專利名稱：默諾霉素的純化方法
技術領域：
本發明涉及默諾霉素的純化方法研究，使用本發明方法可以從微生物發酵產物中制備高純度的默諾霉素。
背景技術：
默諾霉素(moenomycin)，又名黃霉素，斑伯霉素，1955年由Lindetr從Streptomycesbambergiensis發酵產物中分離得到(K.H.Wallhausser，G.Nesemann，P.Prave，and A.Steigler，Moenomycin，a New Antibiotic Fermentation and Isolation，Farbwerke Hoechst，AG.，Frankfart amMain，Germany)。外觀為白色無定型粉末，易溶于水、甲醇、二甲基甲酰胺等。
默諾霉素主要有五個組分，即A，A12，C1，C3和C4，以A為主，含量超過50％，五個組分均有類似的抗菌活性。默諾霉素的毒性小，口服給藥后不被消化道吸收，24小時后幾乎全部從糞便中排出，無殘留。目前主要作為動物生長促進劑使用。默諾霉素在很低劑量下即可顯著促進動物生長，提高飼料的轉化率。作為促動物生長的飼料添加劑，在我國已使用多年，是至今仍被歐共體批準使用的少數抗生素之一。尤其最近發現默諾霉素可控制幽門螺旋桿菌感染，而幽門螺旋桿菌感染是人類胃炎和胃潰瘍的主要原因，專利US6077830報道，默諾霉素的鉍鹽適于治療和預防胃病，因此默諾霉素也可以人類用藥。
從微生物發酵的菌絲體中純化默諾霉素，國內尚無該技術。國外專利主要是關于默諾霉素A的純化方法。專利GB1068639和DE1236726報道，應用纖維素基質的離子交換劑純化默諾霉素，但纖維素載體耐壓較差，導致該純化方法大量制備時缺乏實用性。德國專利1617466和美國專利5986089應用陰離子交換樹脂為吸附劑，采用線性梯度洗脫，洗脫液為緩沖液加有機溶劑如異丙醇，溶劑用量大，且無法回收使用。另外，由于使用緩沖液如磷酸鹽、檸檬酸鹽等，洗脫下來的含有默諾霉素的流份需用中性樹脂進一步脫鹽。默諾霉素屬磷酸多糖類抗生素，水溶液濃縮非常困難，脫鹽后的水溶液需冷凍干燥。這樣的實驗室方法限制默諾霉素的大量制備。
默諾霉素五個主要組分的結構式見圖1、圖2。
發明內容
本發明提供一種溶劑用量小且易于回收，分離過程簡單，提取得率高，產品純度高的從微生物發酵產物中制備默諾霉素的方法。
本發明的技術方案是，首先對發酵產物進行前處理，過濾發酵液，收集菌絲體，用極性溶劑從菌絲體中提取抗生素，然后對粗提物應用不同的層析色譜法，去除雜質，脫色，分離和純化默諾霉素。
提取菌絲體中的抗生素，可以采用超聲提取或攪拌提取。極性溶劑選擇低級脂肪醇或不同濃度的低級脂肪醇水溶液，例如甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇等。提取液濃縮回收溶劑，得到粗提物。
粗提物在柱層析純化之前，可以先用有機溶劑萃取，加以預純化。粗提物先以弱酸性水溶液溶解，萃取選擇弱極性有機溶劑如石油醚、乙醚等去雜質，也可以選擇極性溶劑如正丁醇萃取，得到正丁醇萃取物，即抗生素粗品。
以不同的層析法將抗生素粗品純化，本發明首次應用硅膠減壓柱層析。將抗生素粗品中默諾霉素與其它非極性或弱極性雜質分離，選擇低級脂肪醇的堿溶液作為洗脫劑，改善柱層析拖尾情況，既提高分離效率，又節省溶劑。應用活性炭或硅酸鎂等吸附劑脫色。通過反相色譜法使得與默諾霉素理化性質相近的其它類似物分離。洗脫劑選擇常用的甲醇、乙腈和水，反相色譜填料優選Rp-8或Rp-18，且填料可重復使用。
本發明根據默諾霉素的理化性質及雜質的情況，應用多種層析方法，有效去除雜質。純化默諾霉素過程中每種層析方法針對性強，有效成分提取得率高。應用本發明提供的方法制備默諾霉素，產品顏色為白色，產品純度達到99％以上，且默諾霉素五個主要組分的相對比例恒定。
具體實施例方式實施例1發酵產物處理將發酵培養液10升過濾，得1000g(濕重)菌絲體，加入2000ml 50％甲醇，浸泡菌絲體，超聲提取30分鐘，過濾，菌絲體用50％甲醇重復提取一次，合并提取液，減壓濃縮去除甲醇。
剩余水溶液約2000ml加10％硫酸，調節pH值至2.5～3.0，加入等體積正丁醇，萃取4次，合并正丁醇液，減壓濃縮至干，稱重29g，默諾霉素的含量為50％(HPLC法測定)。
實施例2硅膠減壓柱層析法分離默諾霉素上述抗生素粗品8.0g，經20g硅膠拌樣，干法上240g硅膠裝填的減壓柱(φ6.5×20)，以正丁醇/2M氨水溶劑系統進行梯度洗脫，收集溶劑配比為8∶2的流份600ml，溶劑配比為8∶3的流份共1800ml，合并流份，減壓濃縮得粗品4.4g，默諾霉素的含量為85％(HPLC法測定)。
實施例3硅酸鎂柱層析法脫色上述粗品9.0g經18g硅酸鎂拌樣，濕法上140g硅酸鎂裝填的層析柱(φ2.5×55)，以甲醇洗脫，洗脫液2500ml，減壓濃縮回收溶劑，得到粗品5.2g，默諾霉素的含量為95.2％(HPLC法測定)。
實施例4反相柱層析純化默諾霉素默諾霉素粗品2.6g，以20％甲醇水溶液溶解，直接加至200gRp-18裝填的層析柱(φ2.5×50)，依次以不同濃度的甲醇溶液洗脫，收集含有默諾霉素的流份減壓濃縮，得到默諾霉素純品1.55g(含量＞99％，HPLC法測定)。
圖1默諾霉素五個主要組分結構式的基本母核。
圖2表示圖1中取代基R1、R2的結構。
權利要求
1.制備默諾霉素的方法，該方法首先通過產生默諾霉素的微生物的發酵，對發酵產物進行有機溶劑提取獲得粗提物、對粗提物進行萃取，隨后正相色譜和反相色譜層析法相結合，分離和純化默諾霉素。
2.權利要求1所述的方法，有機溶劑提取使用超聲提取或攪拌提取，有機溶劑選擇低級脂肪醇或不同濃度的低級脂肪醇水溶液。
3.權利要求1或2所述的方法，其中有機溶劑選自甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇等。
4.權利要求1或2所述的方法，其中在柱層析色譜前，先通過極性溶劑萃取粗提物。
5.權利要求4所述的方法，其中極性溶劑選自正丁醇、石油醚或乙醚。
6.權利要求1或2所述的方法，正相色譜法包括硅膠加壓柱層析色譜法和減壓柱層析色譜法。
7.權利要求6所述的方法，采用硅膠減壓柱層析色譜法。
8.權利要求1或2所述的方法，反相色譜法采用經化學修飾的硅膠做填料。
9.權利要求8所述的方法，采用Rp-8或Rp-18做填料。
10.權利要求1或2所述的方法，其中在反相色譜層析前，先通過吸附劑活性炭或硅酸鎂脫色處理。
全文摘要
本發明涉及一種從微生物發酵產物中制備默諾霉素的方法。該方法首先對發酵產物進行前處理，過濾發酵液，收集菌絲體，用極性溶劑從菌絲體中提取抗生素，然后對粗提物應用不同的層析色譜法，去除雜質，脫色，分離和純化默諾霉素。該方法溶劑用量小且易于回收，分離過程簡單，提取得率高，產品純度達到99％以上。由本發明所述方法制備的產品可作為質量標準物質，控制同類產品的質量，也可用作藥物默諾霉素鉍鹽的原料藥。
文檔編號C12P19/00GK1683549SQ20051005138
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月9日 優先權日2005年3月9日
發明者鄭應華, 李文欣, 張國棟, 齊鵬, 肖進, 楊秀玉, 趙暉 申請人:中牧實業股份有限公司