專利名稱：一種大量提取藻藍蛋白的簡便方法
技術領域：
本發明涉及生物提取藻藍蛋白的方法，更具體地，本發明涉及一種用微生物的培養液從藍藻、藍綠藻中提取藻藍蛋白的方法。
背景技術：
藻藍蛋白具有很高的開發利用價值1。首先藻藍蛋白是紅藻和藍藻特有的光合色素，色澤明亮鮮艷，是食品、高級眼影、唇膏的首選純天然色素，可作為純天然的色素，用于食品、化妝品和染料等工業2。再則可加工成保健食品和藥品3。研究表明，藻藍蛋白能顯著減輕并逐漸消除輻射、化療對造血功能的損傷4，還能提高淋巴細胞活性，積極清除細胞中氧自由基5，促進傷口愈合，動物實驗證明能有效抑制癌細胞生長6，而且還可作為熒光試劑。高純度的藻藍蛋白帶有很強的熒光，制成的純天然熒光試劑，廣泛應用于醫學和生物工程等領域7。
藻藍蛋白的提取分為蛋白溶出和蛋白提純兩個過程。藍藻、藍綠藻藻細胞外層具鞘，胞壁為革蘭氏陰性菌典型構造，由四層組成，每層厚約10nm，要提取出藍藻、藍綠藻中的藻藍蛋白，首先要破碎藻細胞的鞘和細胞壁、細胞膜，使之以水溶狀態存在于提取液中，再采用適宜的方法將其進一步純化，而且還要求全過程都能保持藻藍蛋白的活性。目前提取方法大致可以總結為機械搗碎、反復凍融、化學處理、超聲破碎的蛋白質析出方法，然后進一步采取硫酸銨沉淀、等電點沉淀、柱層析和凝膠層析法等進行純化處理。往往上述方法都是聯合運用，以求達到最好效果。
我國目前經濟微藻，主要是藍藻和藍綠藻年生產能力超過1000噸，但大多是微藻初級產品。現在市場上已經有的10多種微藻藻片和膠囊，根據不同的功能通過衛生部批準為保健品，但還沒有以微藻深加工產品藻藍蛋白為主的功能性保健品，藥品的研究開發幾乎還是空白。這主要是由于藍藻和藍綠藻中藻藍蛋白的提取還處于實驗室研究階段，沒有適合于工業化生產的好的工藝方法，使藻藍蛋白的商品價格昂貴而在應用上受到限制8。
目前最常運用的藍藻、藍綠藻細胞破碎提取方法如下91011取新鮮螺旋藻或者藻粉，用0.01 M K-磷酸鹽緩沖液，pH 6.7，0.15 M NaCl的提取緩沖液漂洗干凈后，重新懸浮于此緩沖液中，在-15℃狀態下凍結，然后解凍并升溫到30℃，保持一小時，并持續攪拌，之后置于4℃，過夜，次日18000×g超速離心30分鐘，取上清，加入水相萃取液，混合后攪拌再次置于4℃過夜，次日再于8000×g高速離心30分鐘后棄沉淀，取上清，加入水萃取液，重復上述離心步驟5次，獲得的最后上浮物飽和于40％硫酸銨溶液中，再次離心，沉淀溶解于提取緩沖液中。此時即獲得了食品純和藥品純的藻藍蛋白。如要獲得高純度的藻藍蛋白，還需要凝膠層析、柱層析等純化步驟，得到試劑純藻藍蛋白A620/A280＞4.0。
發明內容
針對上述研究背景，本發明人經過對藻藍蛋白提取方法的深入研究，非常意外地發現某些種類的微生物的培養液可以使新鮮的藍藻、藍綠藻或其制成的藻粉自然破壁，將藻藍蛋白釋放到培養液中，進一步用常規方法純化可以獲得高純度的藻藍蛋白。
因此，本發明的一個目的是提供一種大量提取藻藍蛋白的方法，其特征在于將固氮菌中克氏桿菌屬和腸細菌屬固氮菌的培養液與螺旋藻或藻粉混合。在該過程中，螺旋藻或藻粉被快速降解，藻藍蛋白被釋放到培養液中，用常規方法進一步純化可以獲得高純度的藻藍蛋白。
在本發明的一個實施方案中，所述固氮菌是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，日勾維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)，或產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，特別優選肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，日勾維腸桿菌CGMCCNo.0510，和產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)，其中日勾維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)是日勾維腸桿菌57-7(CGMCC No.0510，其已在中國專利號ZL00133626.6(第一發明人李永興)中公布授權，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)來自于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)由中科院植物所保存。
在本發明的另一個實施方案中，將上述釋放到培養液中的藻藍蛋白進一步用硫酸銨、凝膠層析、羥基磷灰石層析或Sephadex G-100柱層析純化。
因此，本發明提供了一種生物提取藻藍蛋白的方法。與傳統的藻藍蛋白提取方法相比，本發明的方法具有成本低廉、操作簡便等優點，并且提取的蛋白純度高，而且不破壞蛋白的生物活性，是一種非常適合大規模生產藻藍蛋白的方法。本發明避開了傳統的物理化學法和溶菌酶法的苛刻條件和繁重操作，利用生物方法自然破壁一步即可提取較純的藻藍蛋白，大大簡化了提取步驟，使藻藍蛋白工業化生產成為可能。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步的詳細描述，但不應理解為是對本發明進行限定。
圖1.按照本發明方法利用日勾維腸桿菌培養液從螺旋藻中直接提取的提取液的吸收光譜，620nm處的吸收峰是藻藍蛋白的吸收峰；圖2.按照本發明方法利用日勾維腸桿菌培養液從螺旋藻中直接提取的提取液的熒光光譜(室溫)，最大發射峰位于650nm(580nm激發)；圖3.利用日勾維腸桿菌培養液最終純化的藻藍蛋白的吸收光譜，620nm處的吸收峰是藻藍蛋白的吸收峰；圖4.利用日勾維腸桿菌培養液最終純化的藻藍蛋白的熒光光譜(室溫)，最大發射峰位于650nm(580nm激發)；圖5.利用日勾維腸桿菌培養液最終純化的藻藍蛋白的SDS-PAGE電泳圖(M，分子量標準；cpc藻藍蛋白)。
具體實施例方式
實施例1 利用細菌培養液提取鮮藻的藻藍蛋白A)螺旋藻培養將螺旋藻接種于Zarrouk培養基12中，該培養基包括(g/l)NaHCO316.8，NaNO32.5，K2HPO40.5，K2SO41.0，NaCl 1.0，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.04，FeSO47H2O 0.01，EDTA 0.08以及微量元素。130rpm/min振蕩培養，30℃恒溫，100μmol/m2/s連續光照，培養到藻液的OD值A560達到1.2左右，用0.45μm孔徑大小的濾網過濾獲得新鮮藻泥，無需清洗而用于以下步驟。
B)魚腥藻、集胞藻培養將魚腥藻sp.595、集胞藍藻PCC6803(藻種引自于中科院水生生物所)分別接種于BG-11培養基，成分見文獻13中，(g/l)NaNO3，1.5；K2HPO4·3H2O，0.04；MgSO4·7H2O，0.075；CaCl2·2H2O，0.036；檸檬酸0.006；檸檬酸鐵0.006；Na2EDTA 0.001；Na2CO3，0.02；1ml微量元素(g/l)，包括H3BO3，2.86；MnCl2·4H2O，1.81；ZnSO4·7H2O，0.222；Na2MoO4·2H2O，0.39；CuSO4·5H2O，0.079；Co(NO3)2·6H2O，0.0494，調節pH＝7.4。130rpm/min振蕩培養，30℃恒溫，100μmol/m2/s連續光照培養，培養至對數生長后期，用濾網過濾獲得新鮮藻泥，無需清洗。
C)微生物的培養將肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC1.1734)，日勾維腸桿菌CGMCC No.0510，和產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)(IBCAS-ZY)分別接種于自配簡化培養基中，該簡化培養基包括(g/l)蔗糖10，K2HPO410，KH2PO43，MgSO40.3，NH4Cl 0.4，CaCl20.02以及常規微量元素，調節PH值到8.0，130rpm/min振蕩培養，30℃恒溫，培養15小時至OD600nm值為2.000左右，自然沉淀后，傾倒出上清培養液。
D)藻藍蛋白吸收光譜的測定方法吸收光譜使用SHIMSDZU UV-2550紫外可見分光光度計于室溫下測定，掃描速率為300nm/min，狹縫寬度為2nm，采用光徑為1cm的樣品池。620nm處的強吸收峰為藻藍蛋白的特征峰。
E)藻藍蛋白熒光光譜的測定方法室溫穩態熒光光譜用HITACHI F-4500熒光分光光度計測量，激發、發射光狹峰為5nm，掃描速率是120nm/min，時間常數為2s，光電倍增管增益為NORMAL。位于650nm(580nm激發)處的最大熒光發射峰是藻藍蛋白的特征峰。
每一步提取純化步驟之后，均取其澄清藻藍蛋白液測定其室溫熒光、吸收光譜。
F)藻藍蛋白的純度檢測方法使用SUNSUNG UV8500 II紫外可見分光光度計測定不同波長處的紫外和可見光吸收值，即分別在280nm、615nm、620nm、652nm處的吸光值，A620/A280的比值代表藻藍蛋白的純度食品級A620/A280＞0.7，藥品級A620/A280＞2.0，試劑級A620/A280＞4.0。A為吸收值。藻藍蛋白的濃度用如下公式計算14PC(mg/ml)＝(A615-0.474(A652))/5.34G)藻藍蛋白的SDS-PAGE檢測方法取50μl提純后的藻藍蛋白，加入等體積的增溶液(含5％SDS、2％巰基乙醇和10％甘油的50mM Tris溶液，pH＝6.8)，混勻后靜置30分鐘，沸水煮5分鐘，10000g離心5分鐘，取上清上樣。電泳使用硼酸緩沖體系，濃縮膠、分離膠濃度分別為6％(pH＝6.1)和13.5％(pH＝9.18)。電泳儀為DYCZ-24D型電泳儀(北京市六一儀器廠)。標準蛋白為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳低分子量標準蛋白(購自上海西巴斯生物技術開發公司)。
H)利用細菌培養液提取鮮藻的藻藍蛋白以下以日勾維腸桿菌CGMCC No.0510為例舉例說明本發明的藻藍蛋白提取方法。
將上述各種菌的上清液分別沖洗藻泥至容器中，并加至菌液和藻泥大約為2∶1的體積比，密封(只為防止水分蒸發，不必很嚴格)，靜置，最好避光，24小時后，藻藍蛋白析出，細胞壁、細胞膜等非水溶性蛋白沉淀于容器底部，上部即為清亮鮮艷的藍色藻藍蛋白粗提物，此時如表1所示，純度(A620/280)達到0.9。吸收光譜和熒光發射光譜分別如圖1和圖2所示，分別顯示620nm處的藻藍蛋白特征吸收峰和650nm(580nm激發)處的藻藍蛋白最大熒光發射峰。附圖所示為用日勾維腸桿菌菌液提取螺旋藻鮮藻泥的藻藍蛋白的吸收光譜和熒光發射光譜，用上述提到的菌作用于藻后，只是在蛋白析出時間和蛋白析出率上稍有差異，但每一步驟所得樣品的光譜特性均是與藻藍蛋白相同的。所得粗提物用HITACHI 20PR-520離心機5000g離心后，取上清，此時藻藍蛋白的純度(A620/280)可達到1.3-1.5，遠高于食品級純度。
之后用60％飽和度的硫酸銨沉淀，余后流程與目前通行方法無太大差別，參照胡一兵15等的方法流程將上清液通過羥基磷灰石層析和Sephadex G-100柱層析，最后可得到純度4.8-5.2的試劑純藻藍蛋白，其吸收光譜和熒光發射光譜分別如圖3和圖4所示。與圖1和圖2相同，分別顯示620nm處的藻藍蛋白特征吸收峰和650nm(580nm激發)處的藻藍蛋白最大熒光發射峰，但是峰形更明顯，表明純度更高。
為了檢測最終純化的藻藍蛋白的純度，如上使用SDS-PAGE方法檢測所得藻藍蛋白已經達到電泳純。結果如圖5所示，在SDS-PAGE電泳圖譜中與標準蛋白相比，顯示了藻藍蛋白的亞單位結構，兩條帶分別是藻藍蛋白的α亞基和β亞基，與藻藍蛋白結構相符合。以上利用光譜特性和電泳結果證明用本發明方法提取的上清的藍色液體含有高純度的藻藍蛋白。
實施例2 利用細菌培養液提取螺旋藻藻粉中的藻藍蛋白以與實施例1中相同的方法進行藻藍蛋白的提取。不同之處在于，用藻粉代替鮮藻。具體步驟如下稱取云南產香峰牌(北京陽光雨虹峰產品技術開發公司)100％藻粉500g置于容器中，加入實施例1中培養的各種菌液5000ml混合，靜置于室溫25℃左右，半小時后，藻藍蛋白析出，上清液清亮湛藍，傾倒出上清。余下步驟與實施例1相同，得出類似的結果。需要說明的是，利用藻粉獲得的藻藍蛋白粗提液的純度沒有利用鮮藻泥的高，但藻藍蛋白析出時間藻粉成倍加快，分析可能是藻粉在制備過程中由于處理流程使得螺旋藻的胞壁組構發生變化，導致藻藍蛋白更易析出。但由于藻粉制備過程中，藻藍蛋白因為高溫干燥等原因，導致藻藍蛋白部分變性，因此藻藍蛋白的純度和濃度都受影響。因此，用鮮藻提取藻藍蛋白是最佳選擇。
實施例3 藻藍蛋白的不同粗提取方法的對比為了比較本發明的方法和常規的藻藍蛋白的提取法，在對照條件下按照文獻中記載的各種藻藍蛋白提取方法對鮮藻泥和/或藻粉進行提取，結果如表1所示。
表1 用不同方法粗提鮮藻泥(螺旋藻)中藻藍蛋白的對照圖提取方法 藻藍蛋白濃度 藻藍蛋白純度 規模和設備(μg/ml) (A620/A280)4℃超聲破碎 300±120.30 設備要求嚴格，每次量小溫度難控制室溫25℃壓 369±150.40 特殊設備，處軋破碎 理量小，耗力室溫0℃0.5cm 800±100.80 設備溫控難，玻璃珠機械破 時間長，耗能碎-20℃冰凍30℃950±120.66 耗時耗能融化2mg溶菌酶/g 280±100.37 耗時，成本高，濕重 得率低本發明的方法 1205±10 0.90 無溫度和設備(鮮藻泥加入限制，省力省菌液) 能，規模不受限制本專利發明方600±15 0.56同上法(藻粉加入菌液)從表1中可以看出，與各種傳統藻藍蛋白提取方法相比，本發明的微生物培養液提取方法提取的藻藍蛋白不僅產率高，而且提取的藻藍蛋白的純度也優于其他各種方法。本發明的方法不僅具有成本低廉、操作簡便等優點，并且提取的蛋白純度高，而且不破壞蛋白的生物活性，是一種非常適合于規模化生產藻藍蛋白的方法。由于本發明避開了傳統的物理化學法和溶菌酶法的苛刻條件和繁重操作，利用生物方法自然破壁一步即可提取較純的藻藍蛋白，大大簡化了提取步驟，因而使藻藍蛋白工業化生產成為可能。
實施例4 不同固氮菌提取藻藍蛋白的對比為了比較本發明中不同固氮菌提取藻藍蛋白的優劣，在對照條件下按照實施例1中的方法對螺旋藻藻粉云南產香峰牌(北京陽光雨虹峰產品技術開發公司)100％藻粉500g進行提取，菌液均培養15小時，OD600為2，結果如表2所示。
表2 不同細菌提取藻粉中藻藍蛋白的對比圖日勾維腸桿菌 肺炎克雷伯氏菌 產酸克雷伯氏菌破碎時間(分) 30±8 30±540±5粗提液藻藍蛋白 0.50±0.20 0.60±0.15 0.55±0.15純度(A620/A280)粗提液藻藍蛋白 1300±10 1350±10 1300±15濃度(μg/ml)從表2可以看出，分別使用日勾維腸桿菌CGMCC No.0510，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，和產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)進行實施例1中的實驗可以容易地得出類似的結果，都可以在很短時間破碎藻細胞，釋放出藻藍蛋白。藻藍蛋白純度和總藻藍蛋白濃度都很理想。三種菌株都是不錯的選擇。其中肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IMCAS1.1734(＝CGCMCC 1.1734)略有優勢，說明這些菌屬都適用于本發明。
實施例5 按照本發明的方法提取各種藍藻、藍綠藻中的藻藍蛋白為了比較本發明中固氮菌液是否能很好適用于其他藍藻、藍綠藻的藻藍蛋白提取，在對照條件下按照實施例1中的方法，樣品為螺旋藻、魚腥藻、集胞藻的鮮藻泥，濕重為200g，菌液用肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，培養15小時，OD600為2，結果如表3所示。
表3 按照本發明的方法提取各種藍藻、藍綠藻中的藻藍蛋白螺旋藻魚腥藻集胞藻蛋白析出后顯微未見藻絲，未見未見藻絲和任何未見任何完整細鏡下觀察 任何完整細胞，完整細胞，細胞胞，破碎效果很破碎效果很好 破碎效果很好 好藻藍蛋白析出時121518間(小時)粗提液藻藍蛋白0.90 0.70 0.68純度(A620/A280)鹽析、層析后藻5.12 4.83 4.15藍蛋白純度(A620/A280)粗提液藻藍蛋白1350 650 620濃度(μg/ml)從表3可以看出，螺旋藻、魚腥藻、集胞藻中的藻藍蛋白均可以用本發明的方法簡單提取出來，由于螺旋藻中藻膽蛋白含量高達鮮重的15-20％，且不含藻紅蛋白，因此純度和總蛋白提取都處于明顯優勢。目前國內最多養殖的也是螺旋藻，因此原材料供應充足，很適宜于提取藻藍蛋白。本發明同樣適用于其他藍藻，其中集胞藻6803是藍藻的模式植物，也能在菌液中很快破壁，析出蛋白。但也可以看出，由于魚腥藻、集胞藻的本身蛋白含量不高，所以藻藍蛋白提取量不夠高，并非因為破壁不完全，而是由于其品系的緣故。所用顯微鏡是CARL ZEISS JENA，400×。
實施例6 不同藻和不同菌的反應結果對照為了充分了解不同材料之間相互反應是否有特異性差別，設計了如下試驗，將不同藻和不同菌分別作用。在對照條件下按照實施例1中的方法，樣品為螺旋藻、魚腥藻、集胞藻的鮮藻泥，濕重為100g，菌液用以上的肺炎克雷伯氏菌、日勾維腸桿菌、產酸克雷伯氏菌，培養15小時，OD600為2，結果如表4所示。
表4 不同菌與不同鮮藻泥的作用對照圖螺旋藻魚腥藻 集胞藻日勾維腸桿菌13小時破碎，粗17小時破碎，粗18小時破碎，提液A620/A280＝ 提液A620/A280＝粗提液0.9，粗提液蛋白 0.7，粗提液蛋白 A620/A280＝0.68，粗濃度(μg/ml)＝濃度(μg/ml)＝700 提液蛋白濃度1300 (μg/ml)＝690肺炎克雷伯氏菌 12小時破碎，粗15小時破碎，粗 18小時破碎，提液A620/A280＝ 提液A620/A280＝粗提液0.9，粗提液藻藍 0.7，粗提液藻藍 A620/A280＝0.68，粗蛋白濃度 蛋白濃度提液藻藍蛋白濃(μg/ml)＝1350(μg/ml)＝650 度(μg/ml)＝630產酸克雷伯氏菌 12小時破碎，粗16小時破碎，粗 17小時破碎，提液A620/A280＝ 提液A620/A280＝粗提液0.9，粗提液藻藍 0.7，粗提液藻藍 A620/A280＝0.68，粗蛋白濃度 蛋白濃度提液藻藍蛋白濃(μg/ml)＝1300(μg/ml)＝670 度(μg/ml)＝650從表4可以看出，以上各種螺旋藻、魚腥藻、集胞藻與肺炎克雷伯氏菌、日勾維腸桿菌、產酸克雷伯氏菌兩兩相互交叉，沒有顯著性差異，作用基本相同，純度、濃度和時間主要取決于藻本身。
應當理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，但改動或修改的等價形式同樣落在本申請權利要求書所限定的范圍內。
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權利要求
1.一種提取藻藍蛋白的方法，其特征在于將特定固氮菌的培養液與藍藻、藍綠藻的藻泥或藻粉混合。
2.按照權利要求1的方法，其中所述固氮菌是日勾維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，或產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)。
3.按照權利要求1或2的方法，其中所述固氮菌是日勾維腸桿菌(Enterobacter gergoviae)CGMCC No.0510，或肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)IMCAS 1.1734(＝CGCMCC 1.1734)，和產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)(IBCAS-ZY)。
4.按照權利要求1至3中任何一項的方法，其另外包含將藻藍蛋白粗提物進一步用硫酸銨、凝膠層析、羥基磷灰石層析或Sephadex G-200柱層析純化的步驟。
全文摘要
本發明涉及生物提取藻藍蛋白的方法，更具體地，本發明涉及一種用微生物的培養液從藍藻、藍綠藻中提取藻藍蛋白的方法。與傳統的藻藍蛋白提取方法相比，本發明的方法具有成本低廉、操作簡便，處理量大等優點，并且提取的蛋白純度高，而且不破壞蛋白的生物活性，是一種非常適合于規模化生產藻藍蛋白的方法。
文檔編號C12P21/00GK1687440SQ200510059188
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月24日 優先權日2005年3月24日
發明者朱毅, 李永興, 王可玢, 白克智, 匡廷云 申請人:中國科學院植物研究所