專利名稱：擴張型心肌病診斷和治療方法及用于該方法的試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及擴張型心肌病的診斷和治療方法、用于該目的試劑、組合物和試劑盒及其用途。
背景技術：
擴張型心肌病是一種以左室或雙心室的擴張和收縮功能損害為特點的心肌疾病，它可能是自發的，家族性/遺傳性，病毒性和/或免疫性，或酒精中毒/中毒性，或是和其他已知的心血管疾病有關，這些心血管疾病的心肌功能失常的程度不能用異常的負荷或缺血損害來解釋，最終可導致進行性難治性的心衰，是一種嚴重的健康問題，是心臟移植的主要適應征之一，且常伴發室性心律失常，猝死率高，5年內病死率15％-50％。在美國應用對該病晚期的診斷標準進行人群擴張型心肌病流行病學調查中發現該病發病率為36.5/10萬。約半數患者的發病機制不明。在相當長時間內對遺傳因素在本病中的重要性估計不足。一些前瞻性的研究證實了該病的遺傳傾向，估計約有25％的擴張型心肌病患者與遺傳因素有關。真正的發病情況可能仍然估計過低，因為除家族史以外，尚無臨床或組織病理學的標準來對家族性和非家族性的患者進行鑒別，而且正像肥厚型心肌病一樣，一些被認為是散發的病例實際上是一種原發突變，能遺傳給后代。由于外顯率不完全且與年齡相關，或沒有認真全面的家族史調查易導致一些家族性病例被誤為散發病例。
擴張型心肌病患者中有一半患者是特發性的，在特發性心肌病患者中有30-40％的患者是家族遺傳性的，其遺傳方式絕大多數為常染色體顯性遺傳，有少數為X連鎖遺傳，常染色體隱性遺傳極為罕見。目前已經有8個染色體定位與擴張型心肌病有關，并已確定了7個主要致病基因，包括肌動蛋白(Actin)、肌營養不良蛋白(Dystrophy)、tafazzin、橋粒蛋白(Desmin)、δ-sarcoglycan、SCN5A和Lamin A/C。與遺傳有關的擴張型心肌病的表型通常分為以下幾類成年人的擴張型心肌病不伴有傳導障礙及肌肉病變定位于9q13-q22、10q21-q23、1q32、2q31、2q11-q22、15q14，伴有骨骼肌病變的通常為X連鎖遺傳，伴有傳導阻滯的患者通常定位于1p1-q21、3p22-25，而擴張型心肌病伴有房室傳導阻滯的患者與核纖層蛋白A/C(Lamin A/C)基因的突變有關(表1)。
表1擴張型心肌病遺傳方式及主要致病基因
目前已知的核纖層蛋白A/C(Lamin A/C)基因與擴張型心肌病有關的突變見下表
HGMD Accession
References1-Fatkin(1999)N Engl J Med 341，17152-Arbustini(2002)J Am Coll Cardiol 39，9813-Sebillon(2003)J Med Genet 40，5604-Jakobs(2001)J Card Fail 7，2495-Hershberger(2002)Am Heart J 144，1081目前對擴張型心肌病的早期診斷尚無特異的方法，而中晚期擴張型心肌病的診斷亦需排除其他疾病(如冠心病、高血壓性心臟病、肺心病等)才能診斷，而且診斷明確多為中晚期患者，此類患者預后較差。在治療方面也無特效治療，療效欠佳。我們首次在中國人群中檢測到擴張型心肌病的基因突變，并對其功能進行了初步的研究，這對于亞臨床型擴張型心肌病患者的診斷、治療及進一步尋找新的治療方法提供了新的思路。
單核苷酸多態性人類基因組中的序列變異主要由單核苷酸多態性(″SNP″)組成，其余序列變異是短串聯重復(包括微衛星)、長串聯重復(小衛星)和其它插入和缺失。SNP是群體中以可測頻率(即＞1％)出現兩個可替換堿基的位置。SNP被稱為是″等位的″，因為由于此多態性的存在，一個物種的一些成員可能具有未突變序列(即，原始“等位基因”)，而其它成員可能具有突變序列(即變體或突變等位基因)。在最簡單的情況下，可能僅存在一個突變序列，該多態性被稱為二對等位基因多態性。可替換突變的發生可產生三對等位基因多態性等。SNP廣泛存在于基因組中，改變基因功能的SNP可能直接有助于表型變異。由于它們的流行和普遍本質，SNP有潛力成為定位參與人類疾病情況的基因的重要工具，見如Wang等，Science 2801077-1082(1998)，它公開了一個探索性研究，其中2,227個SNP被作圖定位于一個2.3兆堿基的DNA區域內。
單核苷酸多態性和特定表型之間的關系不表示或需要SNP是該表型的原因。相反，這種關系可能僅表示SNP位于表型決定因子在基因組上的存在位置的附近，由此更可能被發現與這些決定因子關聯和由此與感興趣的表型關聯。因此，SNP可能與“真正”的功能變異存在連鎖不平衡(LD)。當基因組兩個不同位置上的等位基因的相關性比期望的相關性更高時存在LD，又稱作等位基因相關(allelicassociation)。因此，SNP可以用作標記，由于其接近引起特定表型的突變而具有價值。
發明內容
本發明涉及將LMNA基因中的單核苷酸多態性和患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)相關聯的方法。本發明還涉及確定患者對疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的遺傳易感性或者診斷患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的方法，此方法包括檢測LMNA基因中的至少一個單核苷酸多態性。優選地，這種方法包括至少檢測所述樣品中LMNA基因第244位的核苷酸或者lamin A蛋白質第82位的氨基酸，并參照LMNA基因中的多態性確定個體狀態。本發明還涉及在序列中包含在上面所限定位置上的多態性的分離的核酸，涉及能與這種核酸雜交的核酸引物和寡核苷酸探針和涉及包含一種或多種這樣的引物和探針用于檢測LMNA基因中的多態性的診斷試劑盒。
本發明還涉及治療或者預防患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的方法，所述患者的LMNA基因第244位的G發生突變(如G244A突變)或者lamin A蛋白質第82位E發生突變(如E82K突變)，包括向所述患者給予正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白質。
下文將結合附圖對本發明進行更進詳細的說明。應當理解，這些說明用于對本發明進行舉例說明的目的。本發明的范圍不受具體說明的限制。
附圖簡述
圖1擴張型心肌病家系圖。
圖2LMNA基因發生G244A突變。上圖患者 下圖正常人。
圖3LMNA基因的12個外顯子及其蛋白上的結構元件。12個外顯子依照其相應的氨基酸位置排列，Lamin A蛋白的central roddomain由1A、1B和2A、2B四個亞結構域加上之間的linkers構成，尾端則包括核定位信號(NLS)，immunoglobulin fold(Ig fold)和羧基末端的CAAX序列，我們發現的新突變E82K正好位于1B的氨基端。
圖4不同物種之間lamin A蛋白部分序列的比較，相同的堿基用紅色表示，保守堿基用藍色表示，綠色表示堿基間有弱的保守性，可以看出人lamin A蛋白中82位的谷氨酸E在生物進化中具有極高的保守性。
圖5穩定轉染突變型LMNA基因的HEK293細胞與其它組細胞間存在差異。A示轉染野生型LMNA基因的HEK293細胞HE染色照片，B示其電鏡照片，C示轉染突變型LMNA基因的HEK293細胞HE染色照片，D示其電鏡照片。箭頭所示為處于分裂期的細胞。E示四組細胞-HEK293細胞，分別轉染空載體、野生型和突變型LMNA基因的HEK293細胞組中分裂期的細胞占細胞總數的百分比的統計學結果轉染突變型LMNA基因的HEK293細胞組中分裂期細胞占細胞總數的百分比為17.4％±1.65，與其它三組細胞-轉染野生LMNA基因的細胞(5.6％±0.55)，轉染空載體的細胞(5.0％±0.30)和對照細胞(4.9％±0.69)存在顯著性差異(P＜0.01，M±SD，n＝3)。
圖60.8mmol/L的H2O2誘導24h后，轉染突變型LMNA基因的HEK293細胞的凋亡率顯著高于對照細胞和轉染野生型LMNA基因和空載體的HEK293細胞。A，B，C，D分別為對照細胞，空載體轉染，野生型LMNA基因轉染和突變型LMNA基因轉染的HEK293細胞Hochest33342染色后熒光顯微鏡下的形態，箭頭示凋亡細胞。E示轉染突變型LMNA基因的細胞組凋亡率為29.1％±1.24，明顯高于其它三組細胞-轉染野生LMNA基因的細胞(2.6％±0.28)，轉染空載體的細胞(2.4％±0.32)和對照細胞(1.9％±0.31)(P＜0.01，M±SD，n＝3)圖70.8mmol/L的H2O2誘導24h后，四組細胞-對照組細胞和分別轉染突變型、野生型LMNA基因和空載體的HEK293細胞組處于不同細胞周期的細胞數占細胞總數的百分比之間的統計學比較。A示轉染突變型LMNA基因的細胞組G1，G2期細胞百分比分別為37.8％±0.93，15.8％±0.55與其它三組細胞間存在顯著性差異(P＜0.01，M±SD，n＝3)。C示轉染突變型LMNA基因的細胞組S期細胞百分比為46.4％±1.24，明顯高于其它三組細胞(P＜0.01，M±SD，n＝3)。
具體實施例方式
本發明部分基于以下發現LMNA基因中G244A突變或者lamin A蛋白質中E82K突變會導致患者疾病如心臟疾病特別是擴張型心肌病的發生。本發明發現的LMNA基因中G244A突變或者lamin A蛋白質中E82K突變可以用于相關疾病的診斷、預后、治療、對該疾病遺傳易感性的檢測、以及用于這些目的的藥物篩選等。因此，本發明提供用于這些目的和其它目的的化合物、組合物、藥物和方法等。
突變核酸分子一方面，本發明涉及分離的第244-246位核苷酸(如第244位)發生突變如G244A突變的編碼lamin A蛋白質的核酸分子，或者稱突變LMNA核酸分子，或它們的互補鏈或它們的包含至少一個多態性的具有至少10個堿基的片段。由于該突變LMNA基因的第244-246位核苷酸突變，所述lamin A蛋白質具有降低的生物活性或者沒有生物活性。
優選地，所述突變核酸分子來源于動物，優選哺乳動物，更優選靈長類動物，最優選人類。
一種“分離的”LMNA核酸分子是這樣一種核酸分子，它從至少一種污染性核酸分子中被鑒別和分離出來，在LMNA核酸的天然來源中該污染性核酸分子通常與它聯系在一起。分離的LMNA核酸分子以非天然的形式存在或存在于非天然的環境中。因此分離的LMNA核酸分子與存在于天然細胞中的LMNA核酸分子可被區別開來。然而，分離LMNA核酸分子包括在通常表達LMNA的細胞中含有的LMNA核酸分子，在此細胞中，例如，此核酸分子在染色體中的位置不同于其在天然細胞中時的染色體位置。
根據本發明的核酸可包括例如DNA、RNA(如mRNA)、合成核酸、多肽核酸、修飾的核苷酸或它們的混合物。DNA包括cDNA，也包括其對應的基因組DNA。DNA可是單鏈的也可是雙鏈的。構成核酸的核苷酸可通過各種已知的連接方式連接起來，例如酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等，對這些方法的選擇依賴于所要達到的目的，例如抗核酸酶(如RNaseH)、改善體內穩定性等。見例如美國專利5,378,825。
本發明突變核酸分子的一個具體的實施方案是具有第244-246位核苷酸突變(如G244A突變)的GenBank登錄號NM_170707所示的LMNA基因cDNA序列(該序列顯示在SEQ ID NO1中)。在本發明中，LMNA基因的核苷酸編號是按照以下標準進行的以LMNA基因cDNA序列起始密碼子ATG中的A為+1。
SEQ ID NO1的序列如下ATGGAGACCCCGTCCCAGCGGCGCGCCACCCGCAGCGGGGCGCAGGCCAGCTCCACTCCGCTGTCGCCCACCCGCATCACCCGGCTGCAGGAGAAGGAGGACCTGCAGGAGCTCAATGATCGCTTGGCGGTCTACATCGACCGTGTGCGCTCGCTGGAAACGGAGAACGCAGGGCTGCGCCTTCGCATCACCGAGTCTGAAGAGGTGGTCAGCCGCGAGGTGTCCGGCATCAAGGCCGCCTAC AGGCCGAGCTCGGGGATGCCCGCAAGACCCTTGACTCAGTAGCCAAGGAGCGCGCCCGCCTGCAGCTGGAGCTGAGCAAAGTGCGTGAGGAGTTTAAGGAGCTGAAAGCGCGCAATACCAAGAAGGAGGGTGACCTGATAGCTGCTCAGGCTCGGCTGAAGGACCTGGAGGCTCTGCTGAACTCCAAGGAGGCCGCACTGAGCACTGCTCTCAGTGAGAAGCGCACGCTGGAGGGCGAGCTGCATGATCTGCGGGGCCAGGTGGCCAAGCTTGAGGCAGCCCTAGGTGAGGCCAAGAAGCAACTTCAGGATGAGATGCTGCGGCGGGTGGATGCTGAGAACAGGCTGCAGACCATGAAGGAGGAACTGGACTTCCAGAAGAACATCTACAGTGAGGAGCTGCGTGAGACCAAGCGCCGTCATGAGACCCGACTGGTGGAGATTGACAATGGGAAGCAGCGTGAGTTTGAGAGCCGGCTGGCGGATGCGCTGCAGGAACTGCGGGCCCAGCATGAGGACCAGGTGGAGCAGTATAAGAAGGAGCTGGAGAAGACTTATTCTGCCAAGCTGGACAATGCCAGGCAGTCTGCTGAGAGGAACAGCAACCTGGTGGGGGCTGCCCACGAGGAGCTGCAGCAGTCGCGCATCCGCATCGACAGCCTCTCTGCCCAGCTCAGCCAGCTCCAGAAGCAGCTGGCAGCCAAGGAGGCGAAGCTTCGAGACCTGGAGGACTCACTGGCCCGTGAGCGGGACACCAGCCGGCGGCTGCTGGCGGAAAAGGAGCGGGAGATGGCCGAGATGCGGGCAAGGATGCAGCAGCAGCTGGACGAGTACCAGGAGCTTCTGGACATCAAGCTGGCCCTGGACATGGAGATCCACGCCTACCGCAAGCTCTTGGAGGGCGAGGAGGAGAGGCTACGCCTGTCCCCCAGCCCTACCTCGCAGCGCAGCCGTGGCCGTGCTTCCTCTCACTCATCCCAGACACAGGGTGGGGGCAGCGTCACCAAAAAGCGCAAACTGGAGTCCACTGAGAGCCGCAGCAGCTTCTCACAGCACGCACGCACTAGCGGGCGCGTGGCCGTGGAGGAGGTGGATGAGGAGGGCAAGTTTGTCCGGCTGCGCAACAAGTCCAATGAGGACCAGTCCATGGGCAATTGGCAGATCAAGCGCCAGAATGGAGATGATCCCTTGCTGACTTACCGGTTCCCACCAAAGTTCACCCTGAAGGCTGGGCAGGTGGTGACGATCTGGGCTGCAGGAGCTGGGGCCACCCACAGCCCCCCTACCGACCTGGTGTGGAAGGCACAGAACACCTGGGGCTGCGGGAACAGCCTGCGTACGGCTCTCATCAACTCCACTGGGGAAGAAGTGGCCATGCGCAAGCTGGTGCGCTCAGTGACTGTGGTTGAGGACGACGAGGATGAGGATGGAGATGACCTGCTCCATCACCACCACGGCTCCCACTGCAGCAGCTCGGGGGACCCCGCTGAGTACAACCTGCGCTCGCGCACCGTGCTGTGCGGGACCTGCGGGCAGCCTGCCGACAAGGCATCTGCCAGCGGCTCAGGAGCCCAGGTGGGCGGACCCATCTCCTCTGGCTCTTCTGCCTCCAGTGTCACGGTCACTCGCAGCTACCGCAGTGTGGGGGGCAGTGGGGGTGGCAGCTTCGGGGACAATCTGGTCACCCGCTCCTACCTCCTGGGCAACTCCAGCCCCCGAACCCAGAGCCCCCAGAACTGCAGCATCATGTAA注第82位密碼子(第244-246位核苷酸)( AG)以粗體表示，第244位堿基( )加下劃線。
“G244A突變”是指在本發明的核酸分子中與SEQ ID NO1所示序列第244位對應的核苷酸G突變為A。同樣，本發明的核酸序列和氨基酸序列中核苷酸和氨基酸殘基的編號是指與SEQ ID NO1所示序列或其編碼的氨基酸序列相同位置(或編號)對應的核苷酸和氨基酸殘基。
“對應”是指本發明核酸分子或者蛋白質的序列在與參考序列如SEQ ID NO1或者SEQ ID NO2所示序列最佳比對(alignment)后與該參考序列某位置相對的位置。因此，本發明核酸分子或者蛋白質“對應位置”或者“對應核苷酸”或者“對應氨基酸”不一定是與參考序列編號相同的位置、或者核苷酸或者氨基酸。
本發明的“突變核酸分子”或者“突變LMNA基因”涵蓋任何LMNA基因和其片段，只要該核酸分子與LMNA基因cDNA第244-246位核苷酸對應的核苷酸發生突變即可。因此，本發明LMNA基因包括SEQ ID NO1中公開的序列和/或其片段的變體如等位變體和簡并性變體、物種同系物、同源基因。
“第244-246位核苷酸的突變”或者“與LMNA基因cDNA第244-246位核苷酸對應的核苷酸發生突變”包括任何類型的突變，如缺失、添加、插入、重復、替代等，優選替代。突變如替代可以是不改變其編碼的氨基酸，也可以使其編碼的氨基酸發生改變，優選的突變如替代使其編碼的氨基酸發生改變。所述突變如替代還可以在LMNA核酸分子第244-246位核苷酸的任何一個位置(第244、245、246位)發生。在一個優選的例子中，第244-246位核苷酸的突變導致編碼的氨基酸(第82位E(即Glu))的突變(如缺失、添加、插入、重復、替代等，優選替代)，優選地，E82被替代為與K(即Lys)具有類似極性和/或疏水性的氨基酸殘基，如Lys、Arg、His。在一個特別優選實施方案中，第244-246位核苷酸的突變導致E82K突變，如第244位發生突變(如G244A突變或者G244A+G246A)。
“變體”是指與本發明多核苷酸或多肽不同，但保留了其基本性質的多核苷酸或多肽。一般地，變體與本發明多核苷酸或多肽在整體上極為相似，并在許多區域中是一致的。等位變體是指一個基因占據同一個染色體座位的兩個或多個可替代形式中的任意一個。等位變異通過突變自然發生，并可導致種群內的多態現象。基因突變可以是沉默的(在編碼的多肽中沒有變化)，也可編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。多肽的等位變體是基因的等位變體編碼的多肽。
在另一個實施方案中，本發明包括同源核酸序列，其與SEQ IDNO1具有至少70％(優選至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更優選至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性并包含G244A突變的核苷酸序列；本發明多核苷酸或多核苷酸區與另一個序列具有某種“序列同一性”百分數(如80％、85％、90％或95％)是指當比對時兩個序列比較的相同堿基百分數。這種比對(alignment)和百分數同源性或序列同一性可采用本領域已知的軟件程序來確定，所述程序例如當代分子生物學實驗方法(Current Protocols in Molecular Biology)(F.M.Ausubel等編著，1987)Supplement 30，section 7.7.18，Table 7.7.1中所述的程序。優選的比對程序是ALIGN Plus(Scientific andEducational Software，Pennsylvania)，優選使用默認參數。
在另一個實施方案中，本發明包括與SEQ ID NO1或其子序列或互補鏈在低嚴謹條件，更優選中等嚴謹條件，更優選中高嚴謹條件，甚至更優選高嚴謹條件，最優選極高嚴謹條件下下雜交并包含G244A突變的核苷酸序列(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatus，1989，分子克隆實驗手冊(Molecular Cloning，A LaboratoryManual)，第二版，Cold Spring Harbor，紐約)。
在另一個實施方案中，本發明涉及在SEQ ID NO1中存在一個或多個(如至多1、2、3、4、5、10、20、50、70個或者100個)核苷酸插入、缺失和/或替代并包含G244A突變的核苷酸序列。
在另一個實施方案中，本發明涉及前述序列中包含G244A突變的片段。該片段一般長至少約10個核苷酸，例如15個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個，并可以長達100個、150個、200個、500個、或者LMNA基因全長，并包括其中的任何數目。
蛋白質另一方面，本發明還涉及第82位E發生突變如E82K突變的laminA蛋白質。由于第82位E發生突變如E82K突變，所述lamin A蛋白質具有降低的生物活性或者喪失生物活性。
lamin A蛋白質第82位E發生的突變包括任何類型的突變，如缺失、添加、插入、重復、替代等，優選替代。突變如替代可以不改變或者改變氨基酸的極性和疏水性或者二級結構，優選的突變如替代使氨基酸的極性和疏水性或者二級結構發生改變。所述突變優選是E82被替代為與K(即Lys)具有類似極性和/或疏水性的氨基酸殘基，如Lys、Arg、His。在一個特別優選實施方案中，突變導致E82K突變。
“E82K突變”是指在本發明的lamin A蛋白質中與SEQ ID NO2所示序列第82位對應的氨基酸殘基E(谷氨酸，Glu)突變為K(賴氨酸，Lys)。
本發明的“突變lamin A蛋白質”涵蓋任何lamin A蛋白質和其片段，只要該lamin A蛋白質第82位E發生突變(如E82K突變)即可。
在本發明中，“蛋白質”和“多肽”可以互換使用，因此，它們并不受限于長度。
在一個具體實施方案中，本發明所述突變蛋白質具有包含第82位E的突變如E82K突變的SEQ ID NO2的氨基酸序列。
SEQ ID NO2的氨基酸序列METPSQRRATRSGAQASSTPLSPTRITRLQEKEDLQELNDRLAVYIDRVRSLETENAGLRLRITESEEVVSREVSGIKAAY AELGDARKTLDSVAKERARLQLELSKVREEFKELKARNTKKEGDLIAAQARLKDLEALLNSKEAALSTALSEKRTLEGELHDLRGQVAKLEAALGEAKKQLQDEMLRRVDAENRLQTMKEELDFQKNIYSEELRETKRRHETRLVEIDNGKQREFESRLADALQELRAQHEDQVEQYKKELEKTYSAKLDNARQSAERNSNLVGAAHEELQQSRIRIDSLSAQLSQLQKQLAAKEAKLRDLEDSLARERDTSRRLLAEKEREMAEMRARMQQQLDEYQELLDIKLALDMEIHAYRKLLEGEEERLRLSPSPTSQRSRGRASSHSSQTQGGGSVTKKRKLESTESRSSFSQHARTSGRVAVEEVDEEGKFVRLRNKSNEDQSMGNWQIKRQNGDDPLLTYRFPPKFTLKAGQVVTIWAAGAGATHSPPTDLVWKAQNTWGCGNSLRTALINSTGEEVAMRKLVRSVTVVEDDEDEDGDDLLHHHHGSHCSSSGDPAEYNLRSRTVLCGTCGQPADKASASGSGAQVGGPISSGSSASSVTVTRSYRSVGGSGGGSFGDNLVTRSYLLGNSSPRTQSPQNCSIM注E82標有下劃線在一個具體實施方案中，本發明所述突變蛋白質包含或者以下氨基酸序列之一組成(1)包含第82位E的突變如E82K突變的SEQ ID NO2的氨基酸序列；(2)由本發明突變核酸分子編碼的氨基酸序列；(3)與SEQ ID NO2具有至少70％(優選至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更優選至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性并包含E82K突變的氨基酸序列；(4)在SEQ ID NO2中存在一個或多個插入、缺失和/或替代并包含E82K突變的氨基酸序列；(5)前述序列中包含E82K突變的片段。
為了本發明的目的，兩個氨基酸序列之間的同一性程度采用Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)和LASERGENETMMEGALIGNTM軟件(DNASTAR公司，Madison，WI)并使用同一性表和下列多序列對比(multiple alignment)參數來確定空位罰分為10，空位長度罰分(gap penalty)為10。兩兩對比(Pairwise alignment)參數是Ktuple＝1，空位罰分＝3，窗口(windows)＝5，對角線(diagonals)＝5。
優選地，本發明多肽包含SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其等位變體；或它們的片段。在一個更優選的實施方案中，本發明多肽包含SEQID NO.2的氨基酸序列。
SEQ ID NO.2的片段是從該氨基酸序列的氨基和/或羧基末端缺失了一個或多個氨基酸的多肽。
單核苷酸多態性及其檢測本發明還涉及將LMNA基因中的單核苷酸多態性和患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)相關聯的方法。本發明還涉及確定患者對疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的遺傳易感性或者診斷患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的方法，此方法包括檢測LMNA基因中的至少一個單核苷酸多態性。優選地，這種方法包括至少檢測所述樣品中LMNA基因第244位的核苷酸或者lamin A蛋白質第82位的氨基酸，并參照LMNA基因中的多態性確定個體狀態。本發明還涉及在序列中包含在上面所限定位置上的多態性的分離的核酸，涉及能與這種核酸雜交的核酸引物和寡核苷酸探針和涉及包含一種或多種這樣的引物和探針用于檢測LMNA基因中的多態性的診斷試劑盒。
術語“患者”是指動物，優選哺乳動物，更優選靈長類動物，最優選人類。
術語“多態性”廣義上限定為包括已知發生在核苷酸序列中的所有變異，包括插入，缺失，置換和重復序列(包括二重重復)。
根據本發明的上述方法可通過使用用于檢測單核苷酸變異的任何合適方法而得以施用，比如用質譜對PCR產物的直接質量分析，對侵入性切割產物(invasive cleavage product)的直接分析，直接的序列分析，等位基因特異性擴增(即，ARMSTM-等位基因特異性擴增，ARMS指擴增受阻突變體系(amplification refractory mutationsystem))，ALEX(擴增受阻突變系統線性延伸(amplificationrefractory mutation system linear extension)和COPS(競爭性寡核苷酸引發系統)，等位基因特異性雜交(ASH)，寡核苷酸連接試驗(OLA)，侵入者試驗，DNA芯片分析和限制性片段長度多態性(RFLP)(綜述參見基因組研究(Genome Research)，1998年，8卷，769-776頁；Pharmacogenomics，2000年，1卷，95-100頁；人類突變(HumanMutation)，2001年，17卷，475-492頁)。
攜有所述多態性的核酸試樣方便地是從個體中獲得的血液、支氣管肺泡灌洗液、痰、尿液或其它體液或組織樣本。這些樣品可以預先進行純化，例如分離總DNA。可以明了，試樣同樣可以是對應于試樣中序列的核酸序列，也就是說，在等位基因變異分析前，核酸樣品中的全部或一部分區域可先用任何一種方便的技術如聚合酶鏈反應(PCR)或連接酶鏈反應(LCR)擴增。
LMNA基因中的多態性可通過對患者的核酸樣品進行測序和將此序列與對照物比較來確定，或通過PCR擴增不同種族來源的無關個體的DNA中的400-600個堿基對的片段(涵蓋LMNA基因的編碼區和調節區)來確定。這些樣品中的片段可用正向和反向引物測序，多態性可用PolyPhred軟件(經華盛頓大學許可)檢測而變體的等位基因頻率可被確定(人類突變(Human Mutation)，2001年，17卷，243-254頁)。
顯然，對于對本領域技術人員來說有大量的分析方法可被用于檢測在本發明的一個或多個多態位置處變異核苷酸存在與否。一般來說，等位基因變異的檢測需要突變辨別技術，任選地擴增反應和任選地信號生成系統。國際專利申請WO00/06768列出了許多擴增技術和突變檢測技術，其中一些是基于PCR技術的。這些技術可和許多信號生成系統聯合使用，可選的信號生成系統也被列于WO00/06768。
用于檢測等位基因變異的許多現行方法綜述于Nollau等，臨床化學(Clin.Chem.)，1997年，43期，1114-1120頁；在標準教科書例如“突變檢測實驗指南”(Laboratory Protocols for MutationDetection)U.Landegren編輯，牛津大學出版社，1996年和“PCR”第二版Newton & Graham編輯，BIOS Scientific Publishers Limited，1997年。
本發明涉及可被用做檢測LMNA基因中多態性的診斷引物的等位基因特異性核酸引物，該診斷引物能夠與在序列內于LMNA基因第244位包含多態性(例如第244位的G和A或者其反向互補序列)的核酸雜交。
等位基因特異性引物通常與恒定引物一起用于諸如PCR反應等擴增反應中，通過對位于一個特定序列位置處的一個等位基因的選擇性擴增而使等位基因之間得以區分開來，例如用在ARMS 試驗中的引物。等位基因特異性引物的長度優選17-50個核苷酸，更優選大約17-35個核苷酸，最優選大約17-30個核苷酸。
優選地，等位基因特異性引物與待檢測的等位基因完全地相對應，但是也可以考慮其衍生物，其中3’端大約有6到8個核苷酸與待檢測的等位基因對應而不超過10個，比如不超過8，6，4，2或者1個剩余核苷酸在不顯著影響引物特性的情況下可以發生變化。常常在第2和/或第3位(相對于3’端)的核苷酸被錯配以優化差異引物結合和優先僅從正確的等位基因辨別引物延伸。
本發明還涉及用于檢測LMNA基因中的多態性的寡核苷酸探針，該探針能特異地與在序列內包含位于LMNA基因第244位的多態性(例如第244位的G和A或者其反向互補序列)的核酸雜交。
術語“寡核苷酸探針”指長度至少有17個核苷酸的一種核苷酸序列，此序列與部分或全部的人類LMNA基因，特別是表達多態性的人類LMNA基因部分對應。優選長度17到50個核苷酸。一般來說這樣的探針包含與基因中相應的野生型或變體座位完全互補的堿基序列。
然而，如果需要，可以引入一個或多個錯配，前提是寡核苷酸探針的辨別能力不被過度影響。本發明的探針可以攜有一個或多個標記以便于檢測，比如在Moleaular Beacons中。
本發明還包含一種診斷試劑盒，該試劑盒含有具有LMNA基因單核苷酸多態性的一種或多種核酸引物和/或一種或多種寡核苷酸探針，所述多態性選自于LMNA基因第244位的G和A，以及它們的反向互補序列。
在一些實施方案中，一種組合物含有用于同時探測兩個或更多個多態性位點的寡核苷酸身份的兩個或更多個不同標記的基因分型寡核苷酸。也可考慮含有兩套或更多套等位基因特異性引物對以允許同時靶向和擴增含多態性位點的兩個或更多個區域的引物組合物。
本發明的LMNA基因分型寡核苷酸也可以固定在固體表面或在固體表面合成，如芯片、珠或玻片(如見WO 98/20020和WO 98/20019)。這種固定的基因分型寡核苷酸可以用于各種多態性檢測試驗，包括但不限于探針雜交和聚合酶延伸試驗。本發明的固定的LMNA基因分型寡核苷酸可以包括為同時快速篩選DNA樣品在多個基因中的多態性而設計的有序寡核苷酸陣列。
本發明等位基因特異性寡核苷酸引物優選具有與特定SNP的僅一種核苷酸互補的3’末端核苷酸，或優選地3’倒數第二個核苷酸，由此只有存在含該核苷酸的等位基因時其才可以用作聚合酶介導的延伸反應的引物。與編碼鏈或非編碼鏈雜交的等位基因特異性寡核苷酸引物包括在本發明中。使用本領域技術人員已知的技術可以開發檢測LMNA基因多態性的ASO引物。
本發明其它基因分型寡核苷酸與位于這里所鑒定的新多態性位點之一下游一個至幾個核苷酸處的靶區域雜交。這種寡核苷酸可用于聚合酶介導的引物延伸方法中以檢測這里所描述的新多態性之一，因此這種基因分型寡核苷酸這里稱作“引物延伸寡核苷酸”。在優選實施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是與多態性位點緊臨的核苷酸互補的脫氧核苷酸。
在另一個實施方案中，本發明提供了包括包裝在分開容器中的至少兩個基因分型寡核苷酸的試劑盒。該試劑盒也可以含有包裝在分開容器中的其它成分如雜交緩沖液(此時寡核苷酸待用作探針)。可供選擇地，當寡核苷酸待用于擴增靶區域時，該試劑盒可以含有包裝在分開容器中的聚合酶和用于聚合酶介導的引物延伸如FCR的經優化反應緩沖液。
上述寡核苷酸組合物和試劑盒在個體LMNA基因的基因分型和/或單元型分型方法中有用。
本發明還涉及能夠特異識別lamin A蛋白質E82K突變的抗體。所述抗體可以是單克隆抗體或者多克隆抗體本發明還涉及包含本發明突變核酸分子的載體。所述載體可以是表達載體或者克隆載體。優選地，所述突變核酸分子與控制所述突變核酸分子在目的宿主細胞中表達的調控序列可操作地連接。
本發明還涉及包含本發明的突變核酸分子或者載體的細胞(包括動物細胞、植物細胞和微生物細胞)或者生物體，例如非人動物，優選哺乳動物，更優選試驗動物。
本發明還涉及組合物，其包含本發明的突變核酸分子或者蛋白質。
本發明還涉及治療或者預防患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的方法，所述患者的LMNA基因第244位的G發生突變(如G244A突變)或者lamin A蛋白質第82位E發生突變(如E82K突變)，包括向所述患者給予正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白質。
本發明還涉及在患者中矯正LMNA基因突變的方法，所述患者的LMNA基因第244位的G發生突變(如G244A突變)或者lamin A蛋白質第82位E發生突變(如E82K突變)，所述方法包括向所述患者給予正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白質。
用正常的LMNA基因來進行基因治療可以采用本領域已知的任何方法進行，這些方法本身對于本發明不是關鍵的。本領域有多種基因治療方法，這些方法的具體細節可參考各種相關試驗手冊或者其它文獻。
本發明還涉及正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白質在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或者預防患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)，所述患者的LMNA基因第244位的G發生突變(如G244A突變)或者lamin A蛋白質第82位E發生突變(如E82K突變)。
本發明還涉及含有正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白質的藥物組合物。所述藥物組合物可用于治療或者預防患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)，所述患者的LMNA基因第244位的G發生突變(如G244A突變)或者lamin A蛋白質第82位E發生突變(如E82K突變)。
本發明還涉及診斷患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的方法，所述方法包括檢測所述患者的LMNA基因中第244位G突變如G244A突變的存在或者lamin A蛋白質中第82位E突變如E82K突變的存在。
本發明還涉及確定患者對疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的遺傳易感性的方法，所述方法檢測所述患者的LMNA基因中第244位G突變如G244A突變的存在或者lamin A蛋白質中第82位E突變如E82K突變的存在。
檢測單核苷酸突變和氨基酸突變的技術是本領域已知的，并在本文中有描述。本發明的診斷和檢測方法可以采用任何這些技術。
本發明還涉及檢測所述患者的LMNA基因中第244位G突變如G244A突變的存在或者lamin A蛋白質中第82位E突變如E82K突變的存在的物質在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于診斷患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)或者用于確定患者對疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的遺傳易感性。
在一個具體實施方案中，所述物質選自本發明的突變核酸分子；能夠特異識別lamin A蛋白質E82K突變的抗體；和能夠特異識別LMNA基因G244A突變的引物或者探針或者限制性內切酶；以及用于檢測本發明單核苷酸多態性的任何其它試劑。
本發明還涉及分析從患者獲得的離體生物樣品的方法，包括檢測所述樣品中LMNA基因第244位G突變如G244A突變的存在或者lamin A蛋白質第82位E突變如E82K突變的存在。優選地，所述方法還包括確定所述患者對疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的遺傳易感性或者診斷患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)。
本發明還涉及分析從患者獲得的離體生物樣品或者核酸樣品的基因型的方法，包括檢測所述樣品中LMNA基因第244位的多態性(如G244A突變)或者lamin A蛋白質第82位的多態性(如E82K突變)。優選地，所述方法還包括根據所述多態性確定所述患者對疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的遺傳易感性或者診斷患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)。
在上述診斷疾病、確定遺傳易感性、分析樣品和分析基因型的方法中，當LMNA基因第244位G發生突變，尤其是G244A突變，或者lamin A蛋白質第82位E發生突變，尤其是E82K突變時，指示患者對疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)具有遺傳易感性(如果患者沒有可檢測/可觀察的疾病癥狀)，或者患者可能患有疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)(如果患者出現可檢測/可觀察的疾病癥狀)。
本發明還涉及篩選或者評價用于預防或者治療擴張型心肌病的藥物的方法，包括將候選物質(包括純化的或者未純化的化合物、組合物或者提取物等)與包含本發明核酸分子或者本發明蛋白質或者本發明載體的細胞、組織、或者器官接觸，并檢測lamin A蛋白質的活性或者指示擴張型心肌病狀況的指標；或者將候選物質給予包含本發明核酸分子的轉基因非人動物，并檢測lamin A蛋白質的活性或者檢查擴張型心肌病的癥狀或者指示擴張型心肌病狀況的指標。
如果所述細胞或者動物中檢測lamin A蛋白質的活性或者檢查擴張型心肌病的癥狀或者指示擴張型心肌病狀況的指標改善，指示候選物質具有預防或者治療擴張型心肌病的潛力。
一般地，本發明涉及1.一種分離的LMNA核酸分子或其片段，它具有第244-246位核苷酸的突變，特別是第244位G的突變，如G244A突變。
2.項目1的核酸分子，其中，所述核酸分子來源于動物，優選哺乳動物，更優選靈長類動物，最優選人類。
3.前述項目任一項的核酸分子，其中，所述核酸分子是DNA(特別是cDNA和基因組DNA)。
4.前述項目任一項的核酸分子，其中，所述核酸分子包含以下核苷酸序列之一(1)包含G244A突變的SEQ ID NO1的核苷酸序列；(2)與SEQ ID NO1具有至少70％(優選至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更優選至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性并包含G244A突變的核苷酸序列；(3)與SEQ ID NO1在嚴緊條件下雜交并包含G244A突變的核苷酸序列；
(4)在SEQ ID NO1中存在一個或多個插入、缺失和/或替代并包含G244A突變的核苷酸序列；(5)前述序列中包含G244A突變的片段；和(6)前述序列的簡并序列和互補序列。
5.包含第82位E的突變如E82K突變的lamin A蛋白質。
6.項目5的蛋白質，其中，所述蛋白質來源于動物，優選哺乳動物，更優選靈長類動物，最優選人類。
7.前述項目任一項的蛋白質，其中，所述蛋白質包含以下氨基酸序列之一(1)包含E82K突變的SEQ ID NO2的氨基酸序列；(2)由項目1-4任一項的核酸分子編碼的氨基酸序列；(3)與SEQ ID NO2具有至少70％(優選至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更優選至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性并包含E82K突變的氨基酸序列；(4)在SEQ ID NO2中存在一個或多個插入、缺失和/或替代并包含E82K突變的氨基酸序列；(5)前述序列中包含E82K突變的片段。
8.能夠特異識別lamin A蛋白質E82K突變的抗體。
9.包含項目1-4任一項的核酸分子的載體。
10.包含項目1-4任一項的核酸分子或者項目9的載體的細胞(包括動物細胞、植物細胞和微生物細胞)或者生物體，優選試驗動物。
11.組合物，其包含項目1-4任一項的核酸分子或者5-7任一項的蛋白質。
12.用于確定LMNA第244位多態性位點的遺傳多態性模式的工具。
13.項目12的工具，它是LMNA基因第244位多態性分型寡核苷酸，優選是等位基因特異性核酸引物，能夠檢測LMNA基因第244位的多態性(例如第244位的G和A或者其反向互補序列)，和用于檢測LMNA基因中的多態性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有LMNA基因第244位多態性(例如第244位的G和A或者其反向互補序列)的核酸雜交。
14.根據項目13的工具，其中寡核苷酸探針的長度為17-50個核苷酸。
15.包含一種或多種項目13定義的LMNA基因第244位多態性分型寡核苷酸的診斷試劑盒。
16.治療或者預防患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的方法，所述患者的LMNA基因第244位的G發生突變(如G244A突變)或者lamin A蛋白質第82位E發生突變(如E82K突變)，所述方法包括向所述患者給予正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白質。
17.在患者中矯正LMNA基因突變的方法，所述患者的LMNA基因第244位的G發生突變(如G244A突變)或者lamin A蛋白質第82位E發生突變(如E82K突變)，所述方法包括向所述患者給予正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白質。
18.正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白質在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或者預防患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)，所述患者的LMNA基因第244位的G發生突變(如G244A突變)或者lamin A蛋白質第82位E發生突變(如E82K突變)。
19.含有正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白質的藥物組合物。
20.診斷患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品的LMNA基因中第244位G突變如G244A突變的存在或者lamin A蛋白質中第82位E突變如E82K突變的存在。
21.確定患者對疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的遺傳易感性的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品的LMNA基因中第244位G突變如G244A突變的存在或者lamin A蛋白質中第82位E突變如E82K突變的存在。
22.分析從患者分離的離體生物0樣品的方法，包括檢測所述樣品中LMNA基因第244位G突變如G244A突變的存在或者lamin A蛋白質第82位E突變如E82K突變的存在。
23.項目22的方法，還包括確定所述患者對疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的遺傳易感性或者診斷患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)。
24.項目20至23任一項的方法，其中使用包括選自以下的差異核酸分析技術的試驗用質譜對PCR產物直接質量分析、對侵入性切割產物直接分析、直接序列分析、等位基因特異性擴增、等位基因特異性雜交、寡核苷酸連接試驗、侵入者試驗、DNA芯片分析和限制性片段長度多態性。
25.篩選或者評價用于預防或者治療擴張型心肌病的藥物的方法，包括將候選物質與包含項目1-4的核酸分子或者項目5-7的蛋白質或者本發明的載體的細胞、組織、或者器官接觸，并檢測lamin A蛋白質的活性或者指示擴張型心肌病狀況的指標；或者將候選物質給予包含項目1-4的核酸分子的轉基因非人動物，并檢測lamin A蛋白質的活性或者檢查擴張型心肌病的癥狀或者指示擴張型心肌病狀況的指標。
26.項目25的方法，所述細胞、組織、器官或動物個體是通過基因敲除或敲入的方法而得到的。
27.一種微陣列，其中包含項目13所定義的LMNA基因第244位多態性分型寡核苷酸。
28.項目27的微陣列，它是DNA芯片的形式。
29.檢測生物學樣品的LMNA基因中第244位G突變如G244A突變的存在或者lamin A蛋白質中第82位E突變如E82K突變的存在的物質在制備診斷試劑的用途，所述診斷試劑用于診斷患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)或者用于確定患者對疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的遺傳易感性。
30.項目29的用途，其中所述物質選自項目1-4的核酸分子；能夠特異識別lamin A蛋白質E82K突變的抗體；和項目12-14任一項的工具，如能夠特異識別LMNA基因G244A突變的引物或者探針或者限制性內切酶。
實施例一、研究對象和目的研究對象在山西省長治市采集的一個擴張型心肌病伴有房室傳導阻滯的家系，共50名成員。正常研究對照60例為性別、年齡匹配的健康人。研究目的(1)對此擴張型心肌病家系的50名成員進行Lamin A/C(LMNA)基因突變掃描，尋找突變位點。(2)將野生型及突變型LMNA基因轉入HEK293細胞，篩選穩定轉染株，光學和電子顯微鏡觀察細胞變化。(3)過氧化氫刺激野生和突變型LMNA基因及空載體穩定轉染的HEK293細胞株，流式細胞儀檢測三組細胞凋亡率及細胞周期的變化。
擴張型心肌病診斷標準(WHO/ISFC 1995年公布)1.左室射血分數＜45％2.左室舒張末期內徑＞2.7cm/m2或左心室舒張末內徑≥55mm3.還需排除下列疾病高血壓；冠狀動脈性心臟病；長期飲酒史；持續、快速的室上性心律失常；系統性疾病；心包疾病；先天性心臟病；肺心病二、實驗材料(一)、主要試劑SDS華美生物工程公司蛋白酶E上海生物工程技術有限公司10×PCR緩沖液 TaKaRa生物技術有限公司dNTP TaKaRa生物技術有限公司Taq酶 TaKaRa生物技術有限公司PCR引物上海生物工程技術有限公司核酸分子參照物(DL2000) TaKaRa生物技術有限公司瓊脂糖 華美生物工程公司溴化乙錠 華美生物工程公司丙烯酰胺 華美生物工程公司甲叉丙烯酰胺 華美生物工程公司過硫酸銨(APS) 華美生物工程公司亞基乙二胺(TEMED) 華美生物工程公司測序用劑 美國Perkin Elmer胎牛血清 美國Hyclone公司DMEM培養基 美國Gibco BRL公司HiSpeed Plasmid Midi Kit 德國QIAGEN公司Lipofectamin2000 美國Invitrogen公司Hoechst 33342 美國sigma公司其它試劑雙蒸水、無水乙醇、氯化鈉、氯仿、Tris、EDTA、硼酸、氫氧化鈉、甲醛、冰醋酸、溴酚藍、二甲苯藍、甘油、氯化銨、碳酸氫銨、醋酸鈉(二)、主要實驗儀器pH計(Φ71)美國Beckman1/1000電子分析天平德國Sartorius電熱恒溫水浴箱(WS2-261-79)北京醫療設備廠電磁攪拌器(JB-3) 上海雷磁儀器廠漩渦振蕩器江蘇國華儀器廠超純水裝置低溫離心機(RC SC) 美國Sorvall
微型室溫離心機(Z231M)德國Hermle高速冷凍離心機(Z360K)德國Hermle-70℃深低溫冰箱(8325)美國Forma冰凍干燥機(愛德華EF-4) 美國Savant紫外分光光度計(UV-1206) 美國Bio-Rad穩壓穩流定時電泳儀(DYY-III6) 北京六一儀器廠水平電泳槽(Mupid-2) Cosmo.BIO公司垂直電泳槽 北京六一儀器廠紫外成像掃描儀 美國Bio-Rad微機圖象處理系統(ASTVision4I)Cosmo.BIO公司攝相儀(BIO-RAD Gel Doc1000) Cosmo.BIO公司微量移液器 法國GilsonPCR儀美國Perkin Elmer(GeneAmp PCR System9700)PCR儀(PTC-200) 美國MJ ResearchPCR儀(T3-Thermolycler) 德國Biometra測序儀(ABI PRISM 377)美國Perkin ElmerCO2細胞培養箱 日本SANYO公司倒置光學顯微鏡 日本Nikon公司流式細胞儀 美國BD公司電子顯微鏡 德國西門子公司熒光顯微鏡 日本Nikon公司(三)、主要溶液配方(1)5xTBE54克Tris，0.5M EDTA(pH＝8.0)20ml，硼酸27.5克，加蒸餾水定容至1000ml。
(2)低滲溶血液氯化銨7.01克，碳酸氫鉀0.07克，加蒸餾水定容至1000ml。
(3)SE醋酸鈉1.36克，氯化鈉4.38克，加蒸餾水400ml，冰醋酸調PH至5.6，定容至500ml。
(4)蛋白酶E10mg/ml(5)TE1M Tris-鹽酸(pH＝8)1ml，0.5M EDTA(pH＝8.0)0.02ml，加蒸餾水至100ml。
三、實驗方法；1.取外周血，分離白細胞(1)取患者肘靜脈血5ml，EDTA抗凝，2500rpm離心10min。
(2)小心吸取上層血漿，分裝。
(3)在血細胞中加入3倍體積的溶血液，搖勻，冰浴15min。
(4)2500rpm離心10min，棄上清。
(5)加入10ml溶血液，搖勻，冰浴15min。
(6)3000rpm離心10min，棄上清。
(7)倒置離心管，流干殘液。
(8)得白細胞，-80℃凍存。
2.從白細胞中提取基因組DNA(1)取白細胞，加4.5ml SE，使勁吹打，混勻。
(2)沿管壁加入0.5ml的10％SDS。
(3)加蛋白酶E 50μl。
(4)首尾輕搖10min，混勻。
(5)37℃水浴過夜。
(6)第二天取出，沿管壁加3ml飽和NaCl，迅速手搖15s，使蛋白變性析出。
(7)4000rpm離心10min。
(8)取上清，轉入另一管中，加等體積的三氯甲烷，搖10min，混勻。
(9)2500rpm離心10min。
(10)取上清，轉入另一管中，加等體積的三氯甲烷，搖10min，混勻。
(11)2500rpm離心10min。
(12)取上清，轉入50ml管中，加3倍體積無水乙醇。
(13)首尾輕搖，見DNA絮狀沉淀析出。
(14)將DNA挑至管壁，75％乙醇洗滌2遍。
(15)將DNA挑至0.5ml管中，凍干。
(16)加TE 300μl，使DNA溶解，紫外分光光度計測OD值定量，4℃保存。
3.Lamin A/C基因的PCR擴增(1)PCR擴增條件(引物及擴增條件根據文獻設計)。
基因組序列來自Genebank data base(登陸號為L12399，L12400，L12401)
(2)PCR反應基本體系(50μl)引物(濃度20pmol/μl)1μl10×buffer 5μlTaqDNA聚合酶(2u/μl)1μldNTP(10mM) 1μl人基因組DNA 1μlddH2O 41μl4.PCR產物純化(1)醋酸氨∶乙醇按1∶5的比例(體積比)混勻；(2)將PCR產物按1∶6的比例與醋酸氨乙醇混合物(體積比)混勻；(3)-70℃放置30min；(4)4000rpm離心10min；(5)14,000rpm離心15min；(6)棄上清；(7)75％乙醇清洗；(8)14000rpm離心5min；棄上清；(9)等管中乙醇完全揮發后，加入TE 20μl溶解。
5.測序反應
(1)反應體系(20μl)BigDyeTM4μlBigDyeTMBuffer 2μl 引物(同PCR擴增引物) 10pmol/μl(2)反應條件(根據引物的退火溫度而定)94℃4min 72℃4min4℃∞(3)測序產物的純化20μl產物中加25μl醋酸銨和125μl乙醇，置-70℃1小時，14,000rpm離心10分鐘，棄上清，加75％的乙醇100μl，14,000rpm離心5分鐘，棄上清，95℃1分鐘烤干，加入2μl loading buffer，混勻，94℃變性5分鐘，然后迅速置于冰上。
(4)將純化后的測序反應產物在ABI PRISM377自動測序儀上測序。
(5)用GeneJockey、AssemblyLIGNTM、Sequencing Analysis 3.4軟件閱讀及核對測序圖6.野生型及突變型LMNA基因載體的構建含有野生LMNA的pTracer-CMV載體由美國癌癥及發展生物學實驗室的Colin L.Strwart教授惠贈，委托基因公司將LMNA基因的第244位堿基由G突變為A，即第82位氨基酸由谷氨酸變為賴氨酸。
7.細胞培養HEK293細胞含10％胎牛血清(Hyclone，Cat.No.SH30071.02)的DMEM培養基(Gibco，Cat.No.12800-017)，加入100μg/ml的青霉素(華北制藥有限公司)和100μg/ml的鏈霉素(華北制藥有限公司)，5％二氧化碳、37℃孵箱孵育。
8.細胞轉染實驗步驟完全按照Invitrogen公司實驗手冊進行，細胞分為三組，分別為野生組，突變組和空載體組，每組設三個平行的樣品，轉染前一天將HEK293細胞傳入6孔細胞培養板，當細胞覆蓋率在80％時進行轉染，每孔分別加入3μg的含野生型、突變型LMNA及空載體的質粒和6μl LipofectAMINE(Invitrogen)，并在每孔中加入8μlzeocin(100mg/ml Invitrogen)篩選，1個月后得到穩定克隆。
9.光學和電子顯微鏡觀察三組細胞分別用HE染色后光學顯微鏡下觀察細胞大體形態差異，常規方法處理細胞后電子顯微鏡下觀察細胞超微結構的差異。
10.凋亡和細胞周期研究三組細胞在用H2O2刺激的前一天用無血清的DMEM替換原培養基，24小時后，分別用終濃度為0.8mmol/L的3％H2O2刺激24小時，棄去培養基，用生理鹽水漂洗細胞兩次，70％的冰乙醇固定細胞24小時后流式細胞儀檢測三組細胞凋亡率和細胞周期間的差異，同時用Hoechst 33342染色活細胞后熒光顯微鏡下觀察并照相。
實施例1對擴張型心肌病家系的50名成員進行Lamin A/C(LMNA)基因突變掃描，尋找突變位點。
LMNA基因篩查結果測序證實該擴張型心肌病家系(圖1)中4名患者及4名表型正常的患者子女(12-28歲，無癥狀)(表2)的LMNA基因第244位核苷酸發生G→A轉換，使谷氨酸(Glu)變為賴氨酸(Lys)(圖2)。正常對照組皆未發現異常。
此突變位點位于LMNA基因的L1和1B區域的交界處，而該點在生物的進化中是非常保守的，提示該位點可能在蛋白功能中有關鍵性的作用(圖3，4)。
實施例2將野生型及突變型LMNA基因轉入HEK293細胞，篩選穩定轉染株，光學和電子顯微鏡觀察細胞變化。
光鏡和電鏡觀察到轉染野生型和突變型LMNA基因的HEK293細胞間存在差異光鏡下轉染野生型LMNA基因的細胞和轉染突變型LMNA基因的細胞HE染色后，轉染突變型LMNA基因的HEK293細胞分裂增殖旺盛，核分裂相明顯增多，細胞趨于幼稚化，處于分裂期的細胞占細胞總數的百分比為17.4％±1.65，與其它三組細胞-轉染野生LMNA基因的細胞(5.6％±0.55)，轉染空載體的細胞(5.0％±0.30)和對照細胞(4.9％±0.69)存在顯著性差異(P＜0.01，M±SE，n＝3)(圖5A、5C、5E).電鏡下轉染野生型LMNA基因的細胞的細胞膜結構完全分化，可見絨毛，胞漿內細胞器豐富，可見線粒體、內質網及大量核糖體，而在轉染突變型LMNA基因的HEK293細胞中細胞膜結構分化不清，無絨毛，胞漿內細胞器種類完整但數量少，缺少核糖體，細胞明顯分化不完全(圖5B、5D)實施例3過氧化氫刺激野生和突變型LMNA基因及空載體穩定轉染的HEK293細胞株，流式細胞儀檢測三組細胞凋亡率及細胞周期的變化H2O2誘導的細胞凋亡實驗中，轉入突變LMNA基因的HEK293細胞的凋亡率明顯高于轉入野生型LMNA基因的細胞，且細胞周期發生改變0.8mmol/L的H2O2誘導24h后，轉入突變LMNA基因的HEK293細胞組凋亡率為29.1％±1.24，明顯高于其它三組細胞-轉染野生LMNA基因的細胞(2.6％±0.28)，轉染空載體的細胞(2.4％±0.32)和對照細胞(1.9％±0.31)(P＜0.01，M±SD，n＝3)(圖6).同時，轉入突變LMNA基因的HEK293細胞組處于不同細胞周期G1，G2和S期的細胞占細胞總數的百分比與其它三組細胞也存在顯著性差異(圖7A，7B).
表2LMNA/C基因突變患者的臨床資料
權利要求
1.一種分離的LMNA核酸分子或其片段，它具有第244-246位核苷酸的突變，特別是第244位G的突變，如G244A突變。
2.前述權利要求任一項的核酸分子，其中，所述核酸分子包含以下核苷酸序列之一(1)包含G244A突變的SEQ ID NO1的核苷酸序列；(2)與SEQ ID NO1具有至少70％(優選至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更優選至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性并包含G244A突變的核苷酸序列；(3)與SEQ ID NO1在嚴緊條件下雜交并包含G244A突變的核苷酸序列；(4)在SEQ ID NO1中存在一個或多個插入、缺失和/或替代并包含G244A突變的核苷酸序列；(5)前述序列中包含G244A突變的片段；和(6)前述序列的簡并序列和互補序列。
3.包含第82位E的突變如E82K突變的lamin A蛋白質。
4.前述權利要求任一項的蛋白質，其中，所述蛋白質包含以下氨基酸序列之一(1)包含E82K突變的SEQ ID NO2的氨基酸序列；(2)由權利要求1-4任一項的核酸分子編碼的氨基酸序列；(3)與SEQ ID NO2具有至少70％(優選至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、更優選至少90％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％)同一性并包含E82K突變的氨基酸序列；(4)在SEQ ID NO2中存在一個或多個插入、缺失和/或替代并包含E82K突變的氨基酸序列；(5)前述序列中包含E82K突變的片段。
5.用于確定LMNA第244位多態性位點的遺傳多態性模式的工具。
6.權利要求5的工具，它是LMNA基因第244位多態性分型寡核苷酸，優選等位基因特異性核酸引物，能夠檢測LMNA基因第244位的多態性(例如第244位的G和A或者其反向互補序列)，和用于檢測LMNA基因中的多態性的寡核苷酸探針，其能特異地與具有LMNA基因第244位多態性(例如第244位的G和A或者其反向互補序列)的核酸雜交。
7.包含一種或多種權利要求6定義的LMNA基因第244位多態性分型寡核苷酸的診斷試劑盒。
8.正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白質在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療或者預防患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)，所述患者的LMNA基因第244位的G發生突變(如G244A突變)或者lamin A蛋白質第82位E發生突變(如E82K突變)。
9.診斷患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)或者確定患者對疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的遺傳易感性的方法，所述方法包括檢測來自所述患者的樣品的LMNA基因中第244位G突變如G244A突變的存在或者lamin A蛋白質中第82位E突變如E82K突變的存在。
10.治療或者預防患者疾病(如心臟疾病特別是擴張型心肌病)的方法，所述患者的LMNA基因第244位的G發生突變(如G244A突變)或者lamin A蛋白質第82位E發生突變(如E82K突變)，所述方法包括向所述患者給予正常的LMNA基因或者正常的lamin A蛋白質。
全文摘要
本發明涉及將LMNA基因中的單核苷酸多態性和患者心臟疾病特別是擴張型心肌病相關聯的方法。本發明還涉及確定患者對心臟疾病特別是擴張型心肌病的遺傳易感性或者診斷患者心臟疾病特別是擴張型心肌病的方法，此方法包括檢測LMNA基因中的至少一個單核苷酸多態性，特別是LMNA基因第244位核苷酸的多態性(如G244A)或者laminA蛋白質第82位氨基酸的突變。本發明還涉及在序列中包含在上面所限定位置上的多態性的分離的核酸，能與這種核酸雜交的核酸引物和寡核苷酸探針和包含一種或多種這樣的引物和探針用于檢測LMNA基因中的多態性的診斷試劑盒。本發明還涉及擴張型心肌病的治療方法。
文檔編號C12Q1/68GK1824776SQ20051005199
公開日2006年8月30日 申請日期2005年2月23日 優先權日2005年2月23日
發明者惠汝太, 王虎, 鄭維越, 陳敬洲, 宋曉東, 甄一松, 石毅 申請人:中國醫學科學院阜外心血管病醫院