。
“細菌”是一類單細胞原核生物。基因載體是由一束雙鏈DNA纖維絲組成的，沒有任何膜的界限把它和細胞質分開。缺少細胞器。核蛋白體為70S。本申請中談論的是“真細菌(eubacteria)”。真細菌可以劃分為革蘭氏陽性和革蘭氏陰性兩種類型。
“革蘭氏染色法”是通過使用結晶紫溶液和碘液，依據真細菌的細胞壁結構不同，對細菌進行區分的染色方法。
“綠膿假單胞菌屬”在《伯杰細菌鑒定手冊》第八版中列于革蘭氏陰性好氧桿菌和球菌部分之下的假單胞菌科。細胞單個，直的或者彎的桿菌。單鞭毛或者多鞭毛，革蘭氏陰性。有機化能異氧菌，呼吸代謝，永不發酵。接觸酶陽性。模式種銅綠假單胞菌(Psudomonas aeruginosa(Schroeter)Migula 1900，884)。
《伯杰細菌鑒定手冊》第八版中列出的其他革蘭氏陰性細菌，包括在第八部分革蘭氏陰性兼性厭氧桿菌、第九部分革蘭氏陰性厭氧細菌、第十部分革蘭氏陰性球菌和球桿菌也與本發明有關。
銅綠假單胞菌(Psudomonas aeruginosa(Schroeter)Migula 1900，884)的描述在《伯杰細菌鑒定手冊》第八版的第279頁，該物種異名為綠膿桿菌。新模式株ATCC10145；NCIB8259；NCTC10332Opin.36，Jud.Comm。
“鞭毛”是某些細菌的運動器官，主要由鞭毛蛋白構成。
“菌毛”是細菌表面的纖絲附屬結構，比鞭毛更短、更直，而且細小得多。菌毛由蛋白質構成。菌毛區分為普通菌毛和性菌毛。
“普通菌毛”與細菌體粘附有關。普通菌毛種類繁多，依據其在細菌粘附中的作用的相對不同，可以分為非專一性粘附菌毛和專一性粘附菌毛。
“非專一性粘附菌毛”是指那些可以使細菌粘附到多種基質上的菌毛，比如多種真核細胞上，例如多種動物的紅細胞，白細胞，上皮細胞，和其他測試中的動物細胞、植物細胞和真菌細胞。也就是這些菌毛對宿主沒有嚴格的選擇性，粘附具有廣泛性，例如大腸桿菌的1型菌毛(typel fimbriae)。在使用不同動物來源的紅細胞時，非專一性粘附表現出相似模式的紅細胞凝集活性；并且紅細胞凝集作用(hemagglutinaion)對甘露糖敏感(mannose-sensitive)。因此，甘露糖敏感紅細胞凝集作用(mannose-sensitive hemagglutination，甘露糖敏感血凝)是非專一性粘附菌毛的一個特征。
“專一性粘附菌毛”是指那些促使細菌粘附到特定基質上的菌毛。也就是這些菌毛對宿主具有嚴格的選擇性，粘附只能在細菌和特殊宿主之間發生，比如大腸桿菌菌毛K88。紅細胞凝集作用不表現甘露糖敏感性，即不被甘露糖抑制的血凝。
“甘露糖敏感血凝菌毛”全稱為“甘露糖敏感紅細胞凝集作用菌毛”，是指促進細菌粘附到多種基質上的非專一性的粘附菌毛，能夠被甘露糖抑制。在本申請中，甘露糖敏感血凝菌毛是一個廣義概念。現有研究提示，在細菌，比如銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙門氏菌等，粘附到宿主細胞的過程中，糖介導粘附普遍存在。有些是甘露糖敏感，有些是L-巖藻糖敏感，D-半乳糖敏感的。在此，“甘露糖敏感血凝菌毛”包括甘露糖敏感細胞凝集作用菌毛，各種其他糖類調節的、與細菌和宿主的非專一性粘附相關的菌毛。
已有的“銅綠假單胞菌”菌株，包括收藏在各個菌種保藏中心的菌株(比如ATCC10145，中國專利申請94190491.1中的保藏編號為KCCM10029、KCCM 10030、KCCM 10031、KCCM 10032、KCCM 10033、KCCM10034到KCCM 10035的菌株)，實驗室研究用(比如PAK1244，PAK和PAU1菌株)。這些菌株大部分具有強毒性，不具有周身菌毛，菌毛類型為非甘露糖敏感血凝類型。
本發明的銅綠假單胞菌菌株，表現出低毒性，具有周身菌毛，菌毛中有甘露糖敏感血凝菌毛。本發明將該菌株命名為綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株，并于1993年2月5日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號是CGMCC No.0190。
2.詳細描述本發明提供的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株全稱為銅綠假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa)甘露糖敏感血凝菌毛株，它是一種具有周身菌毛性甘露糖敏感血凝(Mannose Senaitive Hemagglutination)菌毛的綠膿桿菌，該菌毛株具有跨菌屬的廣譜免疫原性。
如背景技術部分所述，在發現綠膿桿菌的死菌體具有免疫調節作用之后，由于其自身毒性的關系，無法實際利用。已有的研究集中在設法利用細菌某種成分或者幾種成分的提取物或者分離物上，例如細胞壁中的蛋白質。雖然有人也對菌種進行了選育，但是目的是降低菌株毒性、獲得具有較高安全性的細菌細胞壁蛋白。因此，現有技術沒有提供綜合利用綠膿桿菌菌體中的物質進行疾病預防和治療的可行方法。
本發明的發明人注意到了菌毛在細菌和宿主作用中的重要性，注意到甘露糖敏感血凝菌毛在細菌和宿主作用中的普遍性；力爭構建一株具有低毒性、廣譜免疫原性的綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株并利用菌體中的物質，特別是甘露糖敏感血凝菌毛進行免疫刺激和調理。
本發明的發明人對此問題所發表的有關文章和專利申請如下(這些公開出版物中的內容完整地引入本專利申請中)1.牟希亞，綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的建立，微生物學報，1986，26(2)176；2.牟希亞，綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的建立及初步應用研究，醫學研究通訊，1987，3383-87；3.牟希亞，郭雁群，付宏文，綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株的應用研究，大連醫學院學報，1990，12(2)63-65；4.中國專利申請93100114.5，申請日1993年2月6日，申請人牟希亞，發明名稱綠膿桿菌甘露糖敏感血凝菌毛株及其建立，
發明者牟希亞, 郭雁群, 牟心赤 申請人:牟希亞