一種酸性海藻糖酶及其制備方法

專利名稱：一種酸性海藻糖酶及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種酸性海藻糖酶，特別是一種蟲生真菌酸性海藻糖酶及其制備方法。
背景技術：
已知，海藻糖(α-D-葡萄糖苷(1，1)-α-D-葡萄糖苷)是非還原性二糖，是昆蟲血淋巴中主要血糖，其含量高達20～100mM，占血糖總量的90％以上，這些昆蟲包括東亞飛蝗(Locustamigratoria)(Elbein，A.D；1974)。海藻糖在昆蟲生命活動中具有重要的生理作用，可概括為以下四點(1)作為昆蟲體內的能量儲存，(2)作為抗凍保護劑避免在低溫下昆蟲血液凝固，(3)作為蛋白穩定劑防止在熱應急等情況下血淋巴蛋白變性，(4)作為采食反饋調控因子調節昆蟲取食。血淋巴中海藻糖的耗竭可能會對昆蟲起著致死的作用。
金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)是一種重要的蟲生真菌，廣泛運用于農業害蟲的生物防治。在蟲生真菌侵染穿透體壁進入昆蟲血腔直至昆蟲死亡以前，昆蟲血淋巴中豐富的海藻糖構成了真菌潛在的重要營養源。然而，對許多真菌如金龜子綠僵菌來說，海藻糖是非透過性底物，必須在相應胞外酸性海藻糖酶存在的條件下被水解成葡萄糖才能為真菌所利用。我們的研究顯示東亞飛蝗感染綠僵菌后，血液中海藻糖含量降低；此外，同工酶分析顯示血淋巴中出現較強的酸性海藻糖酶活性，這預示著酸性海藻糖酶在蟲生真菌侵入昆蟲血淋巴后，在與寄主競爭營養物質并使昆蟲致病過程中起著重要的作用。然而對于蟲生真菌酸性海藻糖酶，國內外的相關研究未見報道。分離純化海藻糖酶，研究其生化特性，這對于進一步研究其對真菌在昆蟲致病機理中的作用，對提高蟲生真菌殺蟲劑的致病效率，有著重要的理論意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種蟲生真菌酸性海藻糖酶。
本發明的另一目的在于提供上述酶的制備方法。
本發明的目的是這樣實現的一種酸性海藻糖酶，它能特異地降解海藻糖為葡萄糖，并具有如下的物理化學特性(1)作用特異性降解海藻糖為葡萄糖；
(2)分子量在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳上約為170kDa；(3)等電點在等電聚焦凝膠電泳(IEF)等電點電泳上約為4.7；(4)最適溫度和最佳pH海藻糖酶為該酶蛋白的專一性底物，其最適反應溫度為30±0.2℃，最佳pH為5.5±0.2；(5)熱穩定性此酶蛋白在40℃溫育240min對酶活性沒有影響，當孵育溫度為50℃時，隨著孵育時間延長酶活性線性下降，當溫度超過60℃時，酶活性迅速喪失；因此在溫度低于40℃條件下該酶蛋白是穩定的；(6)抑制劑Trehazolin是此酶蛋白的專一性抑制劑，其IC50為1.3×10-8M；(7)酶動力學特性此酶蛋白的米氏常數Km為2.3mM，最大酶促反應速度Vmax為0.412mmol min-1mg-1酶蛋白；其中所述酶是從保藏號為CGMCC No.0877的金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)CQM a102株中提取的。
本發明的另一目的，上述酸性海藻糖酶是這樣制得的首先活化上述金龜子綠僵菌菌株CQMA102孢子，并在營養培養基中誘導培養能產生所述酶的微生物以形成所述的酶，并加以純化。
為了提高靈敏度及特異性，在上述分離純化過程中，本發明根據粗酶液酸性海藻糖酶同工酶檢測，確定純化目的蛋白的等電點；以酶活檢測得到的酶活為指示對天然表達的金龜子綠僵菌酸性海藻糖酶進行分離純化。
上述金龜子綠僵菌菌株CQMA102孢子活化所用培養基由10g/l葡萄糖，2.5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，20g/l瓊脂組成，其pH值調至6.0；所述的誘導培養采用的碳源是可溶性淀粉，可有效的誘導海藻糖同工酶產生，采用的氮源是硫酸銨，可有效減少培養液中蛋白種類和含量，避免外源蛋白對純化的不利影響，同時減少了蛋白酶的分泌對目標蛋白的穩定性影響，利于目標蛋白分離純化；并根據酸性海藻糖酶的等電點、分子量特性，收集上柱前粗酶液，采用兩步離子交換層析、一步分子篩層析和一步窄pH范圍等電聚焦分離純化出所述的海藻糖酶。
上述誘導培養的培養基由可溶性淀粉10±0.5g/l，硫酸銨2±0.2g/l，氯化鉀1±0.1g/l，五水硫酸鎂0.5±0.05g/l，磷酸二氫鉀1±0.1g/l，2-(N-嗎啉)-乙基磺酸10±0.5g/l，微量元素0.1％七水硫酸亞鐵和0.3％五水硫酸鋅10±0.5ml/l組成，調pH值為6.00～6.10；所述離子交換層析采用的層析柱分別為High Q Sepharoes陰離子柱和25 Q Sepharoes陰離子柱(Bio-Rad)；所述分子篩層析柱為Sepharcyl-200sHR(Pharmacia)；所述窄pH范圍等電聚焦采用的等電聚焦膠板為安發瑪西亞產的pH值范圍為4.0～5.0的膠板。
在所述制備方法中，對所述的酶進行同工酶檢測是先進行等電聚焦電泳，然后采用凝膠染色進行檢測；其中的凝膠染色，是采用覆蓋膠法對等電聚焦后凝膠中酸性海藻糖酶進行活性顯色，A液由0.1M pH5.0檸檬酸緩沖液10ml，1000U葡萄糖氧化酶50μl，2500U/ml過氧化物酶50μl，25mg/ml 3-氨基-9-乙基-咔唑丙酮溶液組成，B液為2％瓊脂；并將A液2ml、海藻糖100mg、B液12ml混勻。
具體地說，上述酸性海藻糖酶的制備方法，所述金龜子綠僵菌菌株CQMa102的活化將金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)CQMa102分生孢子接種于1/4SDA平板培養基上進行活化，菌株在26～28℃黑暗條件下生長7～14d，直至產孢，然后于4℃冰箱中保存備用；所述產酶誘導培養收集1/4SDA平板培養基上CQMa102菌株分生孢子，并配制成3×107～4×107孢子/ml菌懸液；每100ml液體培養基接種3×107～4×107孢子，在開放式搖床上150rpm振蕩培養72h，培養溫度為26～27℃；所述分離純化誘導培養結束后，去除培養液中的菌絲，收集濾液進行透析、離心、抽濾，并調節其電導率為0.6～0.7ms/cm2的上柱前粗酶液；所述層析步驟均在Duo-flow高壓層析系統(Bio-Rad)上進行；所述離子交換層析柱采用0.0～0.5M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結合的酸性海藻糖酶，收集含海藻糖酶活性部分；對收集的海藻糖酶活性部分超濾濃縮，再進行分子篩層析，對分子篩層析后所得的海藻糖酶液經超濾濃縮后，再進行窄PH范圍等電聚焦電泳分離，電泳結束后，將含海藻糖酶活性部分的條帶切下來轉入透析管中，再將酶蛋白洗出，即得純化的酸性海藻糖酶。
更為具體地說，純化中上柱前待純化粗酶液的收集是指培養結束后，培養液用紗布過濾去除菌絲，收集濾液裝入透析袋中，分子截留量為5000，用10倍體積的去離子水在4℃透析30h，期間換4～5次水；然后用鹽酸將透析液PH值調節到5.8，溶液在13，500rpm、4℃離心20min，然后用三層濾紙抽濾處理，最后用氯化鈉調節電導率為0.6～0.7ms/cm2，得到上柱前待純化粗酶液。
上述第一步離子層析是20ml High Q Sepharoes陰離子柱用10mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸pH5.8，電導0.6～0.7ms/cm2平衡緩沖液平衡后，將上述粗酶液上柱，上柱流速為3.0ml/min，上柱完畢后用平衡緩沖液以3.0ml/min流速沖洗直至所有未結合的蛋白都被沖走(280nm不再有吸收值)；采用200ml 0.0～0.50M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結合的酸性海藻糖酶，收集管設置為2ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；上述第二步離子層析是指High Q Sepharoes陰離子層析后收集的酶液裝入透析袋中，在4℃條件下于約2L 15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導1.00～1.05ms/cm2中透析24h，其間換3次緩沖液；充分透析后的酶液再與15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導1.00～1.05ms/cm2以等體積混合后，上2ml 25Q Sepharoes陰離子柱，此層析柱先用15mM醋酸緩沖液平衡過，上柱流速為1.0ml/min；上柱完畢后用平衡緩沖液以1.0ml/min流速沖洗直至所有未結合的蛋白都被沖走(280nm不再有吸收值)；采用100ml 0.0～0.50M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結合的酸性海藻糖酶，收集管設置為1ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；上述分子篩層析是指25Q Sepharoes陰離子洗脫得到的樣品經0.5ml超濾離心管Millipore，10kDa超濾濃縮至1ml體積，然后進行分子篩層析；2.6×60cm分子篩層析柱Sepharcyl-200s HR(Pharmacia)預先用15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導1.05ms/cm2充分平衡后，然后通過上樣環上樣1ml，酸性海藻糖酶用同樣的醋酸緩沖液洗出，流速設置為0.5ml/min，收集體積設置為1.0ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；上述窄pH范圍等電聚焦分離是指分子篩層析后所得海藻糖酶液經0.5ml超濾離心管Millipore，10kDa超濾濃縮體積至0.5ml，然后用pH值范圍為4.0～5.0預制等電聚焦膠板(Pharmacia)進行電泳分離，電泳結束后，將含海藻糖酶活的條帶切下來，轉入透析管中，用電洗脫方式將酶蛋白洗出。
本發明，首先建立了快速簡便的酸性海藻糖酶檢測體系，利于對純化進程進行監控；同時只用培養濾液作起始純化酶液，其蛋白都為真菌代謝產生并分泌到體外的，初始蛋白含量很低，種類相對較少，利于純化。采用20ml High Q陰離子交換作為純化第一步，將上柱pH設置到5.8可以快速富積目標蛋白同時去除培養液中存在的大部分雜蛋白及其它大分子物質如淀粉。純化的第二步采用2ml 25Q陰離子交換并將上柱pH設置到5.0，接近目標蛋白等電點，提高了層析的分辨率。第三步采用分子篩層析，根據分子量大小的差異對酸性海藻糖酶進行了進一步的分離，第四步采用窄pH范圍預制等電聚焦膠板(Pharmacia，pH4.0～5.0)進行分離，能將等電點相差很小的蛋白分開，從而使酸性海藻糖酶進一步得以純化。
采用本發明所述的分離純化方法得到的酸性海藻糖酶，能特異降解海藻糖為葡萄糖，具有活性高、底物專一性高的特點，可以廣泛運用于科學研究中海藻糖含量的定性定量檢測，能避免其它二糖的干擾。


圖1濾液濃縮后酸性海藻糖酶同工酶分析；圖220ml High Q Sepharoes(Bio-Rad)陰離子層析流出圖；圖32ml 25 Q Sepharoes(Bio-Rad)陰離子層析流出圖；圖42.6×60cm分子篩層析(Sepharcyl-200s HR，Parmacheica)流出圖；圖5不同純化階段SDS-PAGE蛋白銀染檢測；圖6純化后的酸性海藻酶IEF銀染檢測；圖7抑制劑Trehazolin對純化的酸性海藻糖酶活性的影響；圖8溫度對酸性海藻糖酶活性的影響；圖9.pH對酸性海藻糖酶活性的影響；圖10.酸性海藻糖酶的熱穩定性；圖11.Lineweaver-Burk方程測定純化的酸性海藻糖酶Km和Vmax。
在圖5中，1是25Q流出峰2；2是分子篩流出峰1；3是純化的酸性海藻糖酶；M是蛋白分子量標準；在圖6中，1是粗酶液；2是純化的酸性海藻糖酶。
具體實施例方式
下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不僅限于此。
金龜子綠僵菌菌株CQMa102孢子的活化本例的金龜子綠僵菌菌株CQMa102(Metarhiziumanisopliaevar.acridumCQMa102)是從罹病竹蝗僵蟲體內分離培養純化得到，由重慶大學基因工程中心分離純化，中國微生物所菌種保存中心保存的菌株，保藏編號CGMCC No.0877，其分生孢子存儲于30％甘油溶液中，于-80℃超低溫冰箱中長期保存。將-80℃保存的金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)CQMa102菌株接種于1/4SDA平板培養基上進行活化，所用培養基由10g/l葡萄糖，2.5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，20g/l瓊脂組成，并將其pH值調至6.0，菌株在26～28℃黑暗條件下生長7～14d，直至產孢，然后于4℃冰箱中保存備用。
產酶誘導培養條件所用培養基由可溶性淀粉10±0.5g/l，硫酸銨2±0.2g/l，氯化鉀1±0.1g/l，五水硫酸鎂0.5±0.05g/l，磷酸二氫鉀1±0.1g/l，2-(N-嗎啉)-乙基磺酸10±0.5g/l，微量元素0.1％七水硫酸亞鐵和0.3％五水硫酸鋅10±0.5ml/l組成，并將其pH調至6.00～6.10。具體配制方法稱取3L培養基物質于1L玻璃燒杯中，先加入約1L去離子水，用玻棒攪拌后于微波爐中加熱徹底溶解可溶性淀粉。然后待培養基冷卻后用氫氧化鈉調節pH至6.00～6.10。最后將培養基用去離子水調至3L，分裝到250ml三角瓶，每瓶100ml培養液。培養基滅菌備用。
收集1/4SDA平板培養基上CQMa102菌株分生孢子，用滅菌的0.05％吐溫80溶液配制成3×107孢子/ml菌懸液；每100ml培養液接種3×107孢子。培養液在開放式搖床上150rpm振蕩培養72h，培養溫度為26～27℃。
酸性海藻糖酶同工酶檢測等電聚焦電泳參照汪家政(2001)，采用T＝5％，C＝3％垂直板聚丙烯酰胺等電聚焦電泳(PAGE-IEF)，采用寬pH范圍兩性電解質(pH 3-9.5)。電泳設備為Mini-Proteanapparatus(Bio-Rad)。陰極電泳液是為2mM NaOH溶液；陽極電解液是由0.84ml磷酸溶于1L蒸餾水中配置而成。樣品溶液中含有50％甘油。采用分步電泳，先在100V電壓下電泳1h，接著在250V電壓下電泳2h。
凝膠染色采用覆蓋膠法(overlay gel)對等電聚焦后凝膠中酸性海藻糖酶進行活性顯色(Manchenk，1994)。A液由0.1M pH5.0檸檬酸緩沖液10ml，1000U葡萄糖氧化酶50μl，2500U/ml過氧化物酶50μl，25mg/ml 3-氨基-9-乙基-咔唑丙酮溶液組成，用量2ml，海藻糖100mg，B液為2％瓊脂(60℃)，用量12ml混合后，均勻傾倒在凝膠表面，然后將凝膠放置在37℃下進行保溫直到出現紅棕色染色條帶。用7％的乙酸對凝膠進行固定。
酸性海藻糖酶酶活檢測以酶與海藻糖反應釋放的葡萄糖含量來確定海藻糖酶酶活。取一定體積酶液(xμl)和12.5μl 0.1M的海藻糖溶液，在20mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸(pH5.5)中、30℃下反應10min，反應體系總體積50μl。反應結束后先在100℃水浴5min終止反應，接著冰浴5min以防止酶蛋白質重折疊。酶促反應后釋放出的葡萄糖含量用改進的葡萄糖氧化酶法測定(Trinder1969)，加入150μl葡萄糖測定試劑[含0.5mM 4-氨基安替比林(4-aminoantipryine)，20mM p-羥基苯磺酸鹽(p-hydroxybenzene sulphonate)，15,000U/L葡萄糖氧化酶和10,000U/L過氧化物酶(horseradish)，在27℃下顯色30min。以一系列不同濃度的葡萄糖標準品做標準曲線，使用Model 550酶標儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。酶活定義為每分鐘釋放1mmol葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位(U)。
為便于樣品處理，本例中每批次培養接種3L培養液，經過72h培養，所得濾液經過透析處理后，體積為2.7L左右。由于培養基中不含外源蛋白，培養液中蛋白均來源于真菌自身代謝并分泌到培養基中的，因此總蛋白含量很低，只有20mg左右。同工酶分析顯示有兩條同工酶帶，其中一條帶pI(等電點)在4.7，活性較高，而另一條帶pI在8.4左右(見圖1)，活性較弱，其它方面實驗顯示pI 4.7的同工酶可能為真菌在蝗蟲浸染過程中起作用的酸性海藻糖酶。
酸性海藻糖酶的純化培養結束后，培養液用紗布過濾去除菌絲，收集濾液裝入透析袋(分子截留量為5000)中，用10倍體積的去離子水在4℃透析30h，期間換4～5次水。然后用HCl溶液將透析液pH值調節到5.8，溶液在13，500rpm、4℃離心20min，然后用三層濾紙抽濾處理，最后用NaCl溶液調節電導率為0.7ms/cm2，得到上柱前粗酶液。
本發明的所有層析都是在Duo-flow高壓層析系統(Bio-Rad)上進行。第一步離子層析是20ml High Q Sepharoes陰離子柱用10mM MES(pH5.8，電導0.7ms/cm2)平衡緩沖液平衡后，將上述粗酶液上柱，上柱流速為3.0ml/min，上完后用平衡緩沖液以3.0ml/min流速沖洗直至所有未結合的蛋白都被沖走(280nm不再有吸收值)。采用200ml0.0～0.5M NaCl溶液線形洗脫梯度洗脫結合的酸性海藻糖酶，收集管設置為2ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化。
第二步離子層析High Q陰離子層析后收集的酶液裝入透析袋中，在4℃條件下于2L 15mM醋酸緩沖液(pH5.0，電導1.05ms/cm2)中透析24h，其間換3次緩沖液。充分透析后的酶液再與15mM醋酸緩沖液(pH5.0，電導1.05ms/cm2)以等體積混合后，上2ml25 Q Sepharoes陰離子柱(層析柱事先用15mM醋酸緩沖液平衡)，上柱流速為1.0ml/min。上柱完畢后用平衡緩沖液以1.0ml/min流速沖洗直至所有未結合的蛋白都被沖走(280nm不再有吸收值)。采用100ml 0.0～0.5M NaCl溶液線形洗脫梯度洗脫結合的酸性海藻糖酶，收集管設置為1ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化。
分子篩層析25Q Sepharoes陰離子洗脫得到的樣品經0.5ml超濾離心管(Millipore，10KDa)超濾濃縮至1ml體積，然后進行分子篩層析。2.6×60cm分子篩層析柱(Sepharcyl-200s HR，Pharmacia)預先用15mM醋酸緩沖液(pH5.0，電導1.05ms/cm2)充分平衡后，通過上樣環上樣，酸性海藻糖酶用同樣的緩沖液洗出，流速設置為0.5ml/min，收集體積設置為1.0ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化。
窄pH范圍等電聚焦分離分子篩層析后所得海藻糖酶液經0.5ml超濾離心管(Millipore，10kDa)超濾濃縮體積至0.5ml，然后用窄pH范圍預制等電聚焦膠板(Pharmacia，pH4.0～5.0)進行分離，按說明書要求在水平板電泳儀(北京六一)上進行電泳，電泳結束后，將含海藻糖酶活的條帶切下來，轉入透析管中，用電洗脫方式將酶蛋白洗出，即可得到純化的酸性海藻糖酶。
本例結合同工酶分析資料，首先選用20ml High Q Sepharoes(Bio-Rad)陰離子層析，該介質直徑為50μm，流速較快，可以較快地將樣品中的目標蛋白吸附到介質上，從而達到快速富集目標蛋白的目的，將上柱pH設置為5.8，電導率調到0.7是為了讓目標蛋白很好的吸附到柱上，如圖2所示，通過這一步層析，去除掉了濾液中大部分雜蛋白和淀粉等雜質，同時將目標蛋白從2700ml濃縮至約30ml左右。從圖2中，我們還可看出，海藻糖酶活性部分集中在18～34管(30ml)。
經過第一步陰離子交換層析后，樣品中雜蛋白及其它干擾因子減少，進一步采用2ml25Q Sepharoes陰離子交換，25Q Sepharoes陰離子介質直徑為25μm，由于柱子小，介質細，因而分辨率更高，采用pH 5.0，電導率1.05上柱，上柱PH非常接近酸性海藻糖酶等電點4.7，但能將目標蛋白吸附到柱上，進一步減少非特異蛋白的吸附，增加層析的分辨率；經過洗脫，得到了較好的洗脫峰，酸性海藻糖酶活性部分在第2個峰中出現，體積進一步降到3ml(參見圖3)。
25Q離子交換層析后，樣品經過SDS-PAGE檢測，只含有幾條主蛋白帶，且分子量相差較大，因此進一步選用分子篩層析，利用蛋白之間分子量大小差異進行分離。如圖4所示，經過分子篩層析后，酸性海藻糖酶活性部分在第一個洗脫峰中出現，活性部分體積收集為10ml。
分子篩層析后，收集酸性海藻糖酶活性部分，經SDS-PAGE檢測，只剩下2條蛋白帶(銀染)，兩條蛋白分子量分別為170KDa和87KDa，但在分子篩層析時卻在同一個峰中出現，推測87KDa蛋白在天然條件下是一個二聚體。
進一步采用窄pH范圍預制等電聚焦膠板(Pharmacia，pH4.0～5.0)進行分離，經分離后得到酸性海藻糖酶純品，SDS-PAGE(參見圖5)和IEF(參見圖6)檢測均只有一條蛋白帶。純化的酸性海藻糖酶分子量為170KDa，等電點(pI)為4.7。對純化的蛋白生化特性進行了鑒定(圖7-11，表1)。
表1.金龜子綠僵菌酸性海藻糖酶底物特異性分析

將本例純化得到的酸性海藻糖酶進行特性鑒定1、分子量和等電點分子量的測定是根據Laemmli的方法用12％的SDS-PAGE測定，蛋白質分子量Marker是低分子量Marker(Pharmacia)。等電點是在IEF-PAGE上測定的。
2、抑制劑trehazolin對海藻糖酶活性的影響Trehazolin是海藻糖酶專一性抑制劑，最初是從Micromonospora的培養物中分離得到，系海藻糖結構類似物。0-50ng/ml濃度梯度(終濃度)的trehazolin分別加入到1.5ml含12.5mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸，pH5.5，12.5mM海藻糖和25ng純化的酸性海藻糖酶溶液的離心管中，反應總體積為50μl；在30℃水浴反應10min，100℃滅活5min，冰浴5min，將反應液轉入96孔酶標板中，每孔加入150μl Trinder測糖試劑，在27℃反應30min，使用Model 550酶標儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每個梯度作三次重復，共設8個梯度；在實驗中另設一空白對照，不加抑制劑和純化的海藻糖酶，以扣除背景值。
結論Trehazolin是酸性海藻糖酶專一性抑制劑，其IC50為1.3×10-8M。
3、底物特異性分析分別測定了純化的海藻糖酶對8種二糖的水解作用。1.5ml含12.5mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸，pH 5.5和25ng純化的酸性海藻糖酶溶液的離心管中分別加入12.5mM終濃度的海藻糖，纖維二糖(glucose β1-4 glucose)，麥芽糖(glucoseα1-4 glucose)，蔗糖(glucose α1-2βglucose)，半乳糖(galactose1-4glucose)，p-硝基苯-β-葡糖苷(pnp galactopyranoside)，p-硝基苯-α-葡糖苷(pnp α-glucopyranoside)，p-硝基苯-β半乳糖苷(pnp β-glucopyranoside)，反應總體積為50μl。每個底物處理設置一個空白對照，即在上述反應體系中不加純化的海藻糖酶，其余成分相同，以扣除背景值。在30℃水浴反應10min，100℃滅活5min，冰浴5min，將反應液轉入96孔酶標板中，每孔加入150μl葡萄糖測定試劑，27℃反應30min，使用Model 550酶標儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每種底物分別作三次重復(包括空白和實驗處理)。
結論海藻糖為該蛋白酶專一性底物。
4、海藻糖酶反應最適溫度和pH測定從15～70℃每隔5℃設置一個溫度梯度，1.5ml離心管在冰上分別加入12.5mM終濃度的海藻糖，12.5mM MES，pH 5.5和25ng純化的酸性海藻糖酶，總體積50μl，然后放入上述不同溫度梯度的水浴鍋中反應10min，100℃滅活5min，冰浴5min，將反應液轉入96孔酶標板中，每孔加入150μl Trinder測糖試劑，27℃反應30min，使用Model 550酶標儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每個溫度梯度分別作三次重復。
從pH3.0～9.0每隔0.5個pH設置一個梯度，其中3.0～5.0用醋酸緩沖液，5.5～6.5用MES緩沖液，7.0～7.5用HEPES緩沖液，8.0～9.0用Tris-HCl作緩沖液，1.5ml離心管在冰上分別加入終濃度為30mM的不同pH緩沖液，12.5mM終濃度的海藻糖和25ng純化的酸性海藻糖酶，總體積50μl。在30℃水浴反應10min，100℃滅活5min，冰浴5min，將反應液轉入96孔酶標板中，每孔加入150μl Trinder測糖試劑，27℃反應30min，使用Model 550酶標儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每種pH梯度分別作三次重復。
結論海藻糖酶反應最適溫度為30℃，最適反應PH值為5.5。
5、酸性海藻糖酶熱穩定性測定純化的酸性海藻糖酶在40，50，60，70℃條件下分別水浴10min，30min，60min，120min和240min，然后取5μl(25ng)測定殘存的酶活。測定條件為12.5mM終濃度的海藻糖，12.5mM MES，pH5.5和25ng熱處理過的酸性海藻糖酶，總體積50μl，在30℃水浴反應10min，100℃滅活5min，冰浴5min，將反應液轉入96孔酶標板中，每孔加入150μl Trinder測糖試劑，27℃反應30min，使用Model 550酶標儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每個處理分別作三次重復。
結論此酸性海藻糖酶在40℃溫育240min對酶活性沒有影響，當孵育溫度為50℃時，隨著孵育時間延長酶活性線性下降，當溫度超過60℃時，酶活性迅速喪失。
6、酶動力學特性測定海藻糖終濃度設置為0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0，1.25mM，不同濃度梯度的海藻糖分別與25ng純化的酸性海藻糖酶在30℃，pH5.5條件下反應10min(反應體系總體積為50μl)，反應完畢后100℃滅活5min，冰浴5min，將反應液轉入96孔酶標板中，每孔加入150μl Trinder測糖試劑，27℃反應30min，使用Model550酶標儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值。每個處理分別作三次重復。與此同時，配置0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.6mM葡萄糖標準梯度，每個酶標板孔中加入50μl標準濃度葡萄糖溶液，然后與150μl Trinder測糖試劑在27℃反應30min，使用Model 550酶標儀(Bio-Rad)，于490nm測光吸收值，制作標準曲線(n＝3)。應用Lineweaver-Burk方程計算純化的酸性海藻糖酶Km和Vmax。
結論此酸性海藻糖酶特征米式常數Km為2.3mM，最大酶促反應速度Vmax為0.412mmolmin-1mg-1酶蛋白protein。
權利要求
1.一種酸性海藻糖酶，它能特異地降解海藻糖為葡萄糖，并具有如下的物理化學特性(1)作用特異性降解海藻糖為葡萄糖；(2)分子量在十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳上約為170kDa；(3)等電點在等電聚焦凝膠電泳等電點電泳上約為4.7；(4)最適溫度和最佳pH海藻糖酶為該酶蛋白的專一性底物，其最適反應溫度為30±0.2℃，最佳pH為5.5±0.2；(5)熱穩定性此酶蛋白在40℃溫育240min對酶活性沒有影響，當孵育溫度為50℃時，隨著孵育時間延長酶活性線性下降，當溫度超過60℃時，酶活性迅速喪失；(6)抑制劑Trehazolin是此酶蛋白的專一性抑制劑，其IC50為1.3×10-8M；(7)酶動力學特性此酶蛋白的米氏常數Km為2.3mM，最大酶促反應速度Vmax為0.412mmol min-1mg-1；其中所述酶是從保藏號為CGMCC No.0877的金龜子綠僵菌CQM a102菌株中提取的。
2.一種制備權利要求1所述的酸性海藻糖酶的方法，所述方法包括活化所述金龜子綠僵菌菌株CQMa102孢子，并在營養培養基中誘導培養能產生所述酶的微生物以形成所述的酶，并加以純化。
3.如權利要求2所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于在所述制備方法中，對所述的酶進行同工酶檢測和酶活檢測，以確定目的蛋白的等電點，再進行純化。
4.如權利要求2所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于所述金龜子綠僵菌菌株CQMa102孢子活化所用培養基由10g/l葡萄糖，2.5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，20g/l瓊脂組成，其pH值調至6.0；所述的誘導培養采用的碳源是可溶性淀粉，采用的氮源是硫酸銨；所述純化采用上柱前粗酶液的收集、兩步離子交換層析、一步分子篩層析和一步窄pH范圍等電聚焦分離純化出所述的海藻糖酶。
5.如權利要求4所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于所述誘導培養的培養基由可溶性淀粉10±0.5g/l，硫酸銨2±0.2g/l，氯化鉀1±0.1g/l，五水硫酸鎂0.5±0.05g/l，磷酸二氫鉀1±0.1g/l，2-(N-嗎啉)-乙基磺酸10±0.5g/l，微量元素0.1％七水硫酸亞鐵和0.3％五水硫酸鋅10±0.5ml/l組成，調pH值為6.00～6.10；所述離子交換層析采用的層析介質分別為High Q Sepharoes陰離子介質和25QSepharoes陰離子介質；所述分子篩層析柱為Sepharcyl-200s HR；所述窄pH范圍等電聚焦采用的等電聚焦膠板為安發瑪西亞產的pH值范圍為4.0～5.0的膠板。
6.如權利要求3所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于在所述制備方法中，對所述的酶進行同工酶檢測是先進行等電聚焦電泳，然后采用凝膠染色進行檢測；其中的凝膠染色，是采用覆蓋膠法對等電聚焦后凝膠中酸性海藻糖酶進行活性顯色，A液由0.1M pH5.0檸檬酸緩沖液10ml，1000U葡萄糖氧化酶50μl，2500U/ml過氧化物酶50μl，25mg/ml 3-氨基-9-乙基-咔唑丙酮溶液組成，B液為2％瓊脂；并將A液2ml、海藻糖100mg、B液12ml混勻。
7.如權利要求2至6任一權利要求所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于所述金龜子綠僵菌菌株CQMa102的活化將金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)CQMa102分生孢子接種于1/4SDA平板培養基上進行活化，菌株在26～28℃黑暗條件下生長7～14d，直至產孢，然后于4℃冰箱中保存備用；所述產酶誘導培養收集1/4SDA平板培養基上CQMa102菌株分生孢子，并配制成3×107～4×107孢子/ml菌懸液；每100ml液體誘導培養基接種1ml，在開放式搖床上150rpm振蕩培養72h，培養溫度為26～27℃；所述分離純化誘導培養結束后，去除培養液中的菌絲，收集濾液進行透析、離心、抽濾，并調節上柱前待純化粗酶液電導率為0.6～0.7ms/cm2；所述層析步驟均在Duo-flow高壓層析系統(Bio-Rad)上進行；所述離子交換層析柱采用0.0～0.5M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結合的酸性海藻糖酶，收集含海藻糖酶活性部分；對收集的海藻糖酶活性部分超濾濃縮，再進行分子篩層析，對分子篩層析后所得的海藻糖酶液經超濾濃縮后，再進行窄PH范圍等電聚焦電泳分離，電泳結束后，將含海藻糖酶活性部分的條帶切下來轉入透析管中，再將酶蛋白洗出，即得純化的酸性海藻糖酶。
8.如權利要求4所述的制備酸性海藻糖酶的方法，其特征在于所述純化中上柱前粗酶液的收集是指培養結束后，培養液用紗布過濾去除菌絲，收集濾液裝入透析袋中，分子截留量為5000，用10倍體積的去離子水在4℃透析30h，期間換4～5次水；然后用鹽酸將透析液pH值調節到5.8，溶液在13,500rpm、4℃離心20min，然后用三層濾紙抽濾，再用氯化鈉調節電導率為0.6～0.7ms/cm2，得到上柱前待純化粗酶液；所述第一步離子層析是20ml High Q Sepharoes陰離子柱用10mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸pH5.8，電導0.6～0.7ms/cm2平衡緩沖液平衡后，將上述待純化粗酶液上柱，上柱流速為3.0ml/min，上完柱后用平衡緩沖液以3.0ml/min流速沖洗直至所有未結合的蛋白都被沖走；采用200ml 0.0～0.50M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結合的酸性海藻糖酶，收集管設置為2ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；所述第二步離子層析是指High Q Sepharoes陰離子層析后收集的酶液裝入透析袋中，在4℃條件下于2L 15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導1.00～1.05ms/cm2中透析24h，其間換3次緩沖液；充分透析后的酶液再與15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導1.00～1.05ms/cm2以等體積混合后，上2ml 25Q Sepharoes陰離子柱，此層析柱先用15mM醋酸緩沖液平衡過，上柱流速為1.0ml/min；上柱完畢后用平衡緩沖液以1.0ml/min流速沖洗直至所有未結合的蛋白都被沖走；采用100ml 0.0～0.50M氯化鈉線形洗脫梯度洗脫結合的酸性海藻糖酶，收集管設置為1ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；所述分子篩層析是指25Q Sepharoes陰離子洗脫得到的樣品經0.5ml超濾離心管Millipore，10kDa超濾濃縮至1ml體積，然后進行分子篩層析；2.6×60cm分子篩層析柱Sepharcyl-200s HR(Pharmacia)預先用15mM醋酸緩沖液pH5.0，電導1.05ms/cm2充分平衡后，然后通過上樣環上樣1ml，酸性海藻糖酶用同樣的醋酸緩沖液洗出，流速設置為0.5ml/min，收集體積設置為1.0ml/管，收集含海藻糖酶活性部分用于下一步純化；所述窄pH范圍等電聚焦分離是指分子篩層析后所得海藻糖酶液經0.5ml超濾離心管Millipore，10kDa超濾濃縮體積至0.5ml，然后用pH值范圍為4.0～5.0預制等電聚焦膠板Pharmacia進行電泳分離，電泳結束后，將含海藻糖酶活的條帶切下來，轉入透析管中，用電洗脫方式將酶蛋白洗出。
全文摘要
本發明公開了一種蟲生真菌金龜子綠僵菌菌株CQMa102酸性海藻糖酶及其制備方法。它采用活化金龜子綠僵菌菌株CQMa102孢子，并在誘導培養基中誘導培養能產生所述酶的微生物以形成所述的酶，并加以純化制得。制得的蛋白酶是糖蛋白，等電點4.7，分子量170kDa；Trehazolin是其特異性抑制劑，其IC
文檔編號C12N1/14GK1793348SQ200510057408
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月30日 優先權日2005年11月30日
發明者夏玉先, 趙華, 王中康, 殷幼平, 彭國雄 申請人:重慶大學, 重慶重大生物技術發展有限公司