檢測血清β2－糖蛋白I及其自身抗體的試劑的制作方法

專利名稱：檢測血清β2－糖蛋白I及其自身抗體的試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種與血清β2-糖蛋白I(β2-GPI)特異性結合的氧化低密度脂蛋白衍生化合物7-酮膽固醇酯(7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate)；以本衍生物為底物用于檢測和分離純化β2-糖蛋白I；用以確定是否存在與β2-糖蛋白有關的疾病，特別是用以確定是否存在動脈硬化和血栓形成發生危險性升高或降低有關的抗體，從而來檢測疾病。
背景技術：
隸屬于系統性紅斑狼瘡癥的抗磷脂綜合癥(antiphospholipid syndrome；APS)是一種臨床上十分難治的一類自身免疫性疾病，其臨床的主要癥狀就是動脈硬化以及動靜脈血栓的形成、習慣性流產和血小板減少等癥狀。血清學特征為大量自身抗體的存在。
其中抗心磷脂抗體由于與血栓形成、血小板減少、系統性紅斑狼瘡、習慣性流產、神經系統疾病、急慢性白血病、消化系統疾病、腎臟疾病等凝血系統改變等密切相關，所以抗心磷脂抗體可作為系統性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的輔助診斷指標及抗磷脂綜合癥診斷依據之一，也可作為臨床上預測血栓形成趨勢的標志。
長年以來，抗心磷脂抗體的測定在梅毒檢測法中呈現梅毒生物學試驗假陽性，其特異性和敏感性很差，1983-1984年間，開發了固相化心磷脂RIA和ELISA測定方法，而且近年來由于使用純凈的心磷脂作為抗原，抗心磷脂抗體的實驗室和臨床研究發展很快。目前抗β2-GPI抗體的檢測方法是以純凈的心磷脂作為抗原檢測抗β2-GPI抗體的IgG、IgM和IgA，但在臨床患者血清自身抗體檢測中，由于敏感性過高，相對特異性較差，更重要的是未能提供特異性的抗磷脂綜合癥發病機理相關的信息，所以，在目前的抗磷脂綜合癥實驗室診斷檢測中，仍然存在著診斷困難，缺乏有效藥物，患者的死亡率高達75％以上。所以尋找能夠提供抗磷脂綜合癥特異性發病原因即動脈硬化和血栓形成發病原因的特異性抗β2-GPI抗體的檢測方法顯得意義十分重大。

發明內容
1、氧化低密度脂蛋白衍生物7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate
在動脈粥樣硬化的發生發展中，眾多的理論研究和實驗結果證實了LDL的氧化扮演了非常重要的角色，為了探索動脈粥樣硬化的發病機理，在體外研究中，幾種主要的LDL的實驗模型是MDA-LDL、acetylated-LDL和Cu2+-LDL，在這些實驗模型中，Cu2+-LDL顯示了作為體外實驗模型的優勢，Cu2+能夠誘導LDL氧化，導致LDL結構的高度破壞，產生了多種oxLDL的氧化產物。Cu2+所導致的LDL的破壞和產生的氧化產物與幾種細胞(如血管內皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞等)誘導的LDL氧化以及從動脈硬化巢中所提取的oxLDL具有非常相似的性質和結果，而且在動脈硬化巢中提取出來的oxLDL展示了與Cu2+-oxLDL相似的物理和免疫學性質。而MDA是一個親水性的短鏈乙醛結構，它很容易從LDL中分離和擴散，在透析之后，oxLDL的TBARS分離物減少到無法檢測的低水平。所以，這已經成為一種共識，即將Cu2+-oxLDL作為一種體內外實驗研究動脈硬化的自身抗原。
β2-GPI是抗磷脂綜合癥抗心磷脂抗體的主要抗原，具有結合如心磷脂(cardiolipin)等陰性磷脂、活化血小板及雕亡細胞膜表面暴露出來的磷脂酰絲氨酸的性質。近年來，通過對β2-GPI的變異蛋白質及體外合成多肽的研究以及結晶構造體的解析，發現β2-GPI的第五個domain上，特別是C281KNKEKKC288領域存在著與脂質結合的部位，更確切地說，結晶構造體表明，在第五個domain上K317與T318的位置如果發生斷裂，β2-GPI與磷脂的結合活性消失。最近，George等報告在對LDL受體缺乏小鼠進行β2-GPI免疫之后，發現β2-GPI促進了小鼠動脈壁脂肪斑的形成。還報告在人動脈硬化巢中含有豐富的β2-GPI，并且是與CD4-陽性淋巴細胞共存。Lin等報告冠心病(CAD)患者血清LDL升高的同時，HDL、apoA-1和β2-GPI顯示了低于正常人的水平。越來越多的證據表明β2-GPI卷入了脂蛋白和脂質的代謝中。這些結果和現象與Ross等提倡的傷害反應學說相加在一起，表明既不僅是各種細胞因子和免疫細胞，而且β2-GPI也顯示了對動脈硬化發生和發展過程中重要的調節作用。
β2-GPI是抗磷脂綜合癥抗心磷脂抗體的主要抗原，大量的實驗研究證實了β2-GPI與系統性紅斑狼瘡以及抗磷脂綜合癥動脈硬化發生血栓形成之間的重要相互關系，其動脈硬化及血栓形成的發病機制是一種相關于β2-GPI的自身免疫性機制。基于β2-GPI與系統性紅斑狼瘡以及抗磷脂綜合癥動脈硬化發生和血栓形成之間的重要相互關系以及結合陰性物質的特點，設想在系統性紅斑狼瘡以及抗磷脂綜合癥患者動靜脈硬化和血栓發病中β2-GPI與動脈硬化危險因子oxLDL之間是否存在某種相關性，這種相關性是否能夠提供更為有價值的特異性的動脈硬化和血栓發生的信息？我們在抗磷脂綜合癥的發病機制研究過程中，首次發現了β2-GPI和抗β2-GPI抗體與Cu2+氧化來源的氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)之間的相互關系，我們的結果還顯示在抗磷脂綜合癥患者血清中存在的抗β2-GPI·oxLDL復合體抗體的出現與即往性動脈血栓癥之間呈現正相關性。而且，這一抗體與抗磷脂綜合癥患者血清中β2-GPI依賴性的抗心磷脂抗體及抗β2-GPI抗體之間也呈現良好的相關性。我們的研究進一步顯示，在血清中，確實存在著β2-GPI和oxLDL的復合體，而且這種復合體是穩定且不可分離的。體外實驗還表明β2-GPI與oxLDL結合的復合物與致病性自身抗體尤其是IgG型血栓高危險性自身抗體特異性結合，經由巨噬細胞吞噬攝取，可能導致了抗磷脂綜合癥動脈硬化及血栓形成。
上述結果和實驗數據均表明正常機體血漿中存在的一種糖蛋白β2-糖蛋白I(β2-GPI)和血中過多的低密度脂蛋白(LDL)在血管壁上的沉積以及由此而引起的LDL的氧化(oxLDL)卷入了抗磷脂綜合癥動脈硬化和血栓形成的自身免疫性發病機制中。既在抗磷脂綜合癥患者循環血流中，抗β2-GPI自身抗體識別oxLDL·β2-GPI復合體，三者形成了免疫復合物，這一三元免疫復合物可能是經由巨噬細胞的Fcγ受體攝取oxLDL的膽固醇脂，形成泡沫細胞，這可能是抗磷脂綜合癥患者動脈硬化及血栓形成的原因。這一研究成果為抗磷脂綜合癥特異性的臨床診斷和治療提供了十分重要的理論依據。上述研究結果提供了一種與β2-GPI特異性結合的oxLDL及其oxLDL活性衍生化合物應用于與動脈硬化和動靜脈血栓發生有關的自身抗體的ELISA(酶聯免疫吸附實驗)測定。
然而β2-GPI與oxLDL的結合是由什么結構位點來介導，仍然不清楚，所以鑒定和分離純化β2-GPI與oxLDL的結合的結構位點，將能夠了解和實行一種更加易行簡便的測定體系，此外，試劑在操作和儲存上更易于運輸，可以提供價廉低成本的質量穩定的測定試劑和測定試劑盒。
本發明的檢測血清β2-糖蛋白I及其自身抗體的試劑，是能與血清β2-糖蛋白I(β2-GPI)特異性結合的氧化低密度脂蛋白衍生化合物，本發明特有的特征在于其中的氧化低密度脂蛋白衍生物是一種結構為7-酮膽固醇酯衍生物，化學結構即是7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate，用于檢測與β2-糖蛋白I及相關的疾病。特別是用于檢測與血清β2-糖蛋白I相關的動脈硬化和血栓形成發生危險性升高或降低有關的抗體。為了提供一種可以與β2-GPI特異性結合的底物，本發明人分離了與β2-GPI特異性結合的來源于oxLDL的一種配體，通過LC-MS及NMR方法確定其化學結構為7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate。研究表明，這一配體介導了oxLDL與β2-GPI的特異性結合，并且結合的活性中心就是配體結構中7-酮膽固醇的第三位所連接的短鏈脂肪酸末端的羧基團。毫無疑問，oxLDL的陰性基團即7-酮膽固醇酯的ω-COOH直接卷入了oxLDL與β2-GPI的特異性結合以及巨噬細胞吞噬攝取oxLDL的過程。本發明人并且以這一β2-GPI特異性配體7-酮膽固醇酯7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate為特異性抗原建立了β2-GPI和其抗體的特異性檢測體系。
因此，含有這些抗原決定基的衍生物意味著可以用于ELISA方法中，這種方法比現有的將oxLDL顆粒作為抗原的ELISA方法更加準確和可靠，建立的ELISA測定體系和方法將能夠更加準確的測定致病抗體。以及針對致病源有效預防和治療動脈硬化。
所以，本發明公開和提供了1、一種氧化低密度脂蛋白活性衍生化合物的分離或化學合成的方法；2、本活性衍生物在檢測β2-GPI的應用方法；3、本活性衍生物在檢測抗β2-GPI-衍生物復合物抗體的應用方法；2、本發明衍生物在ELISA測定體系中的應用1)、固相化載體作為固相化試劑的載體，典型的載體包括一種合成有機高分子化合物。例如載體可以做為各種形狀，主要根據所用方法來確定載體的形狀。
固相化試劑在載體上可以通過傳統的方法固定在載體上。例如物理吸附，離子結合等方法，由于物理吸附法的簡單易行，常常被用來進行固相化試劑的載體固定。
在本發明中，固相化試劑也可以通過傳統的封閉處理方法來獲得，例如BSA或gelatin，可以避免非特異性結合反應。
2)、本發明的固相化
本發明是一種不溶于水的衍生物，可以固定于包括板狀、管狀、珠狀、膜狀和凝膠上。固定材料可以是聚苯乙烯、聚丙烯、尼龍或聚丙烯酰胺，在這些材料中聚苯乙烯為首選物質。固相化的方法通常采用脂類固定方法，如物理吸附法或共價鍵結合法，一般物理吸附法為首選，因為其方法簡便，使用范圍廣泛。
本發明的固相化衍生物通常溶解于乙醇、甲醇、或者甲醇與三氯甲烷的混合物中。溶解物在固相材料上蒸發干燥，吸附于固相材料之上。當固相化表面的衍生物還沒有被固定時，如果β2-GPI或者樣品中所含有的其他分子此時接觸固相化表面，就不能夠得到精確正確的測定結果，所以，為避免這樣的現象出現，通常用封閉物添加于固相化的衍生物上，例如封閉物主要包括血清白蛋白、干酪素(酪蛋白)、脫脂乳、白明膠或者商業用封閉物也可以用來進行封閉。封閉后的固相物儲存在37℃，30min-2h，或者在15-25℃下2h。
3)、樣品在本發明中，對于所測樣品沒有特殊的要求，所測樣品可以是任何生物學的其中含有oxLDL的生物學樣品。所測樣品可以是全血、血清或血漿。所測樣品需要一個前處理，既需要添加β2-GPI已形成能夠測定的β2-GPI-oxLDL復合體，但是當所測樣品為血清時，本身即含有β2-GPI，能夠形成β2-GPI-oxLDL復合體，則前處理可以省略。當然，如果按照本發明的方法，前處理也可以省略。
4)、試劑盒體系本發明的試劑盒是一種β2-GPI的測定試劑盒。
試劑盒1A和BA固相系統B一種與β2-GPI結合的底物試劑盒2A和BA固相系統B一種與抗體結合的底物，這一抗體能夠辨認β2-GPI-衍生物的復合體。
只要每一個試劑盒含有A和B即可。
試劑盒還可以包括(1)對于測定β2-GPI或抗體時制備標準曲線時所用的標準濃度曲線。
(2)一種測定標記底物的試劑，一種測定底物與β2-GPI、或抗體與β2-GPI-衍生物結合的試劑。
除了這些，試劑盒還同時可以包括封閉底物、洗脂物、樣品稀釋劑和酶反應終止劑。
這些試劑盒成分，可以單獨儲存，使用時按照測定方法操作使用即可。
本發明試劑盒的組成和裝配試劑盒11、一個96孔的免疫板(Immuno-plate)，oxLig-1固定于其上。(1sheet)2、β2-GPI標準溶液(1set)3、抗β2-GPI抗體(WB-CAL-I)(1ViaL)4、HRP-labeled anti-mouse IgG antibody(1Vial)5、O-phenyenediamine solution(1Vial)6、Agueous hydrogen peroxide(1Vial)7、Reaction-terminating liquid(1N HCI)(1Vial)試劑盒21、一個96孔的免疫板(Immuno-plate)，oxLig-1固定于其上。(1sheet)2、β2-GPI(1Vial)3、HRP-labeled anti-mouse IgG antibody(1Vial)4、四甲基苯丁(Tetramethylbenzidine)溶液(1Vial)5、Agueous hydrogen peroxide(1Vial)6、Reaction-terminating liquid(1N HCI)(1Vial)


圖1為7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate的結構模式圖；圖2為7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate作為底物進行β2-GPI的測定；圖3為7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate作為底物進行系統性紅斑狼瘡(SLE和抗磷脂綜合癥(APS)患者抗β2-GPI-配體復合物抗體和抗心磷脂抗體的測定比較血清樣品。
實施方案的描述材料和方法1、試劑
L-α-Dipalmitoylphosphatidylserine(DPPS)，7-ketocholesterol(5-cholesten-3β-ol-7-one，7KC)以及cholesteyl linoleate(5-cholesten-3β-3-linoleate)從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)購入。Dioleoylphosphatidyl-choline(DOPC)從Avanti Polar Lipids Inc.(Alabaster，AL)購入。其它試劑均為特級分析試劑。
2、oxLDL衍生物7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate的分離提純采用密度梯度超速離心法(35000rpm/min，4℃，24h)分離低密度脂蛋白LDL(d＝1.019-1.063g/ml)。Cu2+氧化法進行LDL體外氧化，LDL蛋白濃度為100μg/ml，CuSO4濃度為5μM，37℃8小時孵育后EDTA 1mM中止反應。PBS透析24小時。氧化后的oxLDL采用thiobarbituric acid substance(TBARS)反應及瓊脂糖電泳測定oxLDL的氧化程度。oxLDL來源的脂(lipid)點樣于硅膠-薄層層析板(Polygram，Machery-Nagel，Duren，Germany分離配體用)和PLC硅膠-60層析板(PLC silicagel-60 Merck，Darmstadt，Germany分離脂)，層析板分別在三氯甲烷/甲醇/30％氨水/水(120/80/10/5溶液A)以及三氯甲烷/甲醇(8/1溶液B)溶媒中展開，展開后，分離脂的層析板分別進行碘和鉬蘭試劑染色。TLC薄層層析得到的來源于oxLDL粗制β2-GPI配體進一步通過逆相HPLC分析和精制。
β2-GPI配體粗制樣品在C18柱(250×4.6mm Sephasyl peptide，Pharmacia)上經過溶媒C(氰化甲烷/異丙醇30/70，v/v)和溶媒D(0.2％醋酸水溶液)的濃度流動相{(50％溶媒C-50％溶媒D混合液(0分鐘)-100％溶媒C(15-40分鐘)}溶出，流速在0.5ml/min，234nm的吸光度檢測測定。HPLC精制分離后的β2-GPI配體樣品在LC/MS-QP8000α(Shimadzu Corp.，Kyoto，Japan)HPLC系統，APCI法經Shim-pack VP-ODS柱(150×4.6mm)分析。
3、oxLDL衍生物7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate的化學合成7-ketocholesterol(5-cholesten-3β-ol-7-one，50.1mg，0.13mmol)和azelaic acid(70.6mg，0.38mmol)溶于4ml丙酮中，隨后加入1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(WSC；95.8mg，0.50mmol)和4-(dimethylamino)Pyridine(DMAP；30.5mg，0.25mmol)。混合物在室溫下，經過兩天攪拌、離心，用三氯甲烷抽提，抽提物用2M的hydrochloric acid、brine連續洗滌，anhydrous magnesium sulfate(無水酒石酸硫酸鹽)干燥。干燥成分經過silica凝膠柱層析得到合成的β2-GPI配體oxLig-1(36.0％mg，產量為50.4％)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)＝5.71(s，1H，H-6)，4.78-4.69(m，1H，H-3)；13C-NMR(75.5MHz，CDCl3)202.5，179.7，173.4，164.5，127.1，72.4，55.2，50.4，50.2，45.8，43.5，39.9，38.7，36.6，36.1，29.2，28.9，28.4，25.3，25.0，24.2，23.2，23.0，19.3，17.7，12.4.；m/z(FD-MS)571[(M+H)+，C36H59O5](圖1)4、自身免疫性單克隆抗體WB-CAL-1(IgG2a)抗體來源于抗磷脂綜合癥模型(NZW X BXSB)F1小鼠，它是能夠特異性識別β2-糖蛋白I隱藏的(cryptic)抗原決定基的單克隆抗β2-糖蛋白I抗體10)。Cof-23(IgG1)以及Cof-22(IgG1)來源于β2-糖蛋白I免疫后的小鼠，是具有識別β2-糖蛋白I native構造結構的單克隆抗體11)。
5、β2-糖蛋白I的分離與純化β2-糖蛋白I通過Heparin-Sepharose、DEAE-cellulose層析柱以及抗β2-糖蛋白I親和層析柱分離純化12)，最后用protein A-Sepharose層析柱除去IgG，并且通過n-butanol除去結合的脂質成分。
6、β2-GPI的重組表達β2-糖蛋白I是一個已知的糖蛋白質，它的氨基酸和核酸序列已被報告，然而生物活性β2-糖蛋白I在通常的E.coli和酵母表達體系中由于不能夠形成功能二硫鍵，所以不能夠正確表達蛋白，主要原因是天然β2-糖蛋白I分子中有多達11個半胱氨酸(S-S)鍵，并且還具有一個反復折疊所形成的五個結構域結構，此外，β2-糖蛋白I的編碼核苷酸序列的先頭蛋白有一個突變的蛋白附加物，是由19個氨基酸組成的多肽，位于在N-末端，在蛋白分泌時這個多肽應該被切割掉。1993年Igarash利用baculovirus病毒表達體系解決了這一難題，所重組的β2-糖蛋白I與抗磷脂綜合癥患者的抗心磷脂抗體發生了特異性免疫反應，表明利用這一方法獲得的β2-糖蛋白I具有生物學活性。(Clin，Exp.Immunol；93，19，1993)具體實施例實施例1β2-GPI依賴性的抗心磷脂抗體的ELISA測定心磷脂(CL)濃度為50μg/ml，以50μl/well的量加入96孔Immulon 1B(DynexTechnologies Inc.，Chantilly)ELISA培養板中，物理干燥吸附后，1％BSA封閉，隨后依次加入β2-GPI(15μg/ml，50μl/well)和抗β2-GPI抗體(Cof-22和WB-CAL-I)，室溫下共同孵育1小時，最后與辣根過氧化物酶HRP標記的抗人IgG抗體孵育1小時，顯色后490nm的吸光度測定。在上述各步驟之間，酶標板用0.05％Tween 20的PBS充分洗凈。
抗β2-GPI-7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate復合物抗體的ELISA測定化學合成的oxLDL衍生物(Syn-oxLig-1)濃度為50μg/ml，以50μl/well的量加入96孔Immulon 1B(Dynex Technologies Inc.，Chantilly)ELISA培養板中，物理干燥吸附后，隨后的步驟等同于“β2-GPI依賴性的抗心磷脂抗體的ELISA測定”上述實驗結果表明，以β2-GPI-配體7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate為底物的抗β2-GPI-7-ketocholesteryl-9-carboxynonanoate復合物抗體與β2-GPI依賴性的抗心磷脂抗體具有幾乎相同的抗體效價。
實施例2系統性紅斑狼瘡(SLE和抗磷脂綜合癥(APS)患者抗β2-GPI-配體復合物抗體和抗心磷脂抗體的測定比較心磷脂(CL)或化學合成的oxLDL衍生物(Syn-oxLig-1)濃度為50μg/ml，以50μl/well的量加入96孔Immulon 1B(Dynex TechnologiesInc.，Chantilly)ELISA培養板中，物理干燥吸附后，1％BSA封閉，隨后依次加入β2-GPI(15μg/ml，50μl/well)和SLE、APS患者血清樣品(用0.3％的PBS以1∶100稀釋，50μl/well)，室溫下共同孵育1小時，最后與辣根過氧化物酶HRP標記的抗人IgG抗體孵育1小時，顯色后490nm的吸光度測定。在上述各步驟之間，酶標板用0.05％Tween 20的PBS充分洗凈。
上述實驗結果表明，與系統性紅斑狼瘡陰性患者(SLE-)和抗磷脂綜合癥陰性患者(APS-)相比，抗β2-GPI-配體復合物抗體和抗心磷脂抗體在SLE陽性患者和APS患者血清中都顯示了同樣高水平的抗體效價。
權利要求
1.一種檢測血清β2-糖蛋白I及其自身抗體的試劑，是能與血清β2-糖蛋白I特異性結合的氧化低密度脂蛋白衍生化合物，其特征在于其中的氧化低密度脂蛋白衍生物是一種結構為7-酮膽固醇酯衍生物，用于檢測β2-糖蛋白I及其與之相關的疾病。
2.如權利要求1所述試劑，其特征在于用于檢測與血清β2-糖蛋白I相關的動脈硬化和血栓形成發生危險性升高或降低有關的抗體。
3.如權利要求1或2所述試劑，其特征在于氧化低密度脂蛋白活性衍生化合物來源于Cu2+氧化的低密度脂蛋白的脂成分。
4.如權利要求3所述試劑，其特征在于氧化低密度脂蛋白活性衍生化合物其主要活性成分來源于oxLDL脂中膽固醇亞油酸的氧化產物。
5.如權利要求4所述的試劑，其特征在于7-酮膽固醇酯功能衍生物為氧化形式。
6.如權利要求4所述的試劑，其特征在于7-酮膽固醇酯功能衍生物為化學合成形式。
7.如權利要求1或2或4或5或6所述的試劑，其特征在于β2-糖蛋白I及其抗體的測定方法為一種免疫檢測方法。
8.如權利要求7所述的試劑，其特征在于免疫檢測方法為ELISA方法。
9.如權利要求1所述的試劑，其特征在于抗體檢測是一種特異性識別“β2-糖蛋白I-衍生物復合物”的抗體。
10.如權利要求1所述的試劑，其特征在于與抗體相關的疾病為抗磷脂綜合征或血栓癥。
全文摘要
本發明涉及與血清β2－糖蛋白I(β2－GPI)特異性結合的一種氧化低密度脂蛋白衍生化合物7－ketocholesteryl－9－carboxynonanoate的分離或化學合成；以及以本衍生物為底物用于檢測和分離純化β2－糖蛋白I；用以確定與β2－糖蛋白I相關的動脈硬化和血栓形成發生危險性升高或降低有關的抗體檢測試劑。
文檔編號C12Q1/00GK1869696SQ20051004652
公開日2006年11月29日 申請日期2005年5月24日 優先權日2005年5月24日
發明者劉慶平, 劉華 申請人:大連大學