專利名稱：唐氏綜合征基因診斷新技術及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種疾病的基因診斷方法及其應用，特別是涉及一種為唐氏綜合征作基因診斷的新技術及其應用。
背景技術：
人類染色體數目異常導致先天性疾病，最常見的是唐氏綜合征(Down’sSyndrom，D.S.)發病率約1/800，由21號染色體多出1條引起，又稱21-三體綜合征。患兒智力發育遲緩，低下，有特殊面容等。此外，還有18-三體，13-三體至今無有效治療方法。孕婦，尤其是高齡孕婦最好進行孕期篩查，篩出的高危孕婦在孕中期取羊水，進行羊水細胞培養及染色體檢查，做出診斷。但染色體核型分析技術費時費力，出結果慢，對操作者技術水平要求高[1]。FISH技術(Fluoresent In Situ Hybridization)費用昂貴，操作技術要求高，存在一定的漏檢率等。相比之下，分子生物學技術簡便快速。基于STR-PCR的進行D.S.分子診斷的技術[1]，因要對PCR產物進行凝膠電泳分析或雜交處理，故同樣存在著手工操作多，費時費力，不易質控，易造成污染等缺點。因此亟待建立一種既準確可靠，又自動化程度高，易質控，省時省力，出結果快的技術方法。Genevieve等于2003年發表了用D.C.分析結合STR原理進行等位基因定量的方法檢測D.S.的一篇文章[2]，不但用到探針，且實驗設計相當繁雜，工作量大，準確率還有限。Zimmermann及國內鄭明明等運用基于TaqMan的F-Q-PCR技術進行D.S.的產前診斷[3，4]。尚未見到用SYBR-Q-PCR結合D.C.分析技術進行D.S.分子診斷的報道。本項專利即是利用SYBR-Q-PCR結合D.C分析技術，建立對21號染色體上目標基因進行相對定量的方法，從而對D.S做出快速診斷。
參考文獻1.陳振斌，雷箴，閆梅等，用短串聯重復序列診斷唐氏綜合征.中華醫學遺傳學雜志.2004，21(2)190-1922.Genevieve PK，Lyon E.Rapia detection of Aneuploidy(Trisomy 21)by Allelequantification combined with melting curve analysis of single-nucleotidepolymorphism loci，Clin.Chemistry，2003，49(1)1087-943.Zimmermann B，Holzgreve W，Wenzel F et al.Navel real-time quantitative PCR testfor trisomy 21，Clin.Chem.2002，48362-363
4.鄭明明，胡婭莉，許爭峰等，實時熒光定量聚合酶鏈反應技術在產前診斷唐氏綜合征中的應用，中華婦產科雜志，2004，39(10)678-681發明內容本發明的目的，在于提供一種利用熒光染料進行的實時PCR結合融解曲線分析(D.C.)，通過對參照基因與21號染色體上目標基因的相對定量分析確定待檢21號染色體數目是否異常的唐氏綜合征基因診斷新技術及其應用。
本發明的技術方案如下。
一種能對唐氏綜合征做出基因診斷和產前診斷的新技術，它利用熒光染料進行的實時PCR結合融解曲線分析(D.C.)，通過對參照基因與21號染色體上目標基因的相對定量分析，確定待檢21號染色體數目是否異常。
建立運用SYBY-Q-PCR和D.C分析對21號染色體上與D.S密切有關的目標基因的定量分析方法和指標，依此定出該目標基因是2份拷貝還是3份拷貝。從而對是否21-三體綜合征(D.S)做出分子診斷，具體內容包括選定21號染色體上與D.S密切相關的1個目標基因，優化設計合成擴增其基因片段的引物；選定不在21號染色體上某合適的基因白蛋白基因作為參照基因，優化設計合成擴增其基因片段的引物.以上2對引物分別在不同的反應管中進行，通過比較二個SYBR-Q-PCR的ΔCT值及D.C分析，進行目標基因拷貝數的相對定量，做出是否D.S的診斷。并進行這一相對定量方法的平行性試驗，變化系數之測定。
以上2對引物合在一管中進行一個2重SYBR-Q-PCR，通過ΔCT值及D.C分析進行目標基因拷貝數的相對定量，做出是否D.S的診斷；PCR熱循環數對二重SYBR-Q-PCR/D.C.分析相對定量法的影響很大；并進行模板DNA量對二重SYBR-Q-PCR/D.C.分析相對定量法的影響；平行性試驗，變化系數測定。
針對D.S的相對定量檢測方法的建立(ΔCT-兩管法)用測定參照基因的SYBY-Q-PCR-1反應管，以系列倍比稀釋的正常人基因組DNA溶液作模板，進行PCR，作標準曲線(Standard，curve，S.C)。取10份已知D.S患者DNA標本，分別進行SYBY-Q-PCR1(測參照基因)及SYBY-Q-PCR2(測目的基因)，及其D.C分析，測出各標本的濃度，ΔCT＝CT目標基因-CT參照基因。以5份DNA的ΔCT值對各DNA濃度的對數值作圖，計算出所得的直線斜率。該斜率＜0.1，表明該兩管法相對定量是可行的，是有科學根據的。上述方法建立后，就不必每批試驗都作標準曲線了。
ΔPh及ΔPa單管相對定量法的建立首先優化熱循環數。以正常人DNA標本，優化2對引物的濃度和比例，以能使D.C.圖譜中二個特異峰的峰高，面積都基本相同為標準。測50個正常人DNA標本，分別統計出兩個特異峰的峰高，面積的平均值，SD(ΔPh±SD)n，(ΔPa±SD)n，Ph特異峰的峰高，Pa特異峰的面積，nnormal，正常人。測定5份D.S.患者DNA，分別統計出Ph21±SD，Pa21±SD；Ph Alou±SD，Pa Alou±SD。(ΔPh±SD)21，(ΔPa±SD)21，2121-三體者。預期(ΔPh±SD)21顯著大于(ΔPh±SD)N；差異有統計學意義，(ΔPa±SD)21顯著大于(ΔPa±SD)N差異有統計學意義。
ΔCT-單管法參見ΔCT-兩管法，只不過是進行含2對引物的1管SYBY-Q-PCR.
ΔPh及ΔPa兩管相對定量法的建立參見ΔPh及ΔPa單管相對定量法的建立，只不過是進行2管SYBY-Q-PCR.
圖1——曲線A用SYBY-Q-PCR擴增正常人DNA 21號染色體上目標基因與Albumin基因片段的熒光曲線；圖2——曲線B已知21三體患者(D.S.)DNA的熒光曲線；圖3——曲線CD.C分析曲線；圖4——曲線DD.C曲線。
具體實施例方式
實施例1雙管相對定量法檢測21號染色體數目1、Albumin gene作參照基因，引物序列，Alb15′-GCT GTC ATC TCT TGT GGGCTG T-3′；Alb25′-ACT CAT GGG AGC TGC TGG TTC-3′；2、選21號染色體上DSCR3 gene作為目標基因，引物序列，21#-15′-GTGGAG GGA AGT CAT GCA TTT-3；21#-25′-AAC ATT GAC TGT GGC TCTTGC-3。′
3、SYBY-Q-PCR反應混合物含2.5μl 10×SYBY PCR Buffer；1.5mMMgCl2；200mMdNTPs；300nM each of primer Alb1，Alb2或21#-1，21#-2；0.6U TaqDNA polymerase，50ng of DNA。總體積50μl/PCR.
4、熱循環在GeneAmp 5700型或ABI 7000型等定量PCR儀上進行。95℃，10min→(95℃，15s---60℃，1min)，20～30個循環，之后進行一個60℃-95℃融解曲線分析。
5、結果用該項發明專利技術檢測正常人DNA得到的熒光擴增曲線和D.C，見附圖A，C；檢測21-三體患者DNA所得到的熒光擴增曲線和D.C，見附圖B，D。
5-1由A得出ΔCT(正常)＝CTAlbu.-CT21#＝-0.5由B得出ΔCT(D.S) ＝CTAlbu.-CT21#＝2.9可見ΔCT(D.S)顯著＞ΔCT(正常)由20個正常人DNA得出ΔCT(正常)平均值±SD由10個D.S DNA得出ΔCT(D.S)平均值±SDΔCT(D.S)平均值±SD顯著＞ΔCT(正常)平均值±SD，兩組有顯著性差異。
由此得出判斷未知標本是否D.S的相對定量方法的標準。
5-2由圖C，D中的峰高進行比較后得出ΔPh(D.S.)平均值±SD顯著＞ΔP.h.(正常)平均值±SD，兩組有顯著性差異。
由此得出判斷未知標本是否D.S的第二種校對定量方法及標準。
5-3類似的圖C，D中，以峰的積分面積進行比較后得出ΔP.a(D.S)平均值±SD顯著＞ΔP.a(正常)平均值±SD，兩組有顯著性差異。
由此得出判斷未知標本是否D.S的第三種校對定量方法。
權利要求
1.一種唐氏綜合征基因診斷新技術，其特征在于是利用熒光染料SYBRGreen1進行實時熒光PCR及融解曲線分析，通過對21號染色體上目標基因與參照基因的相對定量分析，診斷21號染色體是否三體。
2.根據權利要求1所述的唐氏綜合征基因診斷新技術，其特征在于檢測目標基因和參照基因的PCR可合在一管中進行，也可以分別進行；基因相對定量分析可以依據ΔCT＝CT目標基因-CT參照基因做出，也可以依據融解曲線中特定的Tm值時的峰的定量比較做出；ΔCT±SD大于ΔCT正常人±SD約1.5倍者即為21-三體綜合征。
3.根據權利要求1所述的唐氏綜合征基因診斷新技術及其應用，其特征在于既可用于患者基因的診斷，也可用于高危孕婦羊水細胞或孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的基因診斷。
全文摘要
本發明公開了一種能對唐氏綜合征做出基因診斷和產前診斷的新技術。它利用熒光染料進行的實時PCR結合融解曲線分析(D.C.)，通過對參照基因與21號染色體上目標基因的相對定量分析，確定待檢21號染色體數目是否異常。該技術可以用于患者的基因診斷和21－三體即唐氏綜合征高危孕婦羊水細胞或其外周血中胎兒有核紅細胞的快速基因診斷。其優點檢測特異性高，準確可靠，自動化程度高，靈敏度高，無PCR產物后處理操作，省時省力。閉管操作，避免擴增產物的污染。無需熒光標記探針，成本低廉。高通量，能滿足大量樣本的快速篩查或檢測。
文檔編號C12Q1/68GK1683566SQ200510055338
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月17日 優先權日2005年3月17日
發明者劉敬忠 申請人:劉敬忠