專利名稱：一種肝臟高效表達調控序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種高效表達調控序列及其應用，特別是涉及一種肝臟高效表達調控序列及其在表達外源基因中的應用。
背景技術：
一些遺傳性疾病可使肝臟的蛋白合成功能發生障礙，目前臨床上對這些疾病的治療方法非常有限，主要是通過反復注射缺失蛋白來進行治療，但是這種治療方式較為昂貴，有感染疾病的危險，并且只能暫時減輕疾病的癥狀。肝臟移植可解決遺傳性疾病的血清蛋白質缺陷問題，但供體器官來源有限。隨著分子生物學的發展出現了基因療法，可以顯著改善很多遺傳性疾病的治療，由于肝臟所具有的蛋白翻譯后的修飾功能使其成為基因治療遺傳性血液病的重要靶器官，通過肝臟基因療法將功能基因導入基因缺陷的個體并使其在體內長期高效表達，但目前限制肝臟基因治療的主要因素是基因在肝臟內表達水平較低，例如通過逆轉錄病毒介導的因子E或人1抗胰蛋白酶(hAAT)的表達水平只有正常水平的百分之一，造成低水平表達的原因之一是轉錄活性不強，為加強基因在體內的高水平表達，構建肝臟高效表達調控序列成為必需。
發明內容
本發明的目的是提供一種肝臟高效表達調控序列。
本發明所提供的肝臟高效表達調控序列，是含有肝臟特異性啟動子AAT-1202-+45和增強子Aer及ApoE的表達調控序列。
所述ApoE的Genebank號為gi|975886|；所述Aer的Genebank號為gi|24797079|；所述AAT-1202-+45的Genebank號為gi|1236244|。
所述增強子Aer和ApoE位于啟動子AAT-1202-+45的上游，Aer及ApoE的前后順序可以改變。
所述肝臟高效表達調控序列具有序列表中SEQ ID №1或SEQ ID №2的DNA序列。
含有上述肝臟高效表達調控序列的肝臟表達載體也屬于本發明的保護范圍。
用于構建所述肝臟表達載體的出發載體可為任何一種原核或真核表達載體，優選為PCI neo。
其中，以PCI neo為出發載體構建的肝臟表達載體為PCI neoAerApoEAATP。
經實驗驗證，本發明所提供的肝臟高效表達調控序列，可調控外源基因地高效表達，彌補了低水平轉錄活性不強的缺點。本發明具有較高的實際應用價值，在醫學領域具有廣闊的應用前景。
圖1A為注射后第1天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測結果圖1B為注射后第4天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測結果圖1C為注射后第11天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測結果圖1D為注射后第27天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測結果圖1E為注射后第54天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測結果圖1F為注射后第87天血清中hAAT濃度的ELISA法檢測結果圖2A為注射后第1天血清中SEAP濃度的檢測結果圖2B為注射后第3天血清中SEAP濃度的檢測結果圖2C為注射后第9天血清中SEAP濃度的檢測結果圖2D為注射后第31天血清中SEAP濃度的檢測結果圖2E為注射后第57天血清中SEAP濃度的檢測結果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物均由博亞公司合成，所用酶制劑均購自TaKaRa公司。
實施例1、肝臟高效表達調控序列的構建本實施例構建了四種肝臟表達調控序列，分別為AerApoEAATP、ApoEAATP、AATP和AlbEAATP，其中，AerApoEAATP含有肝臟特異性啟動子AAT-1202-+45和增強子Aer及ApoE，后三種為對照序列，用于實施例3和實施例4中AerApoEAATP表達效果的驗證實驗。
根據AAT-1206-355(Genebank號gi|1236244|)、AAT-348-+45(Genebank號gi|177830|)、AAT-261-+45(Genebank號gi|177830|)、Aer(Genebank號gi|24797079|)、ApoE(Genebank號gi|975886|)、AAT-1202-45(Genebank號gi|1236244|)、Alb(Genebank號gi|191868|)、ApoEAAT(Genebank號gi|975886|+gi|177830|)和hAAT(Genebank號gi|177828|)的cDNA序列設計PCR擴增上述基因片段的引物，引物序列如下擴增AAT-1206-355的引物PA(上游引物)5’-GGAAGATCTGGATCCTGTGGTCACTCGCCT-3’PB(下游引物)5’-AAAAGTACTACCATTTACTGAGTCACCCCAAA-3’
擴增AAT-348-+45的引物PC(上游引物)5’-AAAAGTACTTGCTACCAGTGGAACAGCCACTA-3’PD(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’擴增AAT-261-+45的引物PE(上游引物)5’-CGGGGTACCCGCCACCCCCTCCACCTT-3’PD(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’擴增Aer的引物PF(上游引物)5’-CCCAAGCTTACAGCCCCTAGAAAATAACCTGCGTT-3’PG(下游引物)5’-CGGGGTACCTAAACGTAGACAAGTTGGCCT-3’擴增ApoE的引物PH(上游引物)5’-GGAAGATCTGGCTCAGAGGCACACAGGAGT-3’PI(下游引物)5’-CCCAAGCTTCCCTCTCACACTACCTAAACCA-3’擴增AAT-1202-45的引物PJ(上游引物)5’-CGGCGTACCTGTGGGTCACTCGCCTGGTAGA-3’PD(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’擴增AlbE的引物PK(上游引物)5’-CGGGGTACCTAAACGTAGACAAGTTGGCCT-3’PL(下游引物)5’-GGAAGATCTGTTCCTAGATTACATTACACAT-3’擴增ApoEAAT的引物PM(上游引物)5’-GGAAGATCTGGCTCAGAGGCACACAGGAGT-3’PD(下游引物)5’-GGACTCTCTTAAGGTAGCGATTCACTGTCCCAGGTCAGT-3’擴增hAAT的引物PN(上游引物)5’-CCGGAATTCAATCGACAATGCCGTCTTCT-3’po(下游引物)5’-CCGGTCGACTCCAGCTCAACCCTTCTTTA-3’一、肝臟表達調控序列ApoEAATP的構建以質粒載體pBC-hFIX-B[1](Eric C Olivares，Roger P.Hollis，ThomasW.Chalberg et al.Site-specific genomic integration produces therapeuticFactor IX levels in mice.nature，2002)為模板，在引物PM和PD的引導下，PCR擴增ApoEAATP，將PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收該目的片段，并將其插入到載體pGEM-T(Promega公司)后，轉化大腸桿菌DH5α(博大泰克公司)，經藍白斑篩選和PCR鑒定后進行測序，將序列正確的陽性克隆擴增后提質粒，命名為T-ApoEAATP。將T-ApoEAATP用限制性內切酶IppoI和BglII雙酶切后回收得到目的片段ApoEAATP。
二、肝臟表達調控序列AATP的構建以人肝臟的基因組DNA為模板，在引物PA和PB的引導下，PCR擴增AAT-1206-355，在引物PC和PD的引導下，PCR擴增AAT-348-+45，將上述PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的片段AAT-1206-355和AAT-348-+45，將AAT-1206-355插入到載體pGEM-T后，轉化大腸桿菌DH5α，經藍白斑篩選和PCR鑒定后進行測序，將序列正確的陽性克隆擴增后提質粒，命名為T-AAT-1206-355；將AAT-348-+45插入到載體pGEM-T后，轉化大腸桿菌DH5α，經藍白斑篩選和PCR鑒定后進行測序，將序列正確的陽性克隆擴增后提質粒，命名為T-AAT-348-+45。將T-AAT-1206-355經BglII和ScaI雙酶切后，回收大小為851bp的目的片段，將該片段命名為BglIIAAT1206-355ScaI；將T-AAT-348-+45經ScaI和IppoI進行雙酶切后，回收大小為303bp的目的片斷，將大小為303bp的目的片段用T4DNA連接酶與BglIIAAT1206-355ScaI進行連接，再以該連接產物為模板，在引物PA和PD的引導下，PCR擴增AAT-1206-+45，將PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收該目的片段，并將其插入到載體pGEM-T后，轉化大腸桿菌DH5α，經藍白斑篩選和PCR鑒定后進行測序，將序列正確的陽性克隆擴增后提質粒，命名為T-AAT-1206-+45。將質粒載體T-AAT-1206-+45用限制性內切酶IppoI和BglII進行雙酶切后，回收得到目的片段AAT-1206-+45。
三、肝臟表達調控序列AerApoEAATP的構建提取人肝臟的基因組DNA，并以此為模板，在引物PH和PI的引導下，PCR擴增ApoE，在引物PF和PG的引導下，PCR擴增Aer，再以T-AAT-1206-+45為模板，在引物PJ和PD的引導下，PCR擴增AAT-1202-+45，將上述PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收大小正確的目的片段，將ApoE、Aer、AAT-1202-+45插入到載體pGEM-T后，轉化大腸桿菌DH5α，經藍白斑篩選和PCR鑒定后進行測序，將序列正確的陽性克隆擴增后提質粒，將三種質粒載體命名為T-ApoE、T-Aer；T-AAT-1202-+45。將T-ApoE經限制性內切酶ScaI和HindIII雙酶切后回收ApoE片斷，并將該片段與經同樣酶酶切處理的載體T-Aer連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，PCR鑒定陽性克隆后提取質粒，命名為T-AerApoE。將T-AAT-1202-+45經限制性內切酶KpnI和SacI雙酶切后回收AAT-1202-+45片斷，并將該片段與經同樣酶酶切處理的載體T-AerApoE連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經藍白斑篩選和PCR鑒定陽性克隆后提質粒，命名為T-AerApoEAAT，用限制性內切酶IppoI和BglII對T-AerApoEAAT進行酶切后得到目的片斷AerApoEAAT，對該DNA片段進行序列測定，測定結果表明AerApoEAAT具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №1由1880個堿基組成，自5’端第1-6位堿基為限制性內切酶BglII的識別位點，自5’端第7-326位堿基為增強子ApoE，自5’端第327-332位堿基為限制性內切酶HindIII的識別位點，自5’端第333-613位堿基為增強子Aer，自5’端第614-619位堿基為限制性內切酶KpnI的識別位點，自5’端第620-1865位堿基為啟動子AATP，自5’端第1866-1880位堿基為限制性內切酶IppoI的識別位點。其中，增強子ApoE和Aer在序列中的位置可調換，上述限制性內切酶識別位點也可根據實際需要進行更換。
四、肝臟表達調控序列AlbEAATP的構建以質粒載體EalbPα1AT-luc(M.Gabriela Kramer，Miguel Barajas，NereaRazquin et al.In Vitro and in Vivo Comparative Study of ChimericLiver-Specific Promoters.MOLECULAR THERAPY Vol.7，No.3，March 2003)為模板，在引物PE和PD的引導下，PCR擴增AAT261-+45；以質粒載體EIIPα1AT-luc(M.Gabriela Kramer，Miguel Barajas，Nerea Razquin et al.In Vitro and in VivoComparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters.MOLECULAR THERAPY Vol.7，No.3，March 2003)為模板，在引物PK和PL的引導下，PCR擴增AlbE。將AAT261-+45插入到載體pGEM-T后，轉化大腸桿菌DH5α，經藍白斑篩選和PCR鑒定后進行測序，將序列正確的陽性克隆擴增后提質粒，命名為T-AAT45-261。將AlbE插入到載體pGEM-T后，轉化大腸桿菌DH5α，經藍白斑篩選和PCR鑒定后進行測序，將序列正確的陽性克隆擴增后提質粒，命名為T-AlbE。將T-AlbE經限制性內切酶SacI和KpnI雙酶切后回收目的片斷AlbE，將AlbE與經同樣酶酶切處理的載體T-AAT45-261連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經藍白斑篩選和PCR鑒定得到陽性克隆后提取質粒，命名為T-AlbEAAT。將T-AlbEAAT用限制性內切酶IppoI和BglII酶切后回收得到目的片段AlbEAAT。
實施例2、以PCI neo為出發載體構建的肝臟表達載體將實施例一中得到的肝臟表達調控序列AerApoEAATApoEAATP、AAT-1206-+45、和AlbEAAT分別與經限制性內切酶IppoI和BglII酶切后的載體PCI neo(購于Promega公司)相連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經PCR鑒定得到陽性克隆后提取質粒，得到肝臟表達載體，命名為PCI neo-AerApoEAAT，用上述同樣方法得到含有AerApoEAAT的肝臟表達載體PCI neo-ApoEAATP，含有AAT-1206-+45的肝臟表達載體PCI neo-AATP和含有AlbEAAT的肝臟表達載體PCI neo-AlbEAAT。
實施例3、以hAAT為報告基因驗證肝臟高效表達調控序列的表達水平一、含有基因hAAT的載體PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCIneoAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT和PCI neoAlbEAATP-hAAT的構建從人肝臟組織中提取RNA，以PN/PO為引物，反轉錄PCR擴增hAAT基因片段。將hAAT基因片段插入到載體pGEM-T后，轉化大腸桿菌DH5α，經藍白斑篩選和PCR鑒定后進行測序，將序列正確的陽性克隆擴增后提質粒，命名為T-hAAT。將T-hAAT經限制性內切酶EcoRI和SalI雙酶切后回收目的片斷hAAT，再將hAAT分別與經相同酶酶切處理的載體PCI neo、PCI neoApoEAATP、PCI neoAATP、PCI neoAerApoEAATP和PCI neoAlbEAATP連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，PCR鑒定得到陽性克隆后提取質粒，分別命名為PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT。
二、hAAT表達水平的驗證1、大量提取質粒PCI neo、PCI neo-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCIneoAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、EalbPα1AT-hAAT(M.Gabriela Kramer，Miguel Barajas，Nerea Razquin et al.In Vitro and inVivo Comparative Study of Chimeric Liver-Specific Promoters.MOLECULARTHERAPY Vol.7，No.3，March 2003)。
2、將40只昆明鼠分成8組(每組5只)，用水動力轉染法給每只昆明鼠尾靜脈注射25μg質粒，注射的溶液量(生理鹽水)相當于昆明鼠體重的10％，注射時間控制在五秒鐘以內，1-7組依次注射質粒PCI neo-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCIneo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、EalbPα1AT-hAAT、PCI neo，第8組為空白對照。
3、分別于注射后第1、4、11、27、54、87天尾靜脈采血，用ELISA法檢測血清中hAAT的濃度，檢測方法包括以下步驟1)取hAAT(購自SIGMA公司)2mg溶于2mL PBS中，再加入2mL弗氏完全佐劑，乳化后用肌肉注射法免疫日本大耳白兔，四周后再取1mg hAAT溶于1mL PBS中，加入1mL弗氏不完全佐劑乳化后對上述經初次免疫的大耳白兔肌肉注射加強免疫，兩周后再進行第2次加強免疫。第2次加強免疫后10天，耳緣靜脈采血，采用EIASA法測定血清中的抗體滴度，抗體滴度高于10-6后心臟穿刺取血，離心取上清。
2)將步驟1)采集的兔血清先用飽和硫酸銨沉淀法進行粗提，再經蛋白G柱(Promega公司)純化后得到高純度的抗-hAAT抗體，采用過碘酸鈉法將辣根酶(HRP)對抗-hAAT抗體進行標記。
3)用羊抗hAAT(5μg/mL，購自SIGMA公司)包被96孔板，4℃包被16小時后，用PBST洗板，拍干，每孔加入130μL含10％胎牛血清的PBST，37℃溫育1小時后拍干，每孔再加入100μL待檢測樣品及已知濃度的經梯度稀釋的hAAT標準品，37℃溫育40分鐘，用PBST洗板，拍干，每孔加入100μL經400倍稀釋的步驟2)中的HRP標記的抗hAAT抗體，37℃溫育40分鐘，用PBST洗板，拍干，顯色，在450nm波長下測其吸光度值，根據標準品的吸光度值計算出待檢樣品中hAAT的濃度。
結果如圖1A-圖1F所示，圖中1-7分別表示注射PCI neo-hAAT、PCI neoAATP-hAAT、PCI neo-ApoEAATP-hAAT、PCI neoAlbEAATP-hAAT、PCI neoAerApoEAATP-hAAT、EalbPα1AT-hAAT和PCI neo的組，8為空白對照。檢測結果表明，由AerApoEAATP調控的hAAT的表達水平明顯高于其它組，表達時間可持續2-3個月。
實施例三、以SEAP為報告基因驗證肝臟高效表達調控序列的表達水平。
一、含有基因SEAP的載體PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCIneoAerApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP的構建將質粒載體PTAL-SEAP(CLONTECH公司)用EcoRI和SalI酶切后，回收大小約為1.8kbp的SEAP片斷，將SEAP片斷分別與經過EcoRI和SalI雙酶切處理的載體PCI neoApoEAATP、PCI neoAATP、PCI neoAerApoEAATP和PCI neoAlbEAATP連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，經PCR鑒定陽性克隆后提質粒，分別命名為PCIneo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neoAerApoEAATP-SEAP和PCIneoAlbEAATP-SEAP。
二、SEAP表達水平的驗證1、大量提取質粒PTAL-SEAP、PCI neo、PCI neo-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCIneo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP和PCI neoAerApoEAATP-SEAP。用限制性內切酶BglII將質粒PCI neoAerApoEAATP-SEAP酶切消化成線狀，將線性化的質粒PCI neoAerApoEAATP-SEAP命名為BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP。
2、將45只昆明鼠分成9組(每組5只)，用水動力轉染法給每只昆明鼠尾靜脈注射25μg質粒，注射的溶液量(生理鹽水)相當于昆明鼠體重的10％，注射時間控制在五秒鐘以內，1-8組依次注射質粒PTAL-SEAP、PCI neo、PCI neo-SEAP、PCIneoAATP-SEAP、PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP、PCIneoAerApoEAATP-SEAP、BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP，第9組為空白對照。
3、分別于注射后第1、3、9、31、57天尾靜脈采血，用的Phospha-LightTMSystem試劑盒(A&B公司)測定血清中SEAP的濃度。
結果如圖2A-圖2E所示，圖中1-8分別表示注射PTAL-SEAP、PCI neo、PCIneo-SEAP、PCI neoAATP-SEAP、PCI neo-ApoEAATP-SEAP、PCI neoAlbEAATP-SEAP、PCI neoAerApoEAATP-SEAP、BglII-PCI neoAerApoEAATP-SEAP的組，9為空白對照。檢測結果表明，由AerApoEAATP調控的SEAP的表達水平明顯高于其它組，表達時間可持續2-3個月，而且將表達載體線性化后可提高報告基因在體內的表達水平。
序列表<160>2<210>1<211>1880<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>
<400>1agatctggct cagaggcaca caggagtttc tgggctcacc ctgccccctt ccaacccctc 60agttcccatc ctccagcagc tgtttgtgtg ctgcctctga agtccacact gaacaaactt 120cagcctactc atgtccctaa aatgggcaaa cattgcaagc agcaaacagc aaacacacag 180ccctccctgc ctgctgacct tggagctggg gcagaggtca gagacctctc tgggcccatg 240ccacctccaa catccactcg accccttgga atttcggtgg agaggagcag aggttgtcct 300ggcgtggttt aggtagtgtg agagggaagc ttacagcccc tagaaaataa cctgcgttac 360agcatccact cagtatccct tgagcatgag gtgacactac ttaacatagg gacgagatgg 420tactttgtgt ctcctgctct gtcagcaggg cactgtactt gctgatacca gggaatgttt 480gttcttaaat accatcattc cggacgtgtt tgccttggcc agttttccat gtacatgcag 540aaagaagttt ggactgatca atacagtcct ctgcctttaa agcaatagga aaaggccaac 600ttgtctacgt ttaggtacct gtgggtcact cgcctggtag agccccaagg tggaggcata 660aatgggactg gtgaatgaca gaaggggcaa aaatgcactc atccattcac tctgcaagta 720tctacggcac gtacgccagc tcccaagcag gtttgcgggt tgcacagcgg gcgatgcaat 780ctgatttagg cttttaaagg gattgcaatc aagtggggcc ccactagcct caaccctgta 840cctcccctcc cctccacccc cagcagtctc caaaggcctc caacaacccc agagtggggg 900ccatgtatcc aaagaaactc caagctgtat acggatcaca ctggttttcc aggagcaaaa 960acagaaacag gcctgaggct ggtcaaaatt gaacctcctc ctgctctgag cagcctgggg1020ggcagactaa gcagagggct gtgcagaccc acataaagag cctactgtgt gccaggcact1080tcacccgagg cacttcacaa gcatgcttgg gaatgaaact tccaactctt tgggatgcag1140
gtgaaacagt tcctggttca gagaggtgaa gcggcctgcc tgaggcagca cagctcttct1200ttacagatgt gcttccccac ctctaccctg tctcacggcc ccccatgcca gcctgacggt1260tgtgtctgcc tcagtcatgc tccatttttc catcgggacc atcaagaggg tgtttgtgtc1320taaggctgac tgggtaactt tggatgagcg gtctctccgc tctgagcctg tttcctcatc1380tgtcaaatgg gctctaacca ctctgatctc ccagggcggc agtaagtctt cagcatcaag1440cattttgggg tgactcagta aatggtagat cttgctacca gtggaacagc cactaaggat1500tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg1560ccaccccctc caccttggac acaggacgct gtggtttctg agccaggtac aatgactcct1620ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg1680ggcgactcag atcccagcca gtggacttag cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg1740accttggtta atattcacca gcagcctccc ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat1800acggacgagg acagggccct gtctcctcag cttcaggcac caccactgac ctgggacagt1860gaatcgctac cttaagagag1880<210>2<211>1880<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>
<400>2agatctacag cccctagaaa ataacctgcg ttacagcatc cactcagtat cccttgagca 60tgaggtgaca ctacttaaca tagggacgag atggtacttt gtgtctcctg ctctgtcagc 120agggcactgt acttgctgat accagggaat gtttgttctt aaataccatc attccggacg 180tgtttgcctt ggccagtttt ccatgtacat gcagaaagaa gtttggactg atcaatacag 240tcctctgcct ttaaagcaat aggaaaaggc caacttgtct acgtttaaag cttggctcag 300aggcacacag gagtttctgg gctcaccctg cccccttcca acccctcagt tcccatcctc 360cagcagctgt ttgtgtgctg cctctgaagt ccacactgaa caaacttcag cctactcatg 420tccctaaaat gggcaaacat tgcaagcagc aaacagcaaa cacacagccc tccctgcctg 480ctgaccttgg agctggggca gaggtcagag acctctctgg gcccatgcca cctccaacat 540
ccactcgacc ccttggaatt tcggtggaga ggagcagagg ttgtcctggc gtggtttagg 600tagtgtgaga gggggtacct gtgggtcact cgcctggtag agccccaagg tggaggcata 660aatgggactg gtgaatgaca gaaggggcaa aaatgcactc atccattcac tctgcaagta 720tctacggcac gtacgccagc tcccaagcag gtttgcgggt tgcacagcgg gcgatgcaat 780ctgatttagg cttttaaagg gattgcaatc aagtggggcc ccactagcct caaccctgta 840cctcccctcc cctccacccc cagcagtctc caaaggcctc caacaacccc agagtggggg 900ccatgtatcc aaagaaactc caagctgtat acggatcaca ctggttttcc aggagcaaaa 960acagaaacag gcctgaggct ggtcaaaatt gaacctcctc ctgctctgag cagcctgggg1020ggcagactaa gcagagggct gtgcagaccc acataaagag cctactgtgt gccaggcact1080tcacccgagg cacttcacaa gcatgcttgg gaatgaaact tccaactctt tgggatgcag1140gtgaaacagt tcctggttca gagaggtgaa gcggcctgcc tgaggcagca cagctcttct1200ttacagatgt gcttccccac ctctaccctg tctcacggcc ccccatgcca gcctgacggt1260tgtgtctgcc tcagtcatgc tccatttttc catcgggacc atcaagaggg tgtttgtgtc1320taaggctgac tgggtaactt tggatgagcg gtctctccgc tctgagcctg tttcctcatc1380tgtcaaatgg gctctaacca ctctgatctc ccagggcggc agtaagtctt cagcatcaag1440cattttgggg tgactcagta aatggtagat cttgctacca gtggaacagc cactaaggat1500tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg1560ccaccccctc caccttggac acaggacgct gtggtttctg agccaggtac aatgactcct1620ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg1680ggcgactcag atcccagcca gtggacttag cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg1740accttggtta atattcacca gcagcctccc ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat1800acggacgagg acagggccct gtctcctcag cttcaggcac caccactgac ctgggacagt1860gaatcgctac cttaagagag1880
權利要求
1.一種肝臟高效表達調控序列，是含有肝臟特異性啟動子AAT-1202-+45和增強子Aer及ApoE的表達調控序列。
2.根據權利要求1所述的肝臟高效表達調控序列，其特征在于所述增強子Aer和ApoE位于啟動子AAT-1202-+45的上游。
3.根據權利要求2所述的肝臟高效表達調控序列，其特征在于所述肝臟高效表達調控序列具有序列表中SEQ ID №1的DNA序列。
4.根據權利要求2所述的肝臟高效表達調控序列，其特征在于所述肝臟高效表達調控序列具有序列表中SEQ ID №2的DNA序列。
5.含有權利要求1所述肝臟高效表達調控序列的肝臟表達載體。
6.根據權利要求5所述的肝臟表達載體，其特征在于所述增強子Aer和ApoE在載體中位于啟動子AAT-1202-+45的上游。
7.根據權利要求5或6所述的肝臟表達載體，其特征在于用于構建所述肝臟表達載體的出發載體為PCI neo。
8.根據權利要求7所述的肝臟表達載體，其特征在于所述肝臟表達載體為PCIneoAerApoEAATP。
9.權利要求1或2所述的肝臟高效表達調控序列在表達外源基因中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種肝臟高效表達調控序列及其應用，其目的是提供一種肝臟高效表達調控序列及其在肝臟中表達外源基因中的應用。該序列是含有肝臟特異性啟動子AAT－1202－+45和增強子Aer及ApoE的表達調控序列。所述增強子Aer和ApoE在載體中位于啟動子AAT－1202－+45的上游。本發明所提供的肝臟表達調控序列可調控外源基因地高效表達，彌補了低水平轉錄活性不強的缺點。本發明具有較高的實際應用價值，在醫學領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N15/85GK1670216SQ20051005935
公開日2005年9月21日 申請日期2005年3月28日 優先權日2005年3月28日
發明者付秋霞, 賈帥爭, 王全立 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所