基因工程制備人白細胞介素24的方法及其表達載體和工程菌的制作方法

專利名稱：基因工程制備人白細胞介素24的方法及其表達載體和工程菌的制作方法
技術領域：
本發明涉及利用DNA重組技術生產蛋白質或多肽藥物的領域，更具體地，本發明涉及基因工程制備人白細胞介素24(human interleukin-24，hIL-24)及其突變體hsIL-24的方法，還涉及有關的表達載體和工程菌。
背景技術：
IL-24具有顯著的抑制腫瘤的作用，能選擇性地抑制多種腫瘤生長，誘導腫瘤細胞凋亡，包括人黑色素瘤、神經膠質母細胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、宮頸癌、結腸癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、前列腺癌等。這種抑制作用不依賴p53、Rb和p16等抑癌基因，且對正常細胞沒有影響。IL-24抑制腫瘤的機制尚未清楚，目前認為通過多種途徑發揮抑制腫瘤的作用，抗腫瘤的效果十分顯著，成為腫瘤特異治療藥物的研究開發熱點。
IL-24是1995年哥倫比亞大學Paul.B.F用差減雜交方法在黑色素瘤細胞cDNA文庫中發現一個新的與黑色素瘤分化相關基因，即mda-7(melanoma differentiation-associatedgene 7)，并初步試驗證明了mda-7具有抑制黑色素瘤增生特性和在黑色素瘤進程中促進終末分化的能力。隨后mda-7一直作為腫瘤抑制物被研究，直到2002年Caudell等用一系列的實驗證實了mda-7的細胞因子屬性，提出將mda-7重新命名為白細胞介素24(interleukin-24，IL-24)，歸于IL-10家族。
IL-24基因位于人染色體1q32.2-1q41，有7個外顯子和6個內含子。IL-24全長mRNA為1975bp(GENEBANK NM_006850)。IL-24共有206個氨基酸，其中N端有48個氨基酸為信號肽，引導IL-24分泌到細胞外行使功能。帶信號肽的IL-24分子量為23.8kD，成熟蛋白的分子量18.4kD。
IL-24的表達在人細胞中存在較高的組織特異性，主要為免疫細胞亞群，包括正常的或LPS刺激的單核細胞和T細胞，進一步亞型分類顯示約15-20％的CD19+和50-80％的CD56+為IL-24表達呈陽性。IL-24在正常黑素細胞和初期黑色素瘤細胞中均有表達，隨著黑色素瘤發展IL-24的表達逐漸減少，并在黑色素瘤的轉移和浸潤期間幾乎檢測不到IL-24的表達。在50多個不同起源的腫瘤細胞株中都沒有測定IL-24蛋白表達。Vincenti等的研究表明IL-24mRNA可被致炎細胞因子——白細胞介素-1β誘導強烈上調，暗示IL-24為早期響應基因具有響應應激的功能。
IL-24誘導腫瘤細胞凋亡與改變線粒體通透性，以及線粒體相關凋亡調節因子的含量和比例有關。在p53野生型和p53缺陷型的NSCLC皮下腫瘤中，腺病毒介導的IL-24過表達引起顯著的腫瘤生長抑制。與對照組腫瘤相比，Ad.IL-24或IL-24質粒轉化的腫瘤組實體更小、血管生成更少，暗示IL-24具有抗血管形成活性。在肺癌模型中Ad.IL-24轉染腫瘤的血管數量明顯減少，凋亡數量增加。數據顯示血管內皮生長因子(VEGF)和轉化生長因子(TGF-β)下調。在鼠異種移植模型上IL-24能抑制肺腫瘤生長，腫瘤微血管密度和血紅素含量減少，表明IL-24具有腫瘤血管生成抑制活性。
IL-24可誘導p38MAPK，PKR和STAT3等多種信號轉化途徑，其中p38MAPK和PKR是IL-24介導凋亡必需的。引起凋亡相關蛋白的表達量改變、磷酸化或涉及死亡受體Fas/FADD途徑的活化，最終引起腫瘤細胞選擇性凋亡。從人胎盤基因組文庫中分離IL-24啟動子區域。GCG序列分析鑒定多個AP-1和C/EBP轉錄因子識別位點，而AP-1/cJun或C/EBP的異位表達能顯著提高黑色素瘤細胞IL-24啟動子的表達，證實IL-24基因調控機制。
iNOS內源表達增強促進黑色素瘤的發生、侵襲和轉移。NO具有腫瘤促進和抑制雙重效應，取決于局部的NO濃度、以及NO與腫瘤中其它分子的交互作用，最重要的可能是腫瘤微環境中的細胞因子。Ad.IL-24轉染到惡性黑素瘤后，IL-24表達將降低iNOS表達，而用重組人IL-24蛋白處理的黑色素瘤細胞也引起iNOS表達下調，表明IL-24表達與腫瘤iNOS表達呈負相關。
Ad.IL-24轉染的黑色素瘤細胞系和NSCLC細胞系中細胞周期中G2/M期細胞比例增加，而在正常黑色細胞和內皮細胞中沒有細胞周期停滯，說明Ad.IL-24能阻滯腫瘤細胞周期的進行，而對正常細胞的細胞周期沒有影響。
Introgen公司與德克薩斯大學合作研制基因治療制劑Ad.IL-24(商品名為INGN 241)已經進入II期臨床試驗，其體內外試驗和臨床實驗均證實了IL-24顯著的抗腫瘤效果。但是由腺病毒介導IL-24在腫瘤細胞中瞬時表達，誘導細胞凋亡的效果十分顯著，存在問題一是腺病毒的安全性，二是作用效果短暫，臨床上應用受到限制。在國內有兩篇文獻，一篇是在COS細胞中瞬時表達，其誘導細胞凋亡的效果顯著，但也存在作用效果短暫的問題，臨床上應用受到限制；另一篇雖然應用大腸桿菌來表達IL-24蛋白，但存在一個大的障礙——其包涵體蛋白溶解復性十分困難，沒有進行后續的實驗研究和其生物學活性驗證。
隨著IL-24誘導腫瘤細胞凋亡機制的深入研究和內外試驗和臨床實驗的深入開展一方面肯定了IL-24選擇性抑制腫瘤生長的功能，另一方面IL-24的臨床應用前景越來越廣闊，擴展了其應用范圍，同時也表現出對IL-24的大量需求。所以，通過基因工程手段大規模生產高純度較好生物活性的重組人IL-24成為必然。
有研究證實非糖基化后修飾的IL-24同樣具有選擇性誘導腫瘤細胞凋亡的能力，這就為原核表達有活性的IL-24提供了理論基礎。

發明內容
本發明的目的就是提供一種高效地制備具有一定生物活性的基因工程人白介素24的方法，及其有關的表達載體和工程菌。
本發明的第一方面，提供一種基因工程人白細胞介素24的表達載體，該載體為含有人白細胞介素24基因序列(IL-24)或人白細胞介素24基因突變序列(sIL-24)的質粒載體pET32a(+)，且hIL-24或hsIL-24編碼序列位于pET32a(+)載體上Kpn1和BamH1酶切位點之間。該表達載體是pET32a(+)-hIL-24或pET32a(+)-hsIL-24，其構建過程如圖1所示。
本發明的第二方面，提供一種基因工程菌，它是大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE)(購置NOVEGA公司)，并被本發明所述的表達載體所轉化。該基因工程菌是pET32a(+)-hIL-24/BL21或pET32a(+)-hsIL-24/BL21。
本發明的第三方面，提供一種表達基因工程人白細胞介素24的方法，該方法包括a)基因重組工程菌pET32a(+)-hIL-24/BL21或pET32a(+)-hsIL-24/BL21用發酵罐高密度發酵；a)離心收集細菌；b)洗滌和溶解包涵體，包涵體溶解液配方為10mmol/L Tris-Hcl，5mmol/L EDTA，8mol/L尿素，pH 9.0；c)包涵體復性在4℃攪拌的條件下，緩慢滴加10-20倍體積的復性緩沖液I，4℃攪拌復性24h，再假如10-20倍體積的復性緩沖液II，充分混勻后，4℃攪拌復性24h。復性緩沖液I的配方為10mmol/L Tris-Hcl，0.9mmol/L谷胱甘肽氧化型，0.8mmol/L谷胱甘肽還原型，pH 8.5。復性緩沖液II的配方為10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0；d)超濾濃縮100-400倍；e)融合蛋白Trx-hIL-24或Trx-hsIL-24腸激酶水解用消化緩沖液調整總蛋白濃度為2-8mg/ml，按蛋白重量比1∶300-1∶400加入腸激酶，在16℃-25℃下消化融合蛋白，時間為24-32h，制備hIL-24或hsIL-24蛋白。消化緩沖液的配方為10mmol/LTris-HCl，pH8.0；f)親和層析純化；g)凝膠過濾層析除鹽；h)目的蛋白hIL-24或hsIL-24的鑒定；i)目的蛋白hIL-24或hsIL-24誘導腫瘤細胞凋亡的活性實驗MTT比色法測定腫瘤細胞增殖情況；DNA ladder實驗；流式細胞儀定量分析。
本發明首次選用融合表達載體來表達hIL-24或hsIL-24蛋白，其優勢在于一是可以利用融合表達載體中的分子伴侶——Trx(氧還硫蛋白)的功能，Trx具有促進目的蛋白正確折疊和有利于目的蛋白的穩定等功能；二是可以利用融合蛋白的6xHis的純化標簽，十分利于后續的純化工藝；三是可以利用腸激酶(enterokinase)消化得到完整的IL-24，為避免在N端引入Ala和Met兩個多余的氨基酸(對于白細胞介素任何一個氨基酸的變化都可能引起它的活性變化)，在設計引物時將腸激酶識別位點的編碼堿基，即加黑斜體部分，加入到上游引物中。生物活性實驗證實了本發明能夠高效制備高純度的IL-24，也證實了本發明制備的IL-24具有良好的生物學活性。這是本發明的創新點之一。
對于以包涵體形式融合表達的蛋白，高效制備并純化得到高純度具有誘導腫瘤細胞凋亡的目的蛋白——IL-24是關鍵所在，本發明提供了全套的溶解、復性、消化以及純化的工藝目的蛋白的表達量能夠達到30％，復性得率大于50％，IL-24的純度大于95％，且完全適用于工業大規模生產，這在國內外尚未報道，為本發明的創新點之二。本發明工藝的顯著優點在于第一，采用pH9.0條件下2mol/L尿素溶解包涵體，不同于常規8mol/L尿素溶解包涵體溶解條件，通過提高pH可以在較低尿素濃度就能充分溶解融合蛋白，較低尿素濃度能夠降低對蛋白性質的影響，也提高了復性效果與得率。第二，采用兩步法復性工藝，在復性的同時將蛋白溶液的pH緩慢降至腸激酶的最適工作值(pH8.0)，避免了較大pH值波動引起目的蛋白的析出，同時也保證了復性的效果。由于復性充分，目的蛋白在復性的狀態下一步親和層析得到高純度具有誘導腫瘤細胞凋亡的目的蛋白——IL-24。


圖1重組質粒pET32a(+)-hIL-24或pET32a(+)-hsIL-24的構建2目的基因hIL-24或hsIL-24的RT-PCR克隆圖3pET32a(+)-hIL-24和pET32a(+)-hsIL-24重組表達質粒的酶切鑒定。
圖4hIL-24和hsIL-24基因重組菌誘導表達PAGE電泳5融合蛋白Trx-hIL-24或Trx-hsIL-24腸激酶消化效果PAGE電泳6目的蛋白hIL-24或hsIL-24純化效果7不同濃度的hIL-24或hsIL-24對MCF-7細胞的存活率的影響(MTT比色法)圖8hIL-24或hsIL-24誘導MCF-7細胞凋亡的DNA ladder實驗結果圖9流式細胞儀定量分析hIL-24或hsIL-24誘導腫瘤細胞凋亡的結果具體實施方式
以下結合附圖及實施例對本發明進行進一步的描述。
實施例1 人IL-24的編碼基因的克隆1.抽提總RNA取健康人抗凝血各5mL，用淋巴細胞分離液收集白膜層。加入RPMI1640完全培養基和總濃度為25mg/L的ConA，37℃，50mL/L CO2孵育48h，離心收集細胞。RNA抽提試劑盒抽提總RNA。
2.RT-PCR以總mRNA為模板，逆轉錄得到IL-24cDNA，條件為30℃10s，50℃30s，99℃5s，5℃5s，1個循環。
3.目的基因的PCR擴增根據GenBank公布的IL-24序列設計一對引物，引物為P1 5’-GGTACCGACGACGACGACAAGGCCCAGGGCCAAGAATT(Kpn1)
P2 5’-GGATCCTTACAGAGCTTGTAGAATTTCTG (BamHI)為避免在N端引入Ala和Met兩個多余的氨基酸，在設計引物時將腸激酶識別位點的編碼堿基(加黑斜體部分)加入到上游引物中。采用如下PCR體系和程序在一500μl微量離心管中加入下列試劑模板DNA 2μl10×PCR緩沖液(含氯化鎂) 5μldNTPs(10mmol/L) 4μl上、下游引物(0.025mmol/L)各 1μlTaq DNA聚合酶(5u/μl) 1μl加去離子水至終體積50μl混合后加入礦物油3滴反應條件94℃預變性5分鐘后，94℃，90s；60℃，60s；72℃，90s，35個循環周期，然后72℃延伸10min。
擴增出人白細胞介素24基因序列(hIL-24)或人白細胞介素24基因突變序列(hsIL-24)，IL-24的DNA序列與GENBANK公布的序列完全一致，hsIL-24的DNA序列與Genbank公布的序列對比在同一位置發生堿基的點突變，核酸的序列見序列表。
4.PCR產物的克隆采用TA克隆方法克隆PCR產物，方法見文獻[于永利，麻彤輝，楊貴貞TA克隆及雙鏈DNA測序，介紹一種快速克隆及分析PCR產物的方法，中國免疫學雜志，1994，10(1)5]。
5.PCR產物的序列分析將TA克隆轉化菌株送至公司，按常規方法(J.Sambrook，分子克隆，冷泉港實驗室出版社1989聚丙烯酰胺凝膠電泳1.21-1.32)提取質粒，采用雙脫氧末端終止法，對插入片段進行序列測定。
PCR擴增效果如附圖2所示泳道1為目的基因hIL-24的RT-PCR擴增產物(約480bp)；泳道2為目的基因hsIL-24的RT-PCR擴增產物(約480bp)；泳道3為核酸(DNA)分子量標準(Marker)。
表明目的基因hIL-24和hsIL-24與預計大小基本一致。
實施例2 重組表達質粒pET32a(+)-IL-24或pET32a(+)-hsIL-24的構建及高效表達工程菌的構建及篩選1.重組質粒的構建將IL-24或hsIL-24基因擴增(PCR)產物經1.0％瓊脂糖電泳、膠回收純化后與載體pMD-18T連接，轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒，用Kpn1和BamH1酶切，1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
將含IL-24或hsIL-24目的基因的pMD-18T載體及pET-32a(+)用Kpn1和BamH1酶切，酶切產物經1.0％瓊脂糖電泳、目的片段膠回收純化后，用連接酶連接，轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒，Kpn1和BamH1酶切，1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。酶切鑒定結果如附圖3所示泳道1為核酸(DNA)分子量標準(Marker)；泳道2為重組質粒pET32a(+)-hIL-24雙酶切Kpn1/BamH1產物(約480bp)；泳道3為重組質粒pET32a(+)-hsIL-24雙酶切Kpn1/BamH1產物(約480bp)。
酶切片段大小與設計一致，初步證明重組質粒構建成功。
有關操作具體步驟如下1)質粒DNA抽提(使用Omega公司質粒抽提試劑盒)[1]挑取平板上分隔良好的菌落轉種于帶相應抗生素的LB培養液中，37℃搖床培養過夜。
取菌液分裝于1.5mL離心管中，12000g離心3min，留取沉淀。
每管加100μL SolutionI懸浮，充分振蕩混勻。
加入100μL SolutionII，輕柔混勻，冰水浴5min。
加入250μL SolutionIII，輕振混勻，室溫放置10min。
4℃、12000g離心10min，將上清移至分離管中。
12000g離心1min，傾倒收集管中的廢液。
加入500μL washing buffer于分離管中，同上離心并棄去收集管中的廢液。重復洗滌一次。
12000g離心1min，使乙醇完全揮發。
將分離管置于另一干凈EP管中并加入一定量的TE buffer，65℃水浴5min，12000g離心1min。
取一定量洗脫液進行電泳，其余置于-20℃保存備用。
2)瓊脂糖凝膠電泳1.0％瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液，120-150mA，電泳20-40分鐘。
50×TAE儲存液配方2.0mol/L Tris base，1.0mol/L NaAc，0.1mol/L Na2EDTA；用冰醋酸調節pH8.3。
3)質粒DNA的酶切反應1μg 質粒DNA1μl 10×緩沖液(見Takara公司產品說明書)1μl 限制性內切酶Kpn1(10u/μl)1μl 限制性內切酶和BamH1(10u/μl)用雙蒸水補齊至10μl混合后37℃溫育2-3小時。
4)瓊脂糖電泳膠的目的DNA回收純化在紫外燈下觀察并切下瓊脂糖凝膠上的目的DNA電泳帶，移入1.5mL EP管。
加入Omega公司膠回收試劑盒的DNA binding buffer，65℃水浴使凝膠完全溶化并保持溶液pH在5.0~6.0之間。將溶膠液移入分離管，12000g離心1min，棄去收集管中的液體。
加入配套的Washing buffer，12000g離心1min，棄去收集管中的液體。重復洗滌1次。
12000g離心1min，分離管移置另一干凈1.5mL EP管，加入一定體積的TE buffer，65℃孵育10min，12000g離心1min，取一定量電泳，UVP紫外掃描儀檢測回收純化效果。5)連接反應(使用Takara公司連接試劑盒)通過紫外分光光度計檢測目的DNA片段和載體片段的濃度，根據外源片段與載體摩爾數比一般為1∶2～10的原則，設計連接反應體系如下目的DNA 1μL質粒載體 1～2μLligation solution 5μLddH2O 2～3μLTotal volume 10μL16℃連接12-24h。
6)感受態菌的制備(CaCl2法)(1)無菌接種環蘸取-70℃凍存的細菌保種液，三線法劃線接種于LB平板，37℃培養12～16小時。
(2)挑取單個菌落接種于2mL LB培養液中，37℃搖床培養12～16h。
(3)將過夜培養的DH5a按1％比例轉種至LB培養液中，37℃搖床培養至OD600為0.2～0.4時，8000g離心5min收集細菌。
(4)加入1mL預冷的0.1M CaCl2重懸沉淀，冰水浴3h。4℃8000g離心5min，棄上清。加入100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀，冰水浴1h，備用。
7)連接產物轉化(1)取感受態菌液100μL，加入連接反應產物；冰水浴60min，42℃水浴熱休克100s，迅速放置冰水浴1～2min。
(2)加100μL LB培養液，37℃搖床培養1h。
(3)以8000g離心10min，吸棄100μL上清后混勻沉淀，各取50μL涂布平板，37℃孵箱培養過夜。
2.高效表達融合蛋白工程菌的構建及篩選將含IL-24或hsIL-24基因的重組質粒pET-32a(+)轉化大腸桿菌BL21(DE)并提取質粒酶切鑒定。基因工程大腸桿菌BL21的感受態菌制備、轉化及重組菌的質粒抽提酶切鑒定同前。
取鑒定無誤的重組菌接種于3mL含Amp的LB培養液中，37℃搖床培養過夜。次日將過夜培養的重組工程菌按1％的比例轉種于20mL含Amp的LB培養液中，37℃搖床培養2.5小時，以IPTG誘導4小時，SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達形式和表達量，篩選高效表達菌株。
誘導表達及表達方式鑒定結果如附圖4所示泳道1工程菌pET32a(+)-hIL-24/BL21誘導后(4hr)；泳道2工程菌pET32a(+)-hIL-24/BL21誘導前(0hr)；泳道3工程菌pET32a(+)-hsIL-24/BL21誘導后(4hr)；泳道4工程菌pET32a(+)-hsIL-24/BL21誘導前(0hr)；泳道5空質粒菌pET32a(+)誘導后(4hr)；泳道6空質粒菌pET32a(+)誘導前(0hr)；泳道7蛋白質分子量標準(Marker)。
基因重組菌經過誘導后在分子量35KDa處有增加的蛋白表達條帶，與目的蛋白分子量一致。實施例3基因重組菌的發酵發酵工藝如下采用德國B.Bron 10L發酵罐，發酵過程中種子菌10％比例接種，保持70％溶氧、溫度37℃、pH7.0，在A600未達到2時不加補料，之后每0.5h流加補料一次使葡萄糖、胰化蛋白胨和8％酵母抽提物的終濃度分別為0.5％、0.2％、和0.2％。在第4次補料后待葡萄糖濃度降為0.1％時加入IPTG 500μmol/L誘導4h收菌。
發酵過程在級聯溶氧控制的分批培養基礎上，流加補料。
發酵過程所用培養基為改良M9-CAA培養基，在M9-CAA的基礎上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl2·4H2O、2mg/LCoCl2·4H2O、4mg/L FeSO4·16H2O、5mg/L H3BO3、1.6mg/LMnCl2·4H2O、4mg/L CuSO4而成。
發酵結束后回收菌液，4℃離心(8000g)15分鐘。吸棄上清，收集細菌，稱重后凍存備用。
結果10L發酵菌液可以收獲細菌濕重800克。
實施例4 目的蛋白hIL-24或hsIL-24的制備和純化1.包涵體提取將高效表達的菌體200-500g以TE緩沖液1∶10(W/V)比例懸浮，4℃預冷后采用細胞勻漿機使其混合均勻。采用高壓均質機在壓力為40-70Mpa的條件下進行破菌(共破菌4~6次)，破菌完畢后，取少量菌液涂片染色，顯微鏡下觀察細胞的完整性，確保細胞破碎完全，隨后以500g離心25min，棄沉淀，再以15,000g離心40min，棄上清收集沉淀。以1∶10(W/V)的比例分別用洗滌液A和B各洗滌2次。洗滌條件為4℃攪拌20min，15,000g離心40min，收集包涵體沉淀；最后將包涵體用包涵體溶解液以1∶10(W/V)的比例混合，4℃攪拌3h，15,000g離心45min，取上清備用。
包涵體提取所用緩沖液1)TE緩沖液20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 7.52)包涵體洗滌液A5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1％Triton X-100，pH 7.5
3)包涵體洗滌液B20mmol/L Tris，pH 7.54)包涵體溶解液1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、2mol/L尿素(pH 9.0)2.蛋白復性在4℃攪拌的條件下，緩慢滴加10-20倍體積的復性緩沖液I，4℃攪拌復性24h，再假如10-20倍體積的復性緩沖液II，充分混勻后，4℃攪拌復性24h。復性緩沖液I的配方為10mmol/L Tris-Hcl，0.9mmol/L谷胱甘肽氧化型，0.8mmol/L谷胱甘肽還原型，pH8.5。復性緩沖液II的配方為10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0。
3.超濾除鹽濃縮將上述復性溶液4℃下進行超濾，膜孔徑為10KDa，體積濃縮100-400倍。再用10mmol/L Tris-HCL，pH 8.0將其稀釋至蛋白濃度為2mg/ml-5mg/ml左右。
4.IL-24或hsIL-24的制備按蛋白重量比1∶300-1∶400加入腸激酶，在16℃-25℃下消化融合蛋白，時間為24-32h，制備hIL-24或hsIL-24蛋白。消化緩沖液的配方為10mmol/L Tris-HCl，pH8.0。腸激酶消化融合蛋白的效果見圖5泳道1工程菌pET32a(+)-hIL-24/BL21誘導表達融合蛋白Trx-hIL-24；泳道2，3，4融合蛋白Trx-hIL-24腸激酶消化0，16，24hr；泳道5，6腸激酶消化后混合物經親和層析純化收集洗脫峰部分；泳道7，8腸激酶消化后混合物經親和層析純化收集流穿峰部分；泳道9流穿峰部分濃縮10倍；泳道M蛋白質分子量標準(Marker)。
融合蛋白Trx-hIL-24或Trx-hsIL-24被腸激酶消化成兩個多肽段，一個是Trx段(理論分子量為20KDa)含有6個His的純化標簽，在鎳離子親和層析柱上能被親和吸附，而后被洗脫下來，出現在洗脫峰中；一個是IL-24段(理論分子量為18.3KDa)不含有6個His的純化標簽，不會吸附到鎳離子親和層析柱上，出現在流穿峰中。實驗結果與設計一致，且Trx和hIL-24兩部分水充分解，經一步鎳離子親和層析可以獲得純度大于95％的hIL-24。
5.鎳離子親合柱純化XK16/10 Chelating Sepharose Fast Flow鎳離子親合柱層析填料上樣緩沖液為20mmol/L Tris-HCL，pH 8.0；上樣蛋白總量約為30mg；洗脫緩沖液為20mmol/L Tris-HCL，20mmol/L 咪唑，pH 8.0。上柱后用上樣緩沖液流洗，待流穿峰出現并洗至基線后，30min，0-50％梯度洗脫。分別收集流穿峰和洗脫峰的餾分，親合純化過程見圖6Peak0流穿峰Peak1洗脫峰融合蛋白Trx-hIL-24或Trx-hsIL-24經腸激酶消化得到的hIL-24或hsIL-24，用鎳離子親和層析柱一步法純化，均在流穿峰中流出，獲得95％以上的純度，目標蛋白的回收率在70％左右。
6.Superdex凝膠過濾層析純化用凝膠過濾柱Superdex純化，用凝膠過濾平衡緩沖液平衡。
7.純化后的目的蛋白進行SDS-PAGE，檢定其純度。Lowry法檢測蛋白濃度。
實施例6目的蛋白hIL-24或hsIL-24誘導腫瘤細胞凋亡的活性實驗抗腫瘤活性實驗所用腫瘤細胞為MCF-7(乳癌細胞，購于ATCC)。
腫瘤細胞培養基為含有1％小牛血清的PRIM1640(GIBCO公司)，胰蛋白酶(為promega公司產品)。
抗腫瘤活性實驗涉及蛋白hIL-24或hsIL-24，用NaOH調節pH值為7.2備用。
抗腫瘤活性實驗包括三個方面i.MTT比色法測定腫瘤細胞增殖情況對數生長期細胞接種于96孔板中，待細胞數量達到103-104個/ml，用不同劑量的hIL-24或hsIL-24蛋白處理24h后，每孔加入25μl MTT溶液(終濃度1mg/ml)，37℃下繼續培養4h，每孔再加入100μl 20％DMF，37℃放置20h，用微孔酶標儀在570nm處測定其光吸收值(OD值)。96孔板上加入的蛋白濃度分別為1、2、4、8、16及32mg/L，MTT比色法測定不同劑量的蛋白hIL-24或hsIL-24對MCF-7細胞增殖的影響。結果表明蛋白hIL-24或hsIL-24對乳腺癌細胞MCF-7的生長抑制呈劑量依賴性，兩種蛋白沒有明顯差異。實驗組(hIL-24)與陰性對照組具有顯著的差異(P＜0.05)，見圖7MTT試驗結果顯示，不同劑量的hIL-24或hsIL-24蛋白作用24h后，對MCF-7細胞的生長抑制隨處理濃度的增加而增加，8mg/L處理組時已達50％，具有明顯的細胞毒性作用。
ii.DNA ladder實驗對數生長期細胞106-107個/ml，用30ng/ml的蛋白hIL-24或hsIL-24處理24h后，用0.25％胰酶消化后，PBS或生理鹽水洗一次，1000-2000g離心1-2分鐘，棄上清，收集細胞。樣品處理完畢后，每1毫升樣品裂解液中加入5微升蛋白酶K，混勻。對于上述處理好的樣品，每5毫克組織或者106個細胞中加入500微升添加了蛋白酶K的樣品裂解液，Vortex混勻，充分裂解組織或細胞。50℃水浴消化過夜。加入500微升Tris平衡苯酚抽提樣品。加入Tris平衡苯酚后可以Vortex，或劇烈顛倒或晃動10-30秒，以使酚相和水相充分相互作用。然后4℃，約12000g離心5分鐘。吸出酚相及中間相(可以吸除少量靠近中間相的水相液體)，剩余的水相用等體積Tris平衡酚再抽提一次。吸出酚相及中間相(可以吸除少量靠近中間相的水相液體)，剩余的水相用等體積氯仿再抽提一次吸出約300微升上清液，加入60微升10M醋酸銨和600微升無水乙醇，顛倒數次混勻，此時可見DNA沉淀產生。-20℃凍存1小時，以充分沉淀小片斷DNA。12,000g離心10分鐘，棄上清。加入70％乙醇洗滌DNA沉淀一次。盡量吸除殘余的乙醇，待看不到明顯的液體，立即加入50-100微升TE溶解DNA。取部分抽提得到的基因組DNA，1.5％-1.8％瓊脂糖凝膠中進行電泳分析如果細胞發生凋亡，就觀察到典型的DNA ladder，見圖8泳道1陰性對照組泳道2hIL-24實驗組泳道3hsIL-24實驗組泳道4陽性對照組在DNA瓊脂糖凝膠電泳中，hIL-24或hsIL-24誘導MCF-7細胞的DNA均出現典型的梯狀條帶(DNA ladder)，與對照細胞有明顯區別。由于DNA ladder的出現是細胞凋亡的特征性變化，進一步證實sTRAIL41～281已誘導了經典的細胞凋亡。
iii.流式細胞儀定量分析腫瘤細胞凋亡對數生長期細胞106-107個/ml，用不同劑量的hIL-24或hsIL-24蛋白處理24h后，先用0.25％的胰酶消化，用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標記的Annexin-V(20ug/ml)10ul，室溫避光30min，再加入PI(50ug/ml)5ul，避光反應5min后，加入400ul BindingBuffer，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測(一般不超過1h)，同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。結果表明蛋白hIL-24或hsIL-24對乳腺癌細胞MCF-7的生長抑制呈劑量依賴性，兩種蛋白沒有明顯差異，實驗組與陰性對照組具有顯著的差異，見圖9。
序列表<110>中國人民解放軍第三軍醫大學<120>酵母細胞表達人白細胞介素24的方法<160>3<210>1<211>473<212>DNA<213>人白細胞介素24<400>1cagggccaag aattccactt tgggccctgc caagtgaagg gggttgttcc ccagaaactg 60tgggaagcct tctgggctgt gaaagacact atgcaagctc aggataacat cacgagtgcc 120cggctgctgc agcaggaggt tctgcagaac gtctcggatg ctgagagctg ttaccttgtc 180cacaccctgc tggagttcta cttgaaaact gttttcaaaa actaccacaa tagaacagtt 240gaagtcagga ctctgaagtc attctctact ctggccaaca actttgttct catcgtgtca 300caactgcaac ccagtcaaga aaatgagatg ttttccatca gagacagtgc acacaggcgg 360tttctgctat tccggagagc attcaaacag ttggacgtag aagcagctct gaccaaagcc 420cttggggaag tggacattct tctgacctgg atgcagaaat tctacaagct ctg 473<210>2<211>473<212>DNA<213>具有一個堿基突變的人白細胞介素24<400>2cagggccaag aattccactt tgggccctgc caagtgaagg gggttgttcc ccagaaactg 60tgggaagcct tctgggctgt gaaagacact atgcaagctc aggataacat cacgagtgcc 120cggctgctgc agcaggaggt tctgcagaac gtctcggatg ctgagagctg ttaccttgtc 180cacaccctgc tggagttcta cttgaaaact gttttcaaaa accaccacaa tagaacagtt 240gaagtcagga ctctgaagtc attctctact ctggccaaca actttgttct catcgtgtca 300caactgcaac ccagtcaaga aaatgagatg ttttccatca gagacagtgc acacaggcgg 360tttctgctat tccggagagc attcaaacag ttggacgtag aagcagctct gaccaaagcc 420cttggggaag tggacattct tctgacctgg atgcagaaat tctacaagct ctg 473<210>3<211>158<212>PRT<213>人白細胞介素24<400>3Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly Val
1 5 10 15Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr Met2025 30Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu Val35 4045Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr Leu50 5560Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg Thr65 7075 80Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn Phe859095Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met Phe100 105 110Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg Ala115 120 125Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly Glu130 135 140Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu145 150 15權利要求
1.一種基因工程人白細胞介素24的表達載體，其特征在于，該載體為含有人白細胞介素24基因序列hIL-24或人白細胞介素24基因突變序列hsIL-24的質粒載體pET32a(+)，且hIL-24或hsIL-24編碼序列位于pET32a(+)載體上Kpn1和BamH1酶切位點之間，該載體為pET32a(+)-hIL-24或pET32a(+)-hsIL-24；克隆hIL-24或hsIL-24基因的引物為P1 5’-GGTACCGACGACGACGACAAGGCCCAGGGCCAAGAATT(Kpn1)P2 5’-GGATCCTTACAGAGCTTGTAGAATTTCTG(BamH I)為避免在N端引入Ala和Met兩個多余的氨基酸，在設計引物時將腸激酶識別位點的編碼堿基，即加黑斜體部分，加入到上游引物中。
2.一種基因工程菌，其特征在于，它被權利要求1所述的載體所轉化。
3.如權利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，它是大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE)。
4.一種制備人白細胞介素24的方法，其特征在于，在25℃-37℃培養和IPTG誘導條件下大腸桿菌pET32a(+)-hIL-24/BL21或pET32a(+)-hsIL-24/BL21表達融合蛋白Trx-hIL-24或Trx-hsIL-24，經包涵體洗滌、包涵體溶解和融合蛋白復性、腸激酶消化和純化得到hIL-24或hsIL-24；包括以下步驟(1)重組工程菌pET32a(+)-hIL-24/BL21或pET32a(+)-hsIL-24/BL21用發酵罐發酵；(2)離心收集細菌；(3)洗滌和溶解包涵體；(4)包涵體復性；(5)超濾濃縮；(6)融合蛋白腸激酶消化；(7)親和層析純化；(8)凝膠過濾層析除鹽。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，包涵體溶解液配方如下10mmol/L Tris-Hcl，5mmol/L EDTA，2mol/L尿素，pH9.0。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，復性步驟如下在4℃攪拌的條件下，緩慢滴加10-20倍體積的復性緩沖液I，4℃攪拌復性24h，再加入10-20倍體積的復性緩沖液II，充分混勻后，4℃攪拌復性24h；復性緩沖液I的配方為10mmol/L Tris-Hcl，0.9mmol/L谷胱甘肽氧化型，0.8mmol/L谷胱甘肽還原型，pH8.5；復性緩沖液II的配方為10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，超濾濃縮100-400倍。
8.如權利要求4所述的方法，其特征在于，融合蛋白腸激酶消化步驟如下用消化緩沖液調整總蛋白濃度為2-8mg/ml，按蛋白重量比1∶300-1∶400加入腸激酶，在16℃-25℃下消化融合蛋白，時間為24-32h，制備hIL-24或hsIL-24蛋白；消化緩沖液的配方為10mmol/L Tris-HCl，pH8.0。
全文摘要
本發明提供一種高效地制備具有一定生物活性的基因工程人白介素24的方法，及其表達載體和工程菌。本發明選用融合表達載體來表達hIL－24或hsIL－24蛋白，所述的表達載體為含有人白細胞介素24基因序列(IL－24)或人白細胞介素24基因突變序列(sIL－24)的質粒載體pET32a(+)，且hIL－24或hsIL－24編碼序列位于pET32a(+)載體上Kpn1和BamH1酶切位點之間。所述的基因工程菌是大腸桿菌，并被本發明所述的表達載體所轉化，是pET32a(+)－hIL－24/BL21或pET32a(+)－hsIL－24/BL21。本發明的制備工藝中提供了全套的溶解、復性、消化以及純化的工藝，使目的蛋白的表達量能夠達到30％，復性得率大于50％，IL－24的純度大于95％，且完全適用于工業大規模生產。
文檔編號C12N15/24GK1793373SQ20051005736
公開日2006年6月28日 申請日期2005年11月4日 優先權日2005年11月4日
發明者鄒全明, 楊珺, 張衛軍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學