專利名稱：一種微生物菌株及其用于轉(zhuǎn)化頭孢菌素c為脫乙酰頭孢菌素c的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的用于生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)制備脫乙酰頭孢菌素C(DCPC)的紅酵母菌(Rhodotorula.sp)以及利用該菌株制備脫乙?；^孢菌素C的方法。
背景技術(shù)：
頭孢菌素C(Cephalosporin C，簡稱CPC)為一發(fā)酵產(chǎn)品，其結(jié)構(gòu)式為 當(dāng)CPC的3位上脫去乙?；?，即得脫乙酰頭孢菌素C(DeactylCephalosporin C，簡稱DCPC)，其結(jié)構(gòu)式為 DCPC是CPC發(fā)酵生產(chǎn)中的一種雜質(zhì)，由于量小、回收麻煩不值得作為副產(chǎn)品。但其作為半合成頭孢藥物的中間體，具有相當(dāng)?shù)膬r值，可用于多種頭孢藥物的化學(xué)合成，如頭孢氨噻肟鈉、頭孢三嗪、頭孢他啶、頭孢克肟、頭孢地尼、頭孢克洛、頭孢匹洛、頭孢匹姆、頭孢呋新等；且以DCPC作原料用于某些頭孢藥物合成的收率，比用CPC或7-ACA作原料時高出許多，例如日本武田藥廠使用DCPC與CPC相比，合成BMY28142收率高出29.4％，合成FK027收率高出58.99％(2000年醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展規(guī)劃基礎(chǔ)資料專輯P265，國家醫(yī)藥管理總局技術(shù)情況研究所，1988)，葛蘭素公司用DCPC作原料合成頭孢三嗪的收率為97％，約為當(dāng)時國內(nèi)用7-ACA為原料合成頭孢三嗪的1.5倍，Hoffmann-La Roche用DCPC為原料合成頭孢他啶，收率約為當(dāng)時國內(nèi)用7-ACA為原料合成頭孢他啶的2倍(Recl.Trav.Chim.Pay.Bas 112，066-081(1993)P78)。
鑒于DCPC的上述特點，國外對其制備進行了大量的研究，已報道的DCPC的制備方法有兩類1.化學(xué)制備法如CPC堿水解法、內(nèi)酯化合物開環(huán)法等(B.P 1289814；Heymes，Rene etal.Bull.Soc.Chim，F(xiàn)r，563(1974)；USP 4148995)，由于β-內(nèi)酰胺環(huán)對堿的不穩(wěn)定性及收率低等原因，降低了該技術(shù)的應(yīng)用價值。
2.微生物法許多微生物都可用于DCPC的制備，如細(xì)菌、放線菌、酵母菌、CPC產(chǎn)生菌的負(fù)突變株等，已報道的微生物轉(zhuǎn)化法的技術(shù)路線有多種。如1973年藤澤幸夫申請的專利(USP 3926729(1973)，采用CPC產(chǎn)生菌的誘變株發(fā)酵制備DCPC，最終DCPC發(fā)酵單位為1900r/ml。
Alam Smith用培養(yǎng)紅酵母(Rhodotorula)或其它真菌得到的酯酶水解CPC制備DCPC并申請了專利(USP 3912589)。Alam Smith又于1981年提出了生產(chǎn)DCPC代替CPC的想法(日本公開特許公報 昭56-42596)，因為以往的CPC發(fā)酵產(chǎn)物中有15％的β-內(nèi)酰胺類物為DCPC被當(dāng)作雜質(zhì)棄去。Smith在發(fā)酵過程中加入CPC乙酰酯酶，189小時后DCPC比CPC增加88％，盡管如此，該專利的發(fā)酵水平仍然較低(3000-4000r/ml)。
1982年，日本Fujisawa公司開發(fā)了使用產(chǎn)酯酶微生物Aureobasidium pullulans制備DCPC的工藝方法并申報了歐洲專利(EPA0044736)。該專利所用的微生物Aureobasidium pullulans亦為酵母類微生物，在該專利中以CPC鈉鹽為底物，在300ml CPC水溶液中(含CPC鈉鹽7.5g)加入10g Aureobasidium pullulans的濕菌體，在PH4.5、30℃下進行轉(zhuǎn)化，經(jīng)濃縮、75％乙醇結(jié)晶等步驟得DCPC結(jié)晶3.8g，收率50.7％；采用該微生物與產(chǎn)CPC的頂頭孢霉進行混合發(fā)酵，總發(fā)酵周期為5天，經(jīng)檢測CPC可很好地轉(zhuǎn)化為DCPC，但發(fā)酵終點DCPC的濃度為較低，僅有500r/ml。
基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)制備DCPC是近年的一個熱點，國外的一些大制藥公司如LILLY CO ELI、SQUIBB BRISTOL MYERS CO等均開展了此方面的研究，并申請了多個專利(EP1263969；US6180361；EP0465189；WO016767)。雖然發(fā)酵水平大幅提高，但存在工程菌生產(chǎn)能力易退化、發(fā)酵條件要求高、及潛在的環(huán)境安全問題。
發(fā)明內(nèi)容
1、發(fā)明目的本發(fā)明提供一種能有效轉(zhuǎn)化CPC為DCPC的微生物新菌株，即紅酵母菌(Rhodotorula.sp)，其目的在于解決生產(chǎn)脫乙酰頭孢菌素C(DCPC)中存在收率低、成本高、不適于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)等方面存在的問題。
2、技術(shù)方案本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種微生物菌株，其特征是該菌株分類為紅酵母屬，命名為RhodotorulaR-92，此菌株在保藏中心登記入冊編號為CGMCC NO.1277；該微生物菌株，是在CPC發(fā)酵工藝研究過程中經(jīng)過篩選、單挑分離獲得的，其在葡萄糖—蛋白胨培養(yǎng)基中的營養(yǎng)細(xì)胞呈圓形，多出芽；在葡萄糖—蛋白胨—瓊脂培養(yǎng)基上形成紅色的圓形菌落，柔軟、濕潤、有反光，菌落表面平滑，邊緣平整。
一種用微生物菌株轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為脫乙酰頭孢菌素C的方法，其特征在于該方法按以下步驟進行(1).將權(quán)利要求1中所述的微生物菌株Rhodotorula R-92進行常規(guī)培養(yǎng)、發(fā)酵，常規(guī)培養(yǎng)包括斜面培養(yǎng)或液體培養(yǎng)，獲得的培養(yǎng)液或?qū)⑴囵B(yǎng)液離心過濾后得到的濕菌絲體作為生物催化劑；(2).將頭孢菌素C鹽的水溶液或用頭孢菌素C產(chǎn)生菌株制備的頭孢菌素C培養(yǎng)液作為生物轉(zhuǎn)化底物；(3).將(1)的發(fā)酵液，或離心收集的濕菌絲體，加入(2)的底物溶液中進行轉(zhuǎn)化或混合發(fā)酵，得到脫乙酰頭孢菌素C的轉(zhuǎn)化液；
(4).將(3)的轉(zhuǎn)化液，去除菌絲體，經(jīng)樹脂處理、濃縮及溶媒結(jié)晶等步驟得到類白色或淡黃色脫乙酰頭孢菌素C粉末。
步驟(1)中，進行微生物菌株Rhodotorula R-92斜面培養(yǎng)時，培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.5-2％，蛋白胨0.2-1.2％，牛肉膏0.1-1.0％，瓊脂2-2.5％，其余為蒸餾水，各組分含量均按重量體積百分比計，即g/100ml，培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.0-7.0，培養(yǎng)條件110-120℃滅菌30分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面，接種，25-35℃培養(yǎng)2-6天。
步驟(1)中，進行微生物菌株Rhodotorula R-92的液體培養(yǎng)時，培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.5-2.5％，蛋白胨0.2-1.2％，牛肉膏0.1-1.0％，硫酸鎂0.0075-0.05％，其余為蒸餾水，各組分含量均按重量體積百分比計，即g/100ml，培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.0-7.0；培養(yǎng)條件110-120℃滅菌30分鐘，滅菌后冷卻、接種，接種量2-15％，按重量體積百分比計，培養(yǎng)溫度25-35℃，搖床轉(zhuǎn)速100-260r/min，5L發(fā)酵罐，攪拌速度250-300r/min，通氣1∶0.5～1∶1V/V.M，培養(yǎng)時間1-4天，分別作為種子或發(fā)酵培養(yǎng)液。
步驟(3)中濕菌體轉(zhuǎn)化方法底物濃度1-5％，按重量體積百分比計；濕菌體加入量為1-8g/100ml；濕菌體可多次回收使用；轉(zhuǎn)化溫度25-35℃；轉(zhuǎn)化液PH調(diào)至4-7。
步驟(3)中混合發(fā)酵法微生物菌株Rhodotorula R-92種液量2-15％V/V；微生物菌株Rhodotorula R-92加入時間為頭孢菌素C發(fā)酵后48-96小時；混合發(fā)酵溫度25-35℃；攪拌300-1000r/min；通氣量1∶0.5～1∶1V/V.M；控制發(fā)酵液PH5.0-7.0；總發(fā)酵周期140-172小時。
該菌株分類命名是對照《真菌鑒定手冊》(魏景超遺著，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979，上海p103-115)的方法進行的。
3、優(yōu)點及效果(1).微生物性能穩(wěn)定研究使用的Rhodotorula R-92，系自然分離得到的野生菌株，其菌體催化CPC轉(zhuǎn)化為DCPC的能力穩(wěn)定，在本發(fā)明方法的條件下，不受傳代次數(shù)的影響。
(2).所用微生物Rhodotorula R-92的培養(yǎng)、菌體的制備方法簡單易行。
(3).菌體可多次反復(fù)用于轉(zhuǎn)化反應(yīng)，活性無明顯降低。
(4).轉(zhuǎn)化液中CPC的投料濃度高，最高可達(dá)5％。
(5).CPC轉(zhuǎn)化為DCPC的轉(zhuǎn)化率高，最高可達(dá)100％，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報道水平。
(6).R-92可與頂頭孢霉搭配進行混合發(fā)酵生產(chǎn)DCPC，與CPC發(fā)酵相比，相同條件下，混合發(fā)酵的β-內(nèi)酰胺總量高于CPC發(fā)酵，且發(fā)酵終點DCPC的比例高達(dá)90-100％，DCPC的濃度可達(dá)到1.5-3萬γ/ml。具有CPC發(fā)酵技術(shù)的生產(chǎn)廠可以容易地生產(chǎn)DCPC，且生產(chǎn)成本低，與CPC不相上下。
四
附圖1為本發(fā)明產(chǎn)品DCPC的IR(紅外)圖譜；附圖2為本發(fā)明產(chǎn)品DCPC的NMR(核磁)圖譜；附圖3為本發(fā)明使用R-92轉(zhuǎn)化CPC制備DCPC的工藝流程圖；五具體實施例方式本發(fā)明是采用以下方案實施的本發(fā)明由CPC制備DCPC的原理為
本發(fā)明制備DCPC的生物轉(zhuǎn)化方法包括(1)將菌株Rhodotorula R-92進行常規(guī)培養(yǎng)、發(fā)酵，獲得的培養(yǎng)液或?qū)⑴囵B(yǎng)液離心過濾后得到的濕菌絲體作為生物催化劑，常規(guī)培養(yǎng)包括斜面或液體；(2)以CPC的水溶液或用CPC產(chǎn)生菌株制備的CPC培養(yǎng)液作為生物轉(zhuǎn)化底物(3)將(1)的發(fā)酵液或離心收集的濕菌絲體加入(2)的底物溶液中進行轉(zhuǎn)化，生成DCPC(4)將(3)的轉(zhuǎn)化液，去除菌體，經(jīng)樹脂或膜處理、濃縮、及溶媒結(jié)晶步驟得到類白色或淡黃色DCPC粉末。
轉(zhuǎn)化用菌株的培養(yǎng)和發(fā)酵斜面培養(yǎng)配制含葡萄糖0.5-2％，蛋白胨0.2-1.2％，牛肉膏0.1-1.0％，瓊脂2-2.5％，其余為蒸餾水，培養(yǎng)基調(diào)pH5.0-7.0，各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml，下同。110-120℃滅菌30分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面，接種，25-35℃培養(yǎng)2-6天。
種子培養(yǎng)和發(fā)酵配制含葡萄糖0.5-2.5％，蛋白胨0.2-1.2％，牛肉膏0.1-1.0％，硫酸鎂0.0075-0.05％，其余為蒸餾水，培養(yǎng)基調(diào)pH5.0-7.0，裝液量為10-60ml/250ml三角瓶或100-250ml/1000ml三角瓶，或2.5-3.5L/5L發(fā)酵罐，110-120℃滅菌30分鐘，滅菌后冷卻、接種，接種量2-15％(V/V)，培養(yǎng)溫度25-35℃，搖床轉(zhuǎn)速100-260r/min，5L發(fā)酵罐，攪拌速度250-300r/min，通氣1∶0.5～1∶1 V/V.M，培養(yǎng)時間1-4天，分別作為種子或發(fā)酵培養(yǎng)液。
底物的制備CPC水溶液的制備，將CPC鈉鹽或鉀鹽按1-5％(按重量體積百分比計)濃度溶解于PH4.5-7.0的緩沖液中。
配制頂頭孢霉的培養(yǎng)基，接入頂頭孢霉菌種，通氣培養(yǎng)50-100小時的培養(yǎng)液作為轉(zhuǎn)化的底物。
微生物的轉(zhuǎn)化反應(yīng)用培養(yǎng)后獲得的濕菌體，以CPC鹽的水溶液為底物，加濕菌體的量為1-8g/100ml轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化溫度25-35℃，通過高壓液相色譜分析測定轉(zhuǎn)化反應(yīng)的終點。菌絲體可以反復(fù)回用，進行多次轉(zhuǎn)化反應(yīng)或者，將Rhodotorula R-92的種液，加到培養(yǎng)適宜時間(48-96小時)的頂頭孢霉發(fā)酵液中，與之共同培養(yǎng)進行混合發(fā)酵，Rhodotorula R-92種液的加入量2-15％(V/V)，培養(yǎng)溫度25-35℃，攪拌速度300-1000r/min，通氣量1∶0.5～1∶1.5 V/V.M，PH 5.0-7.0，總培養(yǎng)時間140-180小時。
CPC與DCPC的HPLC(高效液相色譜)測定Waters 600泵，Waters486紫外檢測器，檢測波長254nm；UBondapakC18 3.9×150mm色譜柱；流動相3％甲醇，97％0.02M NaH2PO4水溶液；流速1ml/minDCPC的提取HPLC檢測CPC的轉(zhuǎn)化情況決定轉(zhuǎn)化結(jié)束。轉(zhuǎn)化液4000rpm離心，收集離心液，以0.8μ膜過濾或用樹脂脫色，減壓濃縮至體積為轉(zhuǎn)化液的1/3，加入3-4倍體積的乙醇，攪拌結(jié)晶、靜置2hr，抽濾、干燥得到微黃色粉末。
實例1R-92菌體培養(yǎng)基葡萄糖0.5％，蛋白胨1.2％，牛肉膏0.1％，硫酸鎂0.05％，其余為蒸餾水，調(diào)pH5.0，每250ml三角瓶裝入10ml配制好的培養(yǎng)基，115℃蒸汽滅菌30分，接入R-92菌種，25-27℃，100r/min振蕩培養(yǎng)72小時，將培養(yǎng)液于4000r/min離心得R-92濕菌體。
CPCNa0.5g溶解于pH5.8的緩沖液50ml中，加入上述制備的濕菌體0.5g，于27℃、200r/min轉(zhuǎn)化38小時，HPLC測定轉(zhuǎn)化率80％，轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心，離心液用0.8μm的膜過濾，40℃減壓濃縮至原體積的1/5，加入4倍量的乙醇，攪拌結(jié)晶、抽濾、干燥得微黃色粉末0.22g。
實例2菌體培養(yǎng)基葡萄糖1％，蛋白胨1％，牛肉膏0.3％，硫酸鎂0.02％，其余為蒸餾水，調(diào)培養(yǎng)基pH6.0，每250ml三角瓶裝入50ml培養(yǎng)基，115℃蒸汽滅菌30分，接入R-92，于240r/min、30℃振蕩培養(yǎng)48小時，離心得菌體。
CPCNa1.5g溶于50mlpH5.8磷酸緩沖液中，加入2g濕菌體，28-30℃，200r/min振蕩轉(zhuǎn)化，HPLC測定28小時轉(zhuǎn)化結(jié)束，轉(zhuǎn)化率100％。轉(zhuǎn)化液4000r/min離心去菌體，離心液0.8μm膜過濾，40℃減壓濃縮至原體積的1/3，加入4倍體積乙醇，攪拌結(jié)晶、抽濾、干燥得微黃色粉末1.1g。
實例3同實例2，不同之處在于轉(zhuǎn)化液的PH為4.5，轉(zhuǎn)化時間為50小時，HPLC測定轉(zhuǎn)化率為49％，轉(zhuǎn)化液經(jīng)離心去除菌體，經(jīng)陰離子樹脂柱除去未轉(zhuǎn)化的CPC，再經(jīng)濃縮結(jié)晶等步驟得DCPC固體0.36g。
實例4同實例2，不同之處在于轉(zhuǎn)化液的PH為7.0，轉(zhuǎn)化時間40小時，HPLC測定轉(zhuǎn)化率為85％，轉(zhuǎn)化液按實例2的處理方法進行，結(jié)果得淡黃色DCPC結(jié)晶0.8g。
實例5菌體培養(yǎng)基葡萄糖2.5％，蛋白胨0.2％，牛肉膏1.0％，硫酸鎂0.0075％，其余為蒸餾水，培養(yǎng)基pH調(diào)到7.0左右，1000ml三角瓶中裝入200ml培養(yǎng)基，115℃滅菌30分鐘，接入R-92菌種，于260r/min、33℃培養(yǎng)30小時，離心得濕菌體。
將CPCNa 9g溶于200ml pH5.8的緩沖液中，加入上述濕菌體16g，32℃、200r/min轉(zhuǎn)化32小時，HPLC測定轉(zhuǎn)化率為82％，離心去除菌體，樹脂處理后濃縮至轉(zhuǎn)化液體積的1/3，加入4倍體積的乙醇，攪拌結(jié)晶，抽濾、干燥后得DCPC固體5.0g。
實例6按實例2的配比配制R-92的培養(yǎng)基3000ml，裝入5L發(fā)酵罐，115℃滅菌30分，按10％的比例接入R-92種液，通氣量1∶0.75V/V.M，攪拌速度300r/min，pH控制6.0，30℃培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)液4000r/min離心后得濕菌體。
將6g CPCNa溶于200ml pH5.8的磷酸鹽緩沖液中，加入濕菌體10g，于28.5℃、200r/min振蕩轉(zhuǎn)化，經(jīng)HPLC檢測30小時轉(zhuǎn)化結(jié)束，轉(zhuǎn)化率99％，轉(zhuǎn)化液于4000r/min離心收集上清液，經(jīng)樹脂脫色，濃縮至轉(zhuǎn)化液體積的1/3，加入4倍體積乙醇結(jié)晶，過濾、干燥后得白色DCPCNa固體4.5g。
實例7濕菌體制備同實例6，將CPCNa 8g溶于pH5.8的磷酸鹽緩沖液200ml中，然后加入制備好的濕菌體12g，進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，HPLC檢轉(zhuǎn)化結(jié)束后，將轉(zhuǎn)化液離心，收集到的濕菌體加到配制好的CPC溶液中繼續(xù)進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，依此反復(fù)，試驗結(jié)果見下表濕菌體反復(fù)分批轉(zhuǎn)化結(jié)果
實例85L發(fā)酵罐中裝入頂頭孢霉培養(yǎng)基2700ml，其配制方法如下玉米漿8％，糊精6％，淀粉3％，α-淀粉酶0.02％，硫酸銨0.5％，磷酸二氫鉀0.9％，硫酸鎂0.3％，DL-蛋氨酸0.6％，硫酸錳0.01％，硫酸鋅0.01％，亞磷酸0.06％，碳酸鈣0.75％，其余為蒸餾水，115℃滅菌30分鐘，接入頂頭孢霉菌種，培養(yǎng)溫度27℃，培養(yǎng)過程中根據(jù)代謝情況，控制攪拌速度300-1000r/min，通氣量1∶0.5～1∶1 V/V.M，氨水控制發(fā)酵液PH6.0，培養(yǎng)72小時后接入R-92種液300ml，繼續(xù)培養(yǎng)90小時，HPLC檢測發(fā)酵液中DCPC的濃度為22,936γ/ml，DCPC的比率(DCPC/DCPC+CPC)為95.5％，而同時進行的單純CPC發(fā)酵，DCPC+CPC的總濃度只有16897γ/ml。
實例9同實例8，不同之處在于頂頭孢霉發(fā)酵液的體積為2550ml，R-92種液的加入量為450ml，加入時間為頂頭孢霉培養(yǎng)96小時，繼續(xù)培養(yǎng)的時間為80小時，HPLC測定發(fā)酵液中DCPC的濃度為202,36γ/ml，DCPC的比率(DCPC/DCPC+CPC)為90.5％，而同時進行的單純CPC發(fā)酵，DCPC+CPC的總濃度只有18762γ/ml。
實例10同實例8，不同之處在于R-92的加入量為100ml，加入時間為頂頭孢霉培養(yǎng)48小時，繼續(xù)培養(yǎng)的時間為96小時，HPLC測定發(fā)酵液中DCPC的濃度為160,04γ/ml，DCPC的比率(DCPC/DCPC+CPC)為89.5％，而同時進行的單純CPC發(fā)酵，DCPC+CPC的總濃度只有149,68γ/ml。
權(quán)利要求
1.一種微生物菌株，其特征是該菌株分類為紅酵母屬，命名為Rhodotorula R-92，此菌株在保藏中心登記入冊編號為CGMCC NO.1277；該微生物菌株，是在CPC發(fā)酵工藝研究過程中經(jīng)過篩選、單挑分離獲得的，其在葡萄糖-蛋白胨培養(yǎng)基中的營養(yǎng)細(xì)胞呈圓形，多出芽；在葡萄糖-蛋白胨-瓊脂培養(yǎng)基上形成紅色的圓形菌落，柔軟、濕潤、有反光，菌落表面平滑，邊緣平整。
2.一種用微生物菌株轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為脫乙酰頭孢菌素C的方法，其特征在于該方法按以下步驟進行(1).將權(quán)利要求1中所述的微生物菌株Rhodotorula R-92進行斜面或液體培養(yǎng)、發(fā)酵，獲得的培養(yǎng)液或?qū)⑴囵B(yǎng)液離心過濾后得到的濕菌絲體作為生物催化劑；(2).將頭孢菌素C鹽的水溶液或用頭孢菌素C產(chǎn)生菌株制備的頭孢菌素C培養(yǎng)液作為生物轉(zhuǎn)化底物；(3).將(1)的發(fā)酵液，或離心收集的濕菌絲體，加入(2)的底物溶液中進行轉(zhuǎn)化或混合發(fā)酵，得到脫乙酰頭孢菌素C的轉(zhuǎn)化液；(4).將(3)的轉(zhuǎn)化液，去除菌絲體，經(jīng)樹脂處理、濃縮及溶媒結(jié)晶步驟得到類白色或淡黃色脫乙酰頭孢菌素C粉末。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種用微生物菌株轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為脫乙酰頭孢菌素C的方法，其特征在于步驟(1)中，進行微生物菌株Rhodotorula R-92斜面培養(yǎng)時，培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.5-2％，蛋白胨0.2-1.2％，牛肉膏0.1-1.0％，瓊脂2-2.5％，其余為蒸餾水，各組分含量均按重量體積百分比計，即g/100ml，培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.0-7.0，培養(yǎng)條件110-120℃滅菌30分鐘，滅菌后冷卻、制成斜面，接種，25-35℃培養(yǎng)2-6天。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種用微生物菌株轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為脫乙酰頭孢菌素C的方法，其特征在于步驟(1)中，進行微生物菌株Rhodotorula R-92的液體培養(yǎng)時，培養(yǎng)基組成為葡萄糖0.5-2.5％，蛋白胨0.2-1.2％，牛肉膏0.1-1.0％，硫酸鎂0.0075-0.05％，其余為蒸餾水，各組分含量均按重量體積百分比計；即g/100ml，培養(yǎng)基的pH值調(diào)至5.0-7.0，培養(yǎng)條件110-120℃滅菌30分鐘，滅菌后冷卻、接種，接種量2-15％，按重量體積百分比計，培養(yǎng)溫度25-35℃，搖床轉(zhuǎn)速100-260r/min，5L發(fā)酵罐，攪拌速度250-300r/min，通氣1∶0.5～1∶1 V/V.M，培養(yǎng)時間1-4天，分別作為種子或發(fā)酵培養(yǎng)液。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種用微生物菌株轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為脫乙酰頭孢菌素C的方法，其特征在于步驟(3)中濕菌體轉(zhuǎn)化方法底物濃度1-5％，按重量體積百分比計；濕菌體加入量為1-8g/100ml；濕菌體可多次回收使用；轉(zhuǎn)化溫度25-35℃；轉(zhuǎn)化液PH調(diào)至4-7。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種用微生物菌株轉(zhuǎn)化頭孢菌素C為脫乙酰頭孢菌素C的方法，其特征在于步驟(3)中混合發(fā)酵法微生物菌株Rhodotorula R-92種液量2-15％V/V；微生物菌株Rhodotorula R-92加入時間為頭孢菌素C發(fā)酵后48-96小時；混合發(fā)酵溫度25-35℃；攪拌300-1000r/min；通氣量1∶0.5～1∶1V/V.M；控制發(fā)酵液PH5.0-7.0；總發(fā)酵周期140-172小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的用于生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)制備脫乙酰頭孢菌素C(DCPC)的紅酵母菌(Rhodotorula.sp)以及利用該菌株制備脫乙酰基頭孢菌素C的方法。一種微生物菌株，其特征是該菌株分類為紅酵母屬，命名為Rhodotorula R－92，此菌株在保藏中心登記入冊編號為CGMCC NO.1277；該轉(zhuǎn)換方法將菌株作為生物轉(zhuǎn)化劑；在以頭孢菌素C鹽的水溶液作為生物轉(zhuǎn)化底物；將轉(zhuǎn)化劑加入到底物進行轉(zhuǎn)化或混合發(fā)酵，再經(jīng)樹脂處理、濃縮、溶媒結(jié)晶，得到類白色或微黃色的脫乙酰頭孢菌素C粉末。本發(fā)明的目的在于解決生產(chǎn)脫乙酰頭孢菌素C(DCPC)中存在收率低、成本高、不適于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)等方面存在的問題。
文檔編號C12N1/16GK1667116SQ20051004577
公開日2005年9月14日 申請日期2005年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月27日
發(fā)明者盧法章, 馮麗艷, 張鳳云, 馮德成, 郭鳳堯, 劉輝, 楊國宏, 安靜嫻 申請人:東北制藥總廠