專利名稱：構建以甘露糖作為篩選標記的轉基因黃瓜的方法
技術領域：
本發明涉及植物生物技術領域中轉基因植物的構建方法，特別是涉及以甘露糖作為篩選標記的轉基因黃瓜的構建方法。
背景技術：
在植物遺傳轉化過程中，僅有少數細胞的基因組整合了外源DNA片段，絕大部分細胞仍未被轉化。因此，一個有效的轉化篩選標記系統對植物的遺傳轉化極為重要。現在通常采用的方法是將抗生素或除草劑抗性基因連同目的基因共同導入植物細胞，使非轉化細胞因缺乏抗性被殺死，而轉化細胞因獲得抗性得以生存，該種轉化篩選標記系統稱為負向選擇標記系統(Joersbo M，Okkels F T.A novel principle for theselection of transgenic plant cellsPositive selection.Plant Cell Rep，1996，16219-221.)。
利用負向選擇標記系統進行植物遺傳轉化選擇的方法經大量事實證明是行之有效的，但隨著轉基因植物商品化步伐的加快，盡管現在還沒有確鑿的科學證據表明抗生素以及除草劑抗性基因作為選擇標記基因用來轉化農作物具有危害性，但全世界針對其對人體及環境存在潛在危害的爭論從未停息過，并引起了媒體及公眾的廣泛關注，使得轉基因作物的市場化行為大為延緩。
研究表明，多種外植體都無法利用甘露糖以維持其生長(Malca I，Endo RM，LongMR.Mechanism of glucose counteraction of inhibition of root elongation bygalactose，mannose and glucosamine.Phytopathology，1967，57272-278)。將甘露糖用于植物細胞培養時，它會被植物細胞內源的己糖激酶轉化為6-磷酸甘露糖，6-磷酸甘露糖不能被進一步代謝利用而積累，導致細胞生長得到抑制(Sheu-Hwa C S，Lewis D H，Walker D A.Stimulation of photosynthetic starch formation bysequestration of cytoplasmic orthophosphate.New Phytol，1975，74383-392.)。
發明內容
本發明的目的是提供一種以甘露糖作為篩選標記的轉基因黃瓜的構建方法。
本發明所提供的以甘露糖為篩選標記的轉基因黃瓜的構建方法，是利用植物表達載體將6-磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因(manA)導入黃瓜的外植體，經在含甘露糖的培養基上篩選和分化，獲得轉基因植株。
所述6-磷酸甘露糖異構酶基因在Genbank中的登記號為M15380。
所述植物表達載體可為任意一種可在黃瓜中表達外源基因的植物表達載體，如pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1301等，其中，pCAMBIA1300為優選的植物雙元表達載體。
所述篩選和分化培養基中的甘露糖可為純的甘露糖或甘露糖與其它糖類的組合，所述甘露糖可為任一構型的甘露糖。
所述篩選和分化培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了甘露糖10g/L，BA1mg/L，ABA 1mg/L，蔗糖3％和瓊脂0.62％，pH5.8。
攜帶有6-磷酸甘露糖異構酶基因的植物表達載體可通過使用農桿菌介導法、基因槍法、電擊法、花粉管導入法或脂質體融合法等方法轉化黃瓜的外植體，優選為農桿菌介導法；所述農桿菌可為任意一種根癌農桿菌或發根農桿菌，優選為根癌農桿菌EHA105。
所述外植體可為黃瓜的子葉、子葉節、上胚軸或下胚軸，優選為子葉。
所述黃瓜的品種可以是多種多樣的，如津研四號、津研七號、津春三號或長春密刺等，優選為津研七號。
和傳統的遺傳轉化選擇方法相比，使用甘露糖選擇標記系統時，非轉化細胞處于饑餓狀態，而并非被殺死，所以選擇培養過程中較少出現壞死組織，更有利于轉基因組織的生長和再生。該選擇標記系統具有產物安全(編碼的酶已被廣泛應用于食品工業)、選擇劑價格低廉、選擇程序簡單，而且不影響轉化植物的代謝平衡，轉基因植株生長旺盛，篩選效果顯著等優點，在轉基因植物研究及市場化過程中具有潛在的、廣泛的應用前景，有望發展成為植物轉化中主導選擇標記系統。此外，本發明為利用黃瓜作為植物生物反應器表達口服疫苗等提供了良好的技術平臺。
圖1為載體pMAN1300 T-DNA區的示意2A為經農桿菌感染的葉片在含甘露糖的分化培養基上進行轉基因植株的篩選和分化圖2B為分化出的轉基因黃瓜小苗圖2C為在生根培養基上生長的轉基因植株圖3為轉基因黃瓜的PCR檢測結果圖4為轉基因黃瓜的Southern雜交檢測結果圖5為轉基因黃瓜葉片中PMI活性的檢測結果
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，所用引物由上海博亞公司購買和合成。
實施例1、帶篩選標記的轉基因黃瓜的構建一、磷酸甘露糖異構酶基因manA的克隆磷酸甘露糖異構酶基因manA的克隆參照文獻(Paola Lucca，Xudong Ye & IngoPotrykus。Effective selection and regeneration of transgenic rice plants withmannose as selective agent。Molecular Breeding，2001(7)43-49)進行。
二、含有manA的植物雙元表達載體pMAN1300的構建將步驟一克隆的基因manA替代質粒載體pCAMBIA1300上的基因hpt得到一雙元表達載體，命名為pMAN1300，其T-DNA區的示意圖如圖1所示(LBT-DNA區左邊界；RBT-DNA區右邊界；35S花椰菜花葉病毒35S啟動子；NOS胭脂堿合成酶終止序列；manA磷酸甘露糖異構酶基因)。
三、轉基因黃瓜的獲得1、植物材料的消毒及預培養將黃瓜品種津研七號的種子用70％的酒精浸泡15-30秒，用0.1％的升汞消毒5分鐘后用滅菌水沖洗3-5次，再用無菌濾紙吸干種子表面的水珠。將經消毒的種子轉到1/2MS培養基上，再置于28℃的恒溫箱中催芽，出芽后在25℃，光照條件1600lux下進行培養，約4天后，將無菌苗在無菌條件下剪下長度為4-6mm的下胚軸，子葉頂端及其邊緣剪成0.4cm2的小塊作為外植體，將它們接種于MS基本培養基上進行預培養(注將子葉的葉背接觸培養基)。
2、轉基因黃瓜的篩選及培育將步驟二構建的載體pMAN1300用凍融法轉化農桿菌EHA105，將轉化菌株接種子YM固體培養基(含卡那霉素50mg/L)上篩選重組子，用金屬匙收集在抗性平板上長出的農桿菌菌體，將其懸浮于MS液體培養基中，調整至菌液的OD值約為0.6，加入100uL 100mM的乙酰丁香酮(AS)和100mL MS液體培養基，靜置備用。將步驟1中預培養1-2天的外植體投入上述轉化有載體pMAN1300的農桿菌菌液中，不時搖動，使外植體與農桿菌充分接觸，侵染20-30分鐘。再取出外植體將其置于無菌濾紙上吸去多余的菌液，風干，轉入表面鋪有一層濾紙的不含甘露糖的分化培養基上(以未經重組農桿菌浸染的外植體為對照)，暗處共培養3-4天后，將其轉移至含甘露糖10g/L和頭孢霉素500mg/L的分化培養基培養基上進行分化培養(圖2A)，光照條件為16小時/天。結果，未經農桿菌浸染的外植體在含甘露糖的分化培養基上生長約2周后變黃，葉片死亡，傷口處無愈傷組織長出。經農桿菌浸染的外植體，2-3周后葉緣出現綠色芽點，5-6周后分化出小植株(圖2B)，當分化植株生長至2-3cm高時，將其轉移至1/2MS生根培養基上生根(圖2C)。
3、轉基因黃瓜的分子檢測取步驟2獲得的黃瓜再生植株的幼嫩葉片0.2g，用CTAB法提取葉片的基因組DNA并以此為模板，引物序列為15’-GGTCCACCATGTGAAGGCA-3’和引物25’-CCATCGGAATACTTGCGGC-3’，PCR擴增manA，PCR反應條件為先94℃ 4min；然后94℃ 30sec，再55℃ 40sec，72℃ 1min，共35個循環；最后72℃ 10min。反應結束后，對PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖3所示，擴增出約550bp DNA片段的為轉基因植株。選取PCR檢測為陽性的轉基因植株，大量提取植物的基因組DNA，以非轉基因植株DNA為陰性對照，以質粒載體pMAN1300 DNA為陽性對照。分別用限制性內切酶XhoI和HindIII酶切植物基因組DNA，再以地高辛標記的manA為探針進行Southern blot分析，結果如圖4所示(1-9為轉基因再生植株，10為質粒載體pMAN1300，11為非轉基因黃瓜對照)，圖4中A為用XhoI酶切，用manA PCR擴增產物作探針進行雜交的結果，檢測所插入的外源基因的完整性，檢測結果表明目的基因已完整整合進黃瓜的基因組中；圖4中B為用HindIII酶切，manA PCR擴增產物作探針進行的雜交的結果，檢測所插入的外源基因的拷貝數，檢測結果表明不同株系中整合位點以及目的基因拷貝數存在較大差異，一定程度上影響了manA在黃瓜中的表達水平。
4、轉基因植株的PMI活性檢測選取步驟3中經PCR檢測為陽性的轉基因植株及非轉基因對照植株的葉片各250mg，加入250mL 50mM的Tris-HCl(pH7.5)充分研磨，14000rpm離心20分鐘，取上清液50uL加入100uL 50mM的Tris-HCl(pH7.5)，然后與100uL顯色底物(包括25uL磷酸煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(10mM)，25uL磷酸葡糖異構酶(10U/mL)，12.5uL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶(10U/mL)，5uL 6-磷酸甘露糖(50mM)和32.5uL Tris-HCl(50mM，pH7.5))混和反應，用分光光度計在340nm波長下檢測其OD值，檢測結果如圖5所示，表明除有一株轉基因植株未檢測到PMI活性外，其余轉基因黃瓜葉片中均可檢測到PMI活性，但每個株系PMI活性并不相同，分析是受到染色體插入位點、甲基化以及拷貝數等因素的影響。
權利要求
1.以甘露糖作為篩選標記的轉基因黃瓜的構建方法，是利用植物表達載體將6-磷酸甘露糖異構酶基因導入黃瓜的外植體，經在含甘露糖的培養基上篩選和分化，得到轉基因植株。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于所述植物雙元表達載體為pCAMBIA1300、pBI121或pCAMBIA1301。
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于所述植物表達載體為pCAMBIA1300。
4.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于所述篩選和分化培養基是在MS基本培養基的基礎上添加了甘露糖10g/L，BA 1mg/L，ABA 1mg/L，蔗糖3％和瓊脂0.62％，pH5.8。
5.根據權利要求1或2或4所述的構建方法，其特征在于所述攜帶有6-磷酸甘露糖異構酶基因的植物表達載體轉化黃瓜外植體的方法為農桿菌介導法、基因槍法、電擊法、花粉管導入法或脂質體融合法。
6.根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于所述攜帶有6-磷酸甘露糖異構酶基因的植物表達載體轉化黃瓜外植體的方法為農桿菌介導法。
7.根據權利要求6所述的構建方法，其特征在于所述農桿菌為根癌農桿菌或發根農桿菌。
8.根據權利要求7所述的構建方法，其特征在于所述農桿菌為為根癌農桿菌EHA105。
9.根據權利要求1或2或4所述的構建方法，其特征在于所述外植體為黃瓜的子葉、子葉節、上胚軸或下胚軸。
10.根據權利要求9所述的構建方法，其特征在于所述外植體為子葉。
全文摘要
本發明公開了一種以甘露糖作為篩選標記的轉基因黃瓜的構建方法。該構建方法是利用植物表達載體將6－磷酸甘露糖異構酶基因導入黃瓜的外植體，經在含甘露糖的培養基上篩選和分化，得到轉基因植株。使用甘露糖選擇標記系統時，非轉化細胞處于饑餓狀態，而并非被殺死，所以選擇培養過程中較少出現壞死組織，更有利于轉基因組織的生長和再生。該選擇標記系統具有產物安全、選擇劑價格低廉、選擇程序簡單，而且不影響轉化植物的代謝平衡，轉基因植株生長旺盛，篩選效果顯著等優點，在轉基因植物研究及市場化過程中具有潛在的、廣泛的應用前景，有望發展成為植物轉化中主導選擇標記系統。本發明為利用黃瓜作為植物生物反應器表達口服疫苗等提供了良好的技術平臺。
文檔編號C12N5/10GK1657630SQ20051005930
公開日2005年8月24日 申請日期2005年3月25日 優先權日2005年3月25日
發明者何正權, 段真珍, 梁薇, 陳凡, 戴建武, 陳發菊, 樂超銀, 姚偉, 梁宏偉 申請人:三峽大學, 何正權