專利名稱：脂聯素－胰升糖素樣肽－1類似肽融合蛋白表達載體及構建的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物領域，尤其涉及脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白表達載體及構建方法。
背景技術：
2型糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是嚴重危害人類健康的疾病，患病人數正隨著生活水平的提高、人口老齡化，以及診斷技術的進步而迅速增加。近年的研究表明胰島素抵抗和胰島素分泌不足是2型糖尿病特征性的病理生理改變，二者相互作用，最終導致2型糖尿病的發生。不僅如此，胰島素抵抗還參與了糖尿病慢性并發癥如心血管并發癥、糖尿病腎病等的發生、發展，是聯系糖尿病、高血壓、高脂血癥、冠心病的一個重要樞紐。因此針對2型糖尿病的發病機制，采用有效的藥物減輕胰島素抵抗、增加胰島素分泌對于2型糖尿病及其并發癥的治療具有重要的意義。在目前尚無有效的藥物能同時針對2型糖尿病發病機制的兩個方面既胰島素抵抗和胰島素分泌不足進行治療。盡管已經有胰島素增敏劑如噻唑烷二酮類藥物和許多種類的口服降糖藥物在臨床上應用，但這些藥物主要是針對2型糖尿病發病機制的某一方面(單純針對胰島素抵抗或胰島素分泌不足或作用于糖吸收或代謝的某一環節)進行治療，而且它們分別改善胰島素抵抗、促進胰島素分泌、降低血糖的能力并不盡如人意，長期應用作用會逐漸降低，同時這些藥物所具有的副作用，也極大地限制了它們在臨床上的應用。即使是胰島素，也因為胰島素抵抗的存在降糖作用大大降低，大劑量應用胰島素還可能加重糖尿病慢性并發癥的發展。鑒于此，國際上正在積極地尋找新的改善胰島素抵抗、促進胰島素分泌的藥物，以期能更有效、安全地治療2型糖尿病。
脂聯素(Adiponectin)是近年發現的脂肪細胞分泌的特異性蛋白，其分泌異常在胰島素抵抗和2型糖尿病的發生、發展中起著重要作用，血清脂聯素濃度可以預測個體將來發生的胰島素抵抗的風險。2型糖尿病患者血漿脂聯素水平明顯下降，前瞻性縱向研究表明，基礎血漿脂聯素濃度是2型糖尿病發病的獨立危險因子，高濃度的血漿脂聯素提示有較小的2型糖尿病發病風險，在以后要發展為2型糖尿病的個體，其血漿脂聯素濃度顯著低于對照組，2型糖尿病發病后仍持續下降，并與胰島素的敏感性下降相平行。脂聯素基因可能是2型糖尿病的易感基因，脂聯素基因缺乏的純合子小鼠(Adipo-/-小鼠)表現出中度的胰島素抵抗和糖耐量異常。這些研究表明脂聯素產生的異常參與了胰島素抵抗和2型糖尿病的發生、發展，而用重組脂聯素對糖尿病和胰島素抵抗動物治療后可顯著改善胰島素抵抗，降低血糖。脂聯素不刺激胰島素分泌，但增強胰島素對肝細胞葡萄糖生成的抑制，使亞生理濃度的胰島素同樣能抑制肝糖輸出。脂聯素還可降低高脂高蔗糖喂養的小鼠循環游離脂肪酸和甘油三酯水平，減輕小鼠體重，增加骨骼肌細胞對游離脂肪酸的攝取、氧化和能量消耗，使骨骼肌甘油三酯含量降低，從而增強骨骼肌細胞胰島素信號傳導，增加胰島素敏感性。脂聯素除了可改善胰島素抵抗，參與調節糖、脂代謝外，還拮抗動脈粥樣硬化的形成。低水平的血漿脂聯素是糖尿病患者發生心血管疾病的獨立危險因子。此外，伴糖尿病性視網膜病變的2型糖尿病患者的血漿脂聯素濃度顯著低于不伴視網膜病變的2型糖尿病患者，提示脂聯素產生的減少也可能參與了糖尿病微血管病變的發生、發展。
總之，脂聯素具有降糖、降脂，增加胰島素敏感性的作用，同時可拮抗動脈粥樣硬化的形成，不會使體重增加，在人體內未發現脂聯素抵抗的存在，而且脂聯素是機體自身產生的蛋白，對人體幾乎沒有副作用，因此脂聯素有可能成為治療糖尿病的一類新藥，國際上正在積極地對其進行研究和開發。人脂聯素共244個氨基酸，從N-端到C-端依次為信號序列(1-18aa)，非螺旋區(19-41aa)，22個膠原重復序列(42-107aa)，C-端球狀域(即脂聯素球狀域，108-244aa)，脂聯素球狀域為其功能域。有研究者用胰蛋白酶裂解全長的脂聯素得到含脂聯素球狀域的片斷，其活性遠大于全長的脂聯素。研究表明，細菌表達的脂聯素球狀域具有很好的生物活性，這為進一步研究和開發脂聯素提供了有利的條件。
胰升糖素樣肽-1(Glucagons-like Peptide-1，GLP-1)是胰島α細胞和腸粘膜L細胞分泌的一種激素，胰島α細胞和腸粘膜L細胞先產生胰升糖素原，進一步經過水解成為具有生物活性的GLP-1(7-37)，其中一部分分子C-端的一個氨基酸被分解，余端被酰胺化為具有生物活性的GLP-1(7-36)酰胺。在體內80％的GLP-1以GLP-1(7-36)酰胺的形式存在，少量以GLP-1(7-37)的形式存在，但兩者的生理活性相同。GLP-1的活性域位于N-端，可與胰島β細胞上的GLP-1受體結合，增加胰島細胞內腺甘酸環化酶的活性，促進胰島素的釋放，其作用是依賴葡萄糖的，在血糖升高時，靜脈輸注GLP-1能明顯增加胰島素分泌，隨著血糖水平的下降，葡萄糖刺激的消失，GLP-1促進胰島素分泌的作用變小，繼續輸注GLP-1血糖不會繼續下降。在2型糖尿病患者，飲食誘導的GLP-1分泌受損，引起胰島β細胞分泌胰島素的惡化，從而導致2型糖尿病的發生。GLP-1還具有增加肝糖原及肌糖原的合成，促進脂肪酸合成，抑制胰升糖素的分泌，抑制胃腸動力，延緩食物的吸收，抑制胰島細胞凋亡，促進胰島細胞增生，抑制食欲，減輕體重，延緩糖尿病的發生等作用。
由于GLP-1具有多種藥理作用，正在試用于2型糖尿病的治療。研究表明輸入外源性GLP-1能明顯改善2型糖尿病患者空腹及餐后血糖，從而減少胰島素的用量，甚至停用胰島素，而且不會發生低血糖，長期輸注GLP-1可顯著增加2型糖尿病患者胰島素的1相分泌。GLP-1還可降低甘油三酯水平，增大低密度脂蛋白顆粒體積，改善2型糖尿病伴冠心病患者的內皮功能紊亂，延緩2型糖尿病心血管并發癥的發生、發展。盡管GLP-1在治療2型糖尿病方面具有很多優點，但尚存在難以克服的缺點，GLP-1的體內半衰期很短，靜脈輸注的半衰期約為5分鐘，從而使得GLP-1難以在臨床上應用，因此，積極尋找有效的方法延長GLP-1的半衰期具有非常重要的意義。在體內GLP-1主要以兩種形式進行清除酶清除與器官清除。GLP-1在二肽肽酶IV的作用下失去N-端的兩個氨基酸殘基成為無活性的GLP-1(9～36)酰胺。由于二肽肽酶IV具有高度的底物特異性，改變GLP-1的N-端氨基酸組成可增加GLP-1對二肽肽酶IV的抵抗力。Deacon等以甘氨酸代替GLP-1(7～37)第8位氨基酸丙氨酸后獲得的GLP-1類似肽(Glucagons-like Peptide-1 Analogues，GLP-1-A)，對二肽肽酶IV的抵抗力顯著增加，其體外半衰期延長到159分鐘，而且和GLP-1(7～37)具有相近的生物活性。但僅有二肽肽酶IV的參與不能解釋GLP-1在體內的所有清除機制，GLP-1在體外血漿中的半衰期為20分鐘，遠遠超過許多研究所得出3～11分的體內半衰期。Deacon等以甘氨酸代替GLP-1(7～37)第8位氨基酸丙氨酸后獲得的GLP-1-A的體外半衰期顯著延長，但體內半衰期并沒有得到相應的改善，提示尚有別的機制參與了GLP-1的體內清除。腎臟在這一過程中起著重要的作用，GLP-1是小分子肽，易從腎臟濾過，在腎小管上皮細胞刷狀緣有DPP-IV，GLP-1被腎臟濾過后，可被腎小管上皮細胞攝取而分解。大鼠腎臟切除后GLP-1的清除率下降，離體研究表明，腎臟一次可將灌注液中超過80％的GLP-1濾過而清除。因此，尋找有效的方法延緩GLP-1從腎臟的清除對于延長GLP-1的體內半衰期具有重要的意義。
在自然界中，許多多結構域(或多功能域)的蛋白質是由數個多肽鏈片段拼接在一起形成的，由相對較小的結構域拼裝成較大的多功能蛋白是自然進化的一個重要因素。基因重組技術的發展使得人類能把不同基因或基因片段相融合，通過蛋白表達得到不同功能的蛋白拼接在一起形成的新型多結構域的人工融合蛋白，目前這種方法已被應用于許多領域的研究中，并顯示出較高的價值。在蛋白融合的過程中，為了最大限度地保持融合蛋白上各個蛋白的空間構象及生物活性，常把不同的蛋白通過空間活動性較大的接頭相連，結構簡單、不易形成折疊的富含甘氨酸的短肽常用來作為接頭。由于脂聯素的功能域位于C-端，GLP-1的功能域位于N-端，從而可應用基因重組技術將脂聯素的N-端和GLP-1的C-端通過一個空間活動性較大的接頭相連，產生一種新的蛋白，該蛋白同時具有脂聯素的C-端和GLP-1的N-端，故可具有脂聯素和GLP-1的兩種功能，新的蛋白由于分子體積增大，不易從腎臟濾過而清除，可克服單一的GLP-1多肽易從腎臟清除、半衰期短的缺點，同時如將GLP-1的第8位氨基酸丙氨酸以甘氨酸代替，則新蛋白的N-端還具有抵抗二肽肽酶IV的能力，可同時消除GLP-1在體內易被清除的兩種因素，顯著延長GLP-1的體內半衰期。由于脂聯素球狀域的活性大于全長的脂聯素，而且細菌表達的脂聯素球狀域具有活性，在該融合蛋白中如進一步以脂聯素球狀域代替全長的脂聯素，則可使該融合蛋白中的脂聯素具有更大的活性。
本發明在國內、外首次運用基因重組技術，構建含人脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因(Adiponectin-GLP-1-A融合基因)的原核表達載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A(該載體即為脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白表達載體)，其中脂聯素編碼基因通過擴增脂聯素球狀域編碼基因而獲得，GLP-1-A編碼基因通過將GLP-1(7-37)編碼基因第8位氨基酸丙氨酸密碼子突變為甘氨酸密碼子而獲得，Adiponectin-GLP-1-A融合基因通過接頭序列將脂聯素編碼基因和GLP-1-A編碼基因連接而成，該接頭序列編碼產物為富含甘氨酸的短肽。本發明為進一步用原核表達載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A轉化蛋白表達細菌，經蛋白純化獲得人脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白(Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白)，研究Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的活性，測定融合蛋白上GLP-1-A的半衰期，獲得能促進胰島β細胞分泌胰島素，又能改善胰島素抵抗，可顯著糾正2型糖尿病體內代謝紊亂，副作用小的新蛋白，建立表達具有生物活性的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的方法，提供前期研究。本研究進一步所獲得的新蛋白將有可能取代相當部分的口服降糖藥物，且降糖作用會更好、更安全、更符合人體的生理需要，具有極大的社會意義和經濟意義。
發明內容
本發明的目的之一是提供人Adiponectin-GLP-1-A融合基因的cDNA序列，全長共567個bp，1-15bp編碼腸激酶識別序列，16-108bp編碼人GLP-1-A，序列長93bp(其中19-21bp將人GLP-1(7-37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子GCT突變為甘氨酸密碼子GGT)，109-153bp編碼接頭肽DNA序列，序列長45bp，154-564bp編碼脂聯素，序列長411bp，565-567bp為終止密碼子，該融合基因cDNA序列見SEQ ID NO 1。
本發明的目的之二是提供人Adiponectin-GLP-1-A融合基因的構建方法，通過以下步驟實現脂聯素編碼基因通過擴增脂聯素球狀域編碼基因而獲得，通過將人GLP-1(7-37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子GCT突變為甘氨酸密碼子GGT獲得人GLP-1-A基因，在設計人GLP-1-A基因引物時，在人GLP-1-A的上游引物P1上分別設計添加編碼一個限制性酶切位點的核苷酸序列、腸激酶識別序列的核苷酸序列及人GLP-1-A基因的互補序列，下游引物P2分別設計添加人GLP-1-A基因互補序列、接頭肽編碼序列及編碼一個限制性酶切位點的核苷酸序列；設計脂聯素基因引物時，在上游引物P3上分別設計添加接頭肽編碼序列、編碼一個限制性酶切位點的核苷酸序列及脂聯素球狀域基因的互補序列，其中P2與P3的限制性酶切位點相同，下游引物P4分別設計脂聯素球狀域基因的互補序列及編碼一個限制性酶切位點的核苷酸序列。通過PCR分別擴增兩個基因，運用酶切技術，依次將GLP-1-A和脂聯素基因重組到原核表達載體中，利用限制性酶切位點將兩個基因融合獲得人Adiponectin-GLP-1-A融合基因，在該融合基因中，GLP-1-A的編碼基因與脂聯素編碼基因通過編碼一柔性接頭肽的核苷酸序列相連接。GLP-1-A編碼基因引物P1、P2序列見SEQ.ID NO2，SEQ.ID NO3，脂聯素編碼基因引物P3、P4序列見SEQ.ID NO4，SEQ.ID NO5；脂聯素編碼基因序列見SEQ.ID NO6，GLP-1-A編碼基因序列見SEQ.ID NO7，柔性接頭肽的核苷酸序列見SEQ.IDNO8。
本發明的目的之三是提供含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的表達載體(該載體即為脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白表達載體)。
本發明的目的之四是提供含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的表達載體的構建方法，通過以下步驟實現(1)提取人脂肪組織總RNA，RT-PCR獲取脂聯素編碼基因，序列見SEQ.ID NO6。
(2)提取人類基因組DNA，PCR獲取GLP-1-A編碼基因，序列見SEQ.IDNO7。
(3)運用酶切技術，依次將GLP-1-A和脂聯素編碼基因重組到原核表達載體PET28a中獲得含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的原核表達載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A(該載體即為脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白表達載體)。
(4)用PET28a-Adiponectin-GLP-1-A轉化蛋白表達細菌，證實此載體能很好地表達含腸激酶識別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，含腸激酶識別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的序列見SEQ.ID NO9。
本發明的優點在于1.在世界上首次將脂聯素和GLP-1-A的編碼基因進行融合構建獲得Adiponectin-GLP-1-A融合基因。
2.在世界上首次運用酶切技術，構建含Adiponectin-GLP-1-A融合基因的原核表達載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A。
3.Adiponectin-GLP-1-A融合基因由一接頭序列連接而成，使得由該融合基因表達的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白中的脂聯素和GLP-1-A通過一接頭肽相連接，有利于最大限度地保持融合蛋白上各個蛋白的空間構象及生物活性。
4.Adiponectin-GLP-1-A融合基因中的脂聯素編碼基因通過擴增脂聯素球狀域編碼基因而獲得，使得由該融合基因表達獲得Adiponectin-GLP-1-A融合中的脂聯素具有更大的生物活性。
5.在Adiponectin-GLP-1-A融合基因中還引入了腸激酶識別序列，使得該融合基因首先表達獲得的是含腸激酶識別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，即在Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的N-端包括一個腸激酶識別序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，可在以后的研究中通過腸激酶作用將其切割去除，使GLP-1-A的N-端游離出來，獲得Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白。
6.本發明通過兩種機制保證將來獲得的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白上的GLP-1-A有長的體內半衰期。一方面Adiponectin-GLP-1-A融合基因中的GLP-1-A基因是將GLP-1(7-37)編碼基因第8位氨基酸丙氨酸密碼子突變為甘氨酸密碼子而獲得，該突變可以使其表達產物具有顯著的抵抗二肽肽酶IV降解的能力；另一方面融合蛋白本身分子量增大，不易從腎臟濾過而清除，可克服單一的GLP-1多肽易從腎臟清除、半衰期短的缺點。通過構建融合蛋白的方法延長GLP-1的體內半衰期在世界上屬于首創。
7.用PET28a-Adiponectin-GLP-1-A原核表達載體轉化蛋白表達細菌，發現此載體能很好地表達含腸激酶識別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，此融合蛋白為世界上首次獲得，為進一步經過蛋白純化、腸激酶切割獲得Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，研究Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的活性，測定融合蛋白上GLP-1-A的半衰期提供了良好的前期研究。
8.本發明的后續研究如能獲得成功，獲得具有生物活性的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，將在國內、外首次建立表達具有生物活性的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的方法，獲得既能促進胰島β細胞分泌胰島素，又能改善胰島素抵抗，可顯著糾正2型糖尿病體內代謝紊亂，副作用小的新蛋白，具有極大的經濟意義和社會意義。
圖1 GLP-1-A、脂聯素編碼基因瓊脂糖凝膠電泳。
圖2 PET28a-Adiponectin-GLP-1-A酶切結果瓊脂糖凝膠電泳。
圖3 含腸激酶識別序列的人Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白表達結果12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。
圖4含腸激酶識別序列的人Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白Western Blot分析。
具體實施例方式
以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明范圍。
實施例一1.材料和儀器1.1材料大腸桿菌菌株E.coli DH5α，BL21(DE3)由浙江大學附屬第二醫院腫瘤研究所提供，原核表達質粒PET28a購自德國novagen公司，RNA抽提液(Trizol)購自美國Gibcol BRL公司，焦碳酸二乙酯、Oligo(dT)15、UNIQ-10柱式基因組DNA抽提試劑盒均購自上海生工生物工程公司，M-MLV Reverse Transcriptase、RNasin、dNTPs、Taq DNA polymerase、瓊脂糖、T4DNA連接酶、限制性內切酶NheI、BamHI、HindIII、XbaI均購自美國Promega公司，淋巴細胞提取液購自上海恒信化學試劑有限公司，GeneRulerTMDNA Ladder Mix購自德國Fermentas公司，DNA Marker DL2000、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)購自日本TaKaRa公司，SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳低分子量標準蛋白質購自上海博亞生物技術有限公司，6×His Monoclonal Antibody(抗組氨酸單克隆抗體)購自美國BD Biosciences公司，辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG購自北京中山生物技術有限公司，質粒提取試劑盒購自上海申能博彩生物技術有限公司，Western Blotting LuminolReagent購自美國Santa Cruz公司，聚偏二氟乙烯膜購自美國Bio-Rad公司，QIA quick Gel Extraction kit購自德國QIAGEN公司。
1.2主要儀器高速低溫離心機(Biofuge 28RS)為德國Heraeus公司產品，細菌恒溫搖床(Orbital Shaker)為美國Forma Scientific公司產品，紫外分光光度儀(8453型)購自美國Hewlett Packard公司，GeneAmp PCR system 2400購自美國PerkinElmer公司，垂直電泳儀(Mini Protean 3 cell)和電轉移儀均為美國Bio-Rad公司產品，真空冷凍干燥儀(UVS400A)購自美國Savant Instruments公司，超聲波細胞粉碎機(JY88-2型)購自寧波新芝科器研究所，ABI377DNA測序儀購自美國PIERCE公司。
2.引物的設計根據原核表達載體PET28a和GenBank中公布的人GLP-1(7-37)與脂聯素的基因序列，設計GLP-1-A與脂聯素編碼基因(通過擴增脂聯素球狀域獲得)的引物及插入載體的位置。GLP-1-A編碼基因引物P15’-cgcgctagcgacgatgacgataagcatggtgaagggaccttt-3’，P25’-cgcggatccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagatcctcggcctttcacca-3’；脂聯素編碼基因引物P35’-cccggatccgcctatgtataccgctca-3’，P45’-cccaagctttcagttggtgtcatggta-3。P1將GLP-1(7-37)編碼基因第8位氨基酸丙氨酸密碼子GCT突變為甘氨酸密碼子GGT(加粗斜體表示)，還包括N端腸激酶識別序列(下劃線表示，PET28a表達的蛋白N端含有組氨酸標簽，所以引物上設計了腸激酶識別序列，用來去除融合蛋白N端的組氨酸標簽)、NheI酶切位點(GCTAGC，加粗表示)，P2，P3含接頭序列(斜體表示)及BamHI酶切位點(GGATCC，加粗表示)，P4含HindIII酶切位點(AAGCTT，加粗表示)。接頭序列為45個堿基的核苷酸序列5’-tctggttctggttctggttctggttctggttctggttctggatcc-3’，連接GLP-1-A與脂聯素兩個基因，編碼15個氨基酸，序列為N-(絲氨酸-甘氨酸)7-絲氨酸-C。引物由上海生工生物工程公司合成。GLP-1-A編碼基因引物序列見SEQ.ID NO2，SEQ.ID NO3，脂聯素編碼基因引物序列見SEQ.ID NO4，SEQ.ID NO5，編碼柔性接頭肽的核苷酸序列見SEQ.ID NO8。
3.脂聯素編碼基因的RT-PCR擴增3.1脂肪組織總RNA的抽提取-80℃保存的人脂肪組織約100mg，在液氮中研成粉末，參考Trizol試劑說明書抽提脂肪組織的總RNA，用紫外分光光度儀測定分析RNA純度，所有RNAA260/A280比值在1.80以上。
3.2逆轉錄以mRNA為模板，Oligo(dT)15為引物，經逆轉錄合成cDNA，反應條件為取2μg總RNA，1.0μl 10pmol/μl ligo(dT)15，加0.1％DEPC水9μl，總體積10μl，混勻，65℃，變性10min，立即置于冰上，冷卻后加入4μl 5×M-MLV Buffer，1μl 25mM dNTPs，0.5μl RNasin，0.5μl M-MLV Reverse Transcriptase，加0.1％DEPC水至20μl，37℃反應1h，所得cDNA用于PCR擴增。
3.3擴增反應體系10×PCR Buffer 5μl，25mM MgCl23μl，10mM dNTPs 1μl，10μM P31μl，10μM P41μl，cDNA 2μl，Taq DNA polymerase(5u/μl)0.5μl，ddH2O 36.5μl，總體積50μl。PCR擴增條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火1min，68℃延伸2min，40個循環后68℃延伸7min。擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定(電壓80V，電泳30min)。用QIA quick GelExtraction kit回收目的基因。擴增結果見圖1，其中1.DNA mark；2.GLP-1-A；3.脂聯素，脂聯素編碼基因序列見SEQ.ID NO6。
4.GLP-1-A編碼基因的PCR擴增
4.1人類基因組DNA的提取取人外周靜脈5ml抗凝血，分離人外周血有核細胞，用UNIQ-10柱式基因組抽提試劑盒提取人類基因組DNA。
4.2 PCR擴增反應體系為10×PCR Buffer 5μl，25mM MgCl23μl，10mM dNTPs 1μl，10μM P11μl，10μM P21μl，cDNA 2μl，Taq DNA polymerase(5u/μl)0.5μl，ddH2O 36.5μl，反應總體積50μl。PCR擴增條件為94℃預變性5min，94℃變性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40個循環后72℃延伸5min。擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳鑒定(電壓80V，電泳30min)。用QIA quickGel Extraction kit回收目的基因。擴增結果見圖1，GLP-1-A編碼基因序列見SEQ.ID NO7。
5.Adiponectin-GLP-1-A融合基因及含該融合基因的原核表達載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A的構建5.1 PET28a-GLP-1-A重組質粒的構建①酶切與連接分別將割膠回收的GLP-1-A編碼基因及PET28a質粒用NheI和BamHI在37℃的條件下進行酶切反應，酶切體系為ddH2O 10μl，10×buffer MC 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，GLP-1-A編碼基因或PET28a質粒6.5μl，NheI 0.5μl，BamHI 0.5μl，反應總體積20μl，反應3h。然后將酶切產物分別進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V，電泳30min)后，用QIA quick Gel Extraction kit割膠回收酶切后的目的片段，將回收產物用T4 DNA連接酶4℃連接過夜，連接體系為ddH2O 4.5μl，10×buffer 1μl，PET28a酶切回收產物3μl，GLP-1-A編碼基因酶切回收產物1μl，T4 DNA連接酶0.5μl，總體積10μl。次日將連接產物轉化感受態細菌DH5α，以擴增連接質粒。
②鑒定挑取幾個平板上已經長出的單菌落，分別在含7ml LB液體培養基(含卡那霉素80μg/ml)的擴增管中37℃，300rpm振搖過夜，用質粒提取試劑盒提取質粒，用XbaI和BamHI在37℃的條件下雙酶切質粒，酶切體系為ddH2O 10μl，10×buffer MC 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，連接質粒6.5μl，XbaI 0.5μl，BamHI 0.5μl，總體積20μl，反應3h，酶切產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V，電泳30min)后，觀察酶切結果，留取陽性克隆的菌液和質粒，獲得PET28a-GLP-1-A重組質粒。
5.2 Adiponectin-GLP-1-A融合基因及含該融合基因的原核表達載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A的構建①酶切與連接分別將構建好的PET28a-GLP-1-A質粒及割膠回收的脂聯素目的基因用BamHI、HindIII在37℃的條件下進行酶切反應，酶切體系為ddH2O 10μl，10×buffer E 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，PET28a-GLP-1-A或脂聯素目的基因6.5μl，BamHI 0.5μl，HindIII 0.5μl，總體積20μl，反應3h。然后將酶切產物分別進行1.5％瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V，電泳30min)，割膠回收酶切后目的片段，回收產物用T4 DNA連接酶4℃連接過夜，連接體系為ddH2O 14.5μl，10×buffer 2μl，PET28a-GLP-1-A酶切回收產物2μl，脂聯素目的基因酶切回收產物1μl，T4 DNA連接酶0.5μl，總體積20μl。次日將連接產物轉化感受態細菌DH5α，以擴增連接質粒。
②鑒定挑取幾個平板上已經長出的單菌落，在7ml LB液體培養基(含卡那霉素80μg/ml)的擴增管中37℃，300rpm振搖過夜，用質粒提取試劑盒提取質粒，分別用BamHI、HindIII(酶切體系為ddH2O 10μl，10×buffer E 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，連接質粒6.5μl，BamHI 0.5μl，HindIII 0.5μl，總體積20μl，37℃反應3h)及XbaI、HindIII(酶切體系為ddH2O 10μl，10×bufferB 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，連接質粒6.5μl，XbaI 0.5μl，HindIII 0.5μl，總體積20μl，37℃反應3h)雙酶切質粒，酶切產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V，電泳30min)后，出現426bp及683bp的小片斷，酶切產物符合預期值，說明Adiponectin-GLP-1-A融合基因已成功插入PET28a的預期酶切位點，獲得了Adiponectin-GLP-1-A融合基因及含該融合基因的原核表達載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A(該載體即為脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白表達載體)。見圖2，其中M.DNAmarker；1.PET28a-Adiponectin-GLP-1-A未酶切；2.BamHI/HindIII酶切結果；3.XbaI/HindIII酶切結果。經PET通用引物通過ABI377DNA測序儀對PET28a-Adiponectin-GLP-1-A進行測序鑒定，表明各基因的插入方向及順序完全正確，所測序列和預期完全一致。Adiponectin-GLP-1-A融合基因序列見SEQ.ID NO1，全長共567個bp，1-15bp編碼腸激酶識別序列，16-108bp編碼人GLP-1-A，序列長93bp，109-153bp編碼接頭肽DNA序列，序列長45bp，154-564bp編碼脂聯素，序列長411bp，565-567bp為終止密碼子，見SEQ.ID NO1。
6.原核表達載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A表達含腸激酶識別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白的初步研究取測序正確的PET28a-Adiponectin-GLP-1-A轉化感受態表達細菌BL21(DE3)，次日挑取單菌落于7ml LB液體培養基(含卡那霉素80μg/ml)中，37℃振搖過夜，吸取70μl到7ml LB液體培養基(含卡那霉素80μg/ml)中，37℃振搖2h，使菌液在600nm處吸光度(A600)為0.4～0.6，留取誘導前菌液1ml作為對照，剩下菌液中加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導，37℃分別振搖1～6h，分別收集1～6h各時段細菌，將每管細菌量進行調整，直至A600基本一致，將收集的菌液以5,000rpm離心10min，棄上清，沉淀用PBS洗滌3次后，以適量PBS重懸，將菌液取10μl加等量的2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃煮沸5min，13,000rpm，離心1min后上樣，行12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后確定目的蛋白是否表達及表達量最大時間段。結果顯示，與誘導前的菌液相比，IPTG誘導后在25KD處有較濃的蛋白條帶，與預期的融合蛋白大小一致，且IPTG誘導5～6h的蛋白條帶最濃，較誘導前均明顯增多。取誘導后5h菌液1ml冰浴上超聲破碎細菌，分別留上清及沉淀，將沉淀用與上清等體積的PBS混勻，分別取10μl，加等量的2×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃煮沸5min，13,000rpm，離心1min后上樣，用12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析目的蛋白在上清和沉淀中的表達情況，結果發現，在25KD處有較濃的蛋白條帶，以沉淀的電泳條帶為濃，與預期的融合蛋白大小一致。見圖3，其中M蛋白marker，1.IPTG誘導后5h沉淀蛋白，2.IPTG誘導后5h上清蛋白，3.IPTG誘導前菌液，4-9.IPTG誘導后1h～6h總蛋白；用抗組氨酸單克隆抗體對產物行Western Blot分析顯示上清及沉淀中均有特異性的蛋白表達。見4，其中1.IPTG誘導后5h沉淀蛋白，2.IPTG誘導后5h上清蛋白。由PET28a-Adiponectin-GLP-1-A原核表達載體表達首先獲得的是含腸激酶識別序列的人Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白，共188個氨基酸，包括1-5aa編碼腸激酶識別序列，6-36aa編碼GLP-1-A(其中第7位氨基酸為突變的氨基酸甘氨酸)，37-51aa編碼連接肽，52-188aa編碼脂聯素。序列見SEQ.IDNO9。可在以后的研究中進一步用腸激酶對該融合蛋白進行切割獲得Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白。
本發明涉及的序列SEQ.ID NO1(Adiponectin-GLP-1-A融合基因cDNA序列)SEQ.ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度567個堿基(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲線性(ii)分子型cDNA(iii)序列描述
5’-gacgatgacgataagcatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctggtgaaaggccgaggatctggttctggttctggttctggttctggttctggttctggatccgcctatgtataccgctcagcattcagtgtgggattggagacttacgttactatccccaacatgcccattcgctttaccaagatcttctacaatcagcaaaaccactatgatggctccactggtaaattccactgcaacattcctgggctgtactactttgcctaccacatcacagtctatatgaaggatgtgaaggtcagcctcttcaagaaggacaaggctatgctcttcacctatgatcagtaccaggaaaataatgtggaccaggcctccggctctgtgctcctgcatctggaggtgggcgaccaagtctggctccaggtgtatggggaaggagagcgtaatggactctatgctgataatgacaatgactccaccttcacaggctttcttctctaccatgacaccaactga-3’SEQ.ID NO2(GLP-1-A編碼基因引物P1序列)SEQ.ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度42個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子型DNA(iii)序列描述5’-cgcgctagcgacgatgacgataagcatggtgaagggaccttt-3’SEQ.ID NO3(GLP-1-A編碼基因引物P2序列)SEQ.ID NO3的信息(i)序列特征(A)長度65個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子型DNA(iii)序列描述5’-cgcggatccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagaaccagatcctcggcctttcacca-3’SEQ.ID NO4(脂聯素編碼基因引物P3序列)
SEQ.ID NO4的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子型DNA(iii)序列描述5’-cccggatccgcctatgtataccgctca-3’SEQ.ID NO5(脂聯素編碼基因引物P4序列)SEQ.ID NO5的信息(i)序列特征(A)長度27個堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲線性(ii)分子型DNA(iii)序列描述5’-cccaagctttcagttggtgtcatggta-3SEQ.ID NO6(脂聯素編碼基因序列)SEQ.ID NO6的信息(i)序列特征(A)長度426個堿基(B)類型核酸(C)鏈性雙鏈(D)拓撲線性(ii)分子型cDNA(iii)序列描述5’端引入BamH I酶切位點(6bp，方框表示)，3’端引入HindIII酶切位點(6bp，方框表示)。
5’-ggatccgcctatgtataccgctcagcattcagtgtgggattggagacttacgttactatccccaacatgcccattcgctttaccaagatcttctacaatcagcaaaaccactatgatggctccactggta
aattccactgcaacattcctgggctgtactactttgcctaccacatcacagtctatatgaaggatgtgaaggtcagcctcttcaagaaggacaaggctatgctcttcacctatgatcagtaccaggaaaataatgtggaccaggcctccggctctgtgctcctgcatctggaggtgggcgaccaagtctggctccaggtgtatggggaaggagagcgtaatggactctatgctgataatgacaatgactccaccttcacaggctttcttctctaccatgacaccaactga -3’SEQ.ID NO7(GLP-1-A編碼基因序列)SEQ.ID NO7的信息(i)序列特征(E)長度159個堿基(F)類型核酸(G)鏈性雙鏈(H)拓撲線性(ii)分子型cDNA(iii)序列描述5’端引入Nhe I酶切位點(6bp，方框表示)、腸激酶識別序列(15bp，加粗表示)，3’端引入接頭序列(45bp，加粗表示)，BamH I酶切位點(6bp，方框表示，位于接頭序列內)，總長度159bp，其中25-27bp將人GLP-1(7-37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子GCT突變為甘氨酸密碼子GGT(加粗斜體表示)。
5’- gacgatgacgataagcatggtgaagggacctttaccagtgatgtaagttcttatttggaaggccaagctgccaaggaattcattgcttggctggtgaaaggccgaggatctggttctggttctggttctggttctggttctggttct -3’SEQ.ID NO8(Adiponectin-GLP-1-A融合基因柔性接頭核苷酸序列)SEQ.ID NO8的信息(i)序列特征(I)長度45個堿基(J)類型核酸(K)鏈性雙鏈(L)拓撲線性(ii)分子型DNA(iii)序列描述5’-tctggttctggttctggttctggttctggttctggttctggatcc-3’
SEQ.ID NO9(含腸激酶識別序列的Adiponectin-GLP-1-A融合蛋白序列)SEQ.ID NO9的信息(i)序列特征(A)長度188個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(ii)分子型多肽(iii)序列描述Asp Asp Asp Asp Lys His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr LeuGlu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Ser Gly SerGly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Ala Tyr Val Tyr Arg Ser Ala PheSer Val Gly Leu Glu Thr Tyr Val Thr Ile Pro Asn Met Pro Ile Arg Phe Thr Lys IlePhe Tyr Asn Gln Gln Asn His Tyr Asp Gly Ser Thr Gly Lys Phe His Cys Asn IlePro Gly Leu Tyr Tyr Phe Ala Tyr His Ile Thr Val Tyr Met Lys Asp Val Lys Val SerLeu Phe Lys Lys Asp Lys Ala Met Leu Phe Thr Tyr Asp Gln Tyr Gln Glu Asn AsnVal Asp Gln Ala Ser Gly Ser Val Leu Leu His Leu Glu Val Gly Asp Gln Val TrpLeu Gln Val Tyr Gly Glu Gly Glu Arg Asn Gly Leu Tyr Ala Asp Asn Asp Asn AspSer Thr Phe Thr Gly Phe Leu Leu Tyr His Asp Thr Asn
權利要求
1.人脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因的cDNA序列，其特征是全長共567個bp，1-15bp編碼腸激酶識別序列，16-108bp編碼人GLP-1-A，序列長93bp，其中19-21bp將人GLP-1(7-37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子GCT突變為甘氨酸密碼子GGT，109-153bp編碼接頭肽DNA序列，序列長45bp，154-564bp編碼脂聯素，序列長411bp，565-567bp為終止密碼子，該融合基因cDNA序列見SEQ ID NO 1。
2.人脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因構建方法，其特征是通過以下步驟實現脂聯素編碼基因通過擴增脂聯素球狀域編碼基因而獲得，通過將人GLP-1(7-37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子GCT突變為甘氨酸密碼子GGT獲得人GLP-1-A基因，在設計人GLP-1-A基因引物時，在人GLP-1-A的上游引物P1上分別設計添加編碼一個限制性酶切位點的核苷酸序列、腸激酶識別序列的核苷酸序列及人GLP-1-A基因的互補序列，下游引物P2分別設計添加人GLP-1-A基因互補序列、接頭肽編碼序列及編碼一個限制性酶切位點的核苷酸序列；設計脂聯素基因引物時，在上游引物P3上分別設計添加接頭肽編碼序列、編碼一個限制性酶切位點的核苷酸序列及脂聯素球狀域基因的互補序列，其中P2與P3的限制性酶切位點相同，下游引物P4分別設計脂聯素球狀域基因的互補序列及編碼一個限制性酶切位點的核苷酸序列，通過PCR分別擴增兩個基因，運用酶切技術，依次將GLP-1-A和脂聯素基因重組到原核表達載體中，利用限制性酶切位點將兩個基因融合獲得人脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因，在該融合基因中，GLP-1-A的編碼基因與脂聯素編碼基因通過編碼一柔性接頭肽的核苷酸序列相連接。
3.根據權利要求2所述的人脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因構建方法，其特征是GLP-1-A編碼基因引物P1、P2序列為SEQ.ID NO 2，SEQ.IDNO 3，脂聯素編碼基因引物P3、P4序列為SEQ.ID NO 4，SEQ.ID NO 5，脂聯素編碼基因序列為SEQ.ID NO 6，GLP-1-A編碼基因序列為SEQ.ID NO 7，柔性接頭肽的核苷酸序列為SEQ.ID NO 8。
4.根據權利要求1所述的脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合融合基因，其特征是含人脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因的表達載體。
5.根據權利要求4所述的含人脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因的表達載體的構建方法，其特征是通過以下步驟實現(1)提取人脂肪組織總RNA，RT-PCR獲取脂聯素編碼基因，序列見SEQ.ID NO 6；(2)提取人類基因組DNA，PCR獲取GLP-1-A編碼基因，序列見SEQ.IDNO 7；(3)運用酶切技術，依次將GLP-1-A和脂聯素編碼基因重組到原核表達載體PET28a中獲得含脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合基因的原核表達載體PET28a-Adiponectin-GLP-1-A。(4)用PET28a-Adiponectin-GLP-1-A轉化蛋白表達細菌，證實此載體能很好地表達含腸激酶識別序列的脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白，含腸激酶識別序列的脂聯素-胰升糖素樣肽-1類似肽融合蛋白的序列見SEQ.ID NO 9。
全文摘要
本發明公開了人脂聯素－胰升糖素樣肽－1類似肽融合蛋白表達載體及構建方法。本發明運用PCR技術獲得人脂聯素和GLP－1－A編碼基因，脂聯素基因通過擴增脂聯素球狀域基因獲得，通過將人GLP－1(7－37)編碼基因中編碼第8位氨基酸丙氨酸的密碼子突變為甘氨酸密碼子獲得GLP－1－A編碼基因，運用酶切技術，將GLP－1－A和脂聯素編碼基因定向克隆到表達載體，獲得人脂聯素－胰升糖素樣肽－1類似肽融合蛋白表達載體，經轉化蛋白表達細菌表達出了含腸激酶識別序列的人Adiponectin－GLP－1－A融合蛋白，本發明為進一步研究其活性，測定融合蛋白上GLP－1－A半衰期，得到能促進胰島β細胞分泌胰島素、能改善胰島素抵抗、副作用小的新蛋白提供良好的前期研究。
文檔編號C12N15/70GK1737150SQ20051005084
公開日2006年2月22日 申請日期2005年7月22日 優先權日2005年7月22日
發明者趙同峰, 谷衛, 詹宇紅, 趙江佩 申請人:浙江大學