專利名稱：一種人角膜內皮細胞系的構建方法
技術領域：
本發明涉及一種利用人角膜建立角膜內皮細胞系的構建方法。
背景技術：
高等動物的角膜內皮細胞層由單層六角形枝狀細胞鑲嵌而成，但這層細胞到成年后便失去分裂能力，受到輕度損傷時只有依靠鄰近細胞擴張和移行來填補缺損區。一旦角膜內皮細胞密度低于維持內皮細胞生理功能的臨界密度，角膜將出現不可逆之病變。目前，我國約有近百萬角膜內皮盲患者，盡管他們絕大多數可以通過角膜移植來治愈，但由于捐獻角膜的數量極其有限而致使全國每年完成的角膜移植手術僅有2000～2500例，絕大多數患者因得不到移植角膜而無法重見光明。近年來興起的角膜組織工程，為人造眼角膜帶來了新的希望，但如何在體外獲得可用于人工角膜內皮構建的大量角膜內皮細胞，一直是該領域的研究熱點和主攻方向之一。
對哺乳動物角膜內皮細胞的體外培養研究開始于20世紀60年代，Slick WC等首次利用酶消化法獲得了家兔角膜內皮細胞并成功啟動了其體外培養。隨后，學者們先后對兔、小鼠、大鼠、牛、豬、貓和人角膜內皮細胞的體外培養進行了研究。后來，學者們又對不同哺乳動物角膜內皮細胞的體外培養條件進行了摸索，發現一些生長因子對角膜內皮細胞具有一定的促分裂作用，但離細胞系的建立還相距甚遠。20世紀90年代，許多學者紛紛利用猿猴紅皰疹病毒、淋巴瘤病毒、猿猴紅皰疹病毒T抗原和不同癌基因等對人、兔和小鼠的角膜內皮細胞進行了轉染研究，獲得了可傳代培養的角膜內皮細胞，甚至獲得了幾個不死的細胞系，但由于細胞攜帶腫瘤病毒基因或癌基因而具有潛在的致瘤性，而無法用于人工角膜的構建和臨床角膜移植手術。因此，盡早建立起一種不經過病毒或癌基因轉染的、可直接用于人工角膜構建和臨床角膜移植手術的人角膜內皮細胞系，已成為全世界眼科專家和細胞生物學家的主攻目標，也是人工角膜構建成功、臨床應用以及造福全世界角膜盲患者的關鍵之所在。
發明內容
本發明的目的就是利用人角膜，提供一種建立人角膜內皮細胞系的技術——一種人角膜內皮細胞系的構建方法。
從眼庫中取出人角膜，分別用氯化汞溶液和慶大霉素消毒15～35分鐘；于超凈工作臺中，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養皿中，向凹陷區加入胰蛋白酶溶液消化數分鐘后；把角膜平均剪成4片角膜片，按內皮面朝下的方向貼入24孔培養板的孔底，加入含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液，置于5％二氧化碳培養箱中、37℃下進行貼板培養；再采用時間梯度連續揭膜培養法獲得人角膜內皮細胞，收集所得細胞后集中于2個培養孔中，于培養箱中放置12～24小時，將每個培養孔中加入1毫升的人角膜內皮細胞專用培養液，置5％二氧化碳培養箱中于37℃培養；每間隔3～5天更換上述專用培養液1次，以去除未貼壁的死細胞。待人角膜內皮細胞長成單層后，用0.2～0.5％胰蛋白酶溶液消化制成細胞懸液，按1瓶傳2瓶的方式進行傳代培養；待人角膜內皮細胞再次長成單層后，仍以相同方法進行傳代。
本發明采用的時間梯度連續揭膜培養法的具體操作為當角膜片培養18～48小時后，取出角膜片轉貼于另一新培養孔中，加入同樣培養液繼續培養；于培養箱中12～24小時后，取出角膜片再轉貼于另一新培養孔中，加入同樣培養液繼續培養；6～12小時后，取出角膜片，于倒置光學顯微鏡下挑選出只含有人角膜內皮細胞的培養孔。
所用人角膜內皮細胞專用培養液的配方為DMEM/F12培養液，20％胎牛血清，0.25‰～1‰硫酸軟骨素，0.05‰～0.15‰羧甲基殼多糖；為了促進人角膜內皮細胞的分裂和快速增殖，本發明又添加了0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、0.05‰～0.15‰的氨基葡萄糖鹽酸鹽、0.01‰～0.02‰的人表皮細胞生長因子和0.01‰～0.02‰的人堿性成纖維細胞生長因子；為了獲得細胞的最佳增殖效果，本發明又在上述專用培養液的基礎上添加了0.0025‰～0.0075‰的牛眼生素。
經這種方法所獲得的傳代細胞可傳60代以上，本發明所構建的角膜內皮細胞系現已傳至第106代。該細胞建系技術的主要特點是細胞系可以連續傳代，能提供出大量的人角膜內皮細胞；細胞系細胞未經任何轉染，沒有致瘤性，可直接應用于人工角膜的研制和臨床應用；應用于人工角膜生產和臨床治療的成本低。
具體實施例方式
1、角膜片貼板培養的啟動從眼庫中取出2個完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入10～30毫升濃度為0.9％的生理鹽水，清洗5～9分鐘；吸出生理鹽水后，加入10～30毫升的濃度為1/2000～1/6000的氯化汞溶液浸泡10～20分鐘，進行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入10～30毫升的濃度為20％～70％的慶大霉素，浸泡15～35分鐘，于超凈工作臺中進行二次消毒；以下操作均在超凈工作臺中進行，所有用品均是無菌的；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養皿中，向凹陷區加入0.2～0.5％胰蛋白酶0.5～1毫升消化3～6分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心點把每個角膜平均剪成4片，用眼科鑷將角膜內皮面朝下貼入24孔培養板的孔底，每孔貼入4塊角膜片；向貼入角膜片的培養孔中加入0.1～0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液；將培養板放入5％二氧化碳培養箱中，37℃進行培養；2、然后以時間梯度連續揭膜培養貼板培養24～48小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，再轉貼于同一塊24孔培養板的另一個新培養孔中，加入0.1～0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液，于同樣條件下繼續培養；12～24小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，再轉貼于同一塊24孔培養板的另一個新培養孔中，再6～12小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，于倒置光學顯微鏡下觀察各培養孔的細胞，挑選出只含有人角膜內皮細胞的培養孔；3、人角膜內皮細胞原代培養的啟動用滴管輕輕吹下上述只含有人角膜內皮細胞培養孔中的細胞，收集后集中放入2～4個培養孔中，于5％二氧化碳培養箱中、37℃放置12～24小時；4、人角膜內皮細胞專用培養液的配制取常規配制的DMEM/F12培養液3.0毫升，然后依次加入硫酸軟骨素1～4毫克和羧甲基殼多糖0.2～0.6毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入0.8毫升胎牛血清，補加常規配制的DMEM/F12培養液至4.0毫升，即為本發明的人角膜內皮細胞專用培養液。
為了促進人角膜內皮細胞的分裂和快速增殖，在上述專用培養液的基礎上又添加了0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、0.05‰～0.15‰的氨基葡萄糖鹽酸鹽、0.01‰～0.02‰的人表皮細胞生長因子和0.01‰～0.02‰的堿性成纖維細胞生長因子；為了建立人角膜內皮細胞的最佳增殖條件，本發明在上述專用培養液的基礎上又添加了0.0025‰～0.0075‰的牛眼生素。
5、將每個培養孔中加入1毫升的上述專用培養液，于5％二氧化碳培養箱中、37℃培養；每間隔3～5天，除去舊培養液，以去除未貼壁的死細胞，加入1毫升新鮮的人角膜內皮細胞專用培養液；6、人角膜內皮細胞的傳代培養待人角膜內皮細胞長成單層后，吸出培養孔中的培養液，向每個培養孔中加入0.1～0.5毫升濃度為0.2～0.5％的胰蛋白酶溶液，靜置消化3～5分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養孔中加入1毫升的上述專用培養液，用滴管吹打培養孔底3～5分鐘制成人角膜內皮細胞懸液；從每培養孔中分別取出0.5毫升角膜內皮細胞懸液，分別加入到新的培養孔中，每個培養孔補加上述專用培養液0.5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜內皮細胞再次長成單層后，仍以上述的相同方法進行傳代培養。
實施例1從眼庫中取出2個完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入10毫升濃度為0.9％的生理鹽水，清洗5分鐘；吸出生理鹽水后，加入10毫升的濃度為1/6000的氯化汞溶液浸泡10分鐘，進行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入10毫升的濃度為20％的慶大霉素，浸泡15分鐘，于超凈工作臺中進行二次消毒；以下操作均在超凈工作臺中進行，所有用品均是無菌的；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養皿中，向凹陷區加入0.2％胰蛋白酶0.5毫升消化3分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心點把每個角膜平均剪成4片，用眼科鑷將角膜內皮面朝下貼入24孔培養板的孔底，每孔貼入4塊角膜片；向貼入角膜片的培養孔中加入0.1毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液；將培養板放入5％二氧化碳培養箱中，37℃進行培養。貼板培養24小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，再轉貼于同一塊24孔培養板的另一個新培養孔中，加入0.1毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液，于同樣條件下繼續培養；12小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，再轉貼于同一塊24孔培養板的另一個新培養孔中，加入0.1毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液，于同樣條件下繼續培養；6小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，于倒置光學顯微鏡下觀察各培養孔的細胞，挑選出只含有人角膜內皮細胞的培養孔。用滴管輕輕吹下只含有人角膜內皮細胞培養孔中的細胞，收集后集中放入2個培養孔中，于5％二氧化碳培養箱中、37℃放置12小時。取常規配制的DMEM/F12培養液3.0毫升，然后依次加入硫酸軟骨素1毫克和羧甲基殼多糖0.2毫克，完全溶解后用0.22微米的微孔濾膜過濾除菌，加入0.8毫升胎牛血清，補加常規配制的DMEM/F 12培養液至4.0毫升，即為人角膜內皮細胞專用培養液。將每個培養孔中加入1毫升的上述專用培養液，于5％二氧化碳培養箱中、37℃培養；每間隔3天，除去舊培養液，以去除未貼壁的死細胞，加入1毫升新鮮的人角膜內皮細胞專用培養液。待人角膜內皮細胞長成單層后，吸出培養孔中的培養液，向每個培養孔中加入0.1毫升濃度為0.2％的胰蛋白酶溶液，靜置消化3分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養孔中加入1毫升的上述專用培養液，用滴管吹打培養孔底3分鐘制成人角膜內皮細胞懸液；從每個培養孔中分別取出0.5毫升角膜內皮細胞懸液，分別加入到新的培養孔中，每培養孔補加上述專用培養液0.5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜內皮細胞再次長成單層后，仍以上述的相同方法進行傳代培養。
實施例2從眼庫中取出2個完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入30毫升濃度為0.9％的生理鹽水，清洗9分鐘；吸出生理鹽水后，加入30毫升的濃度為1/2000的氯化汞溶液浸泡20分鐘，進行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入30毫升的濃度為70％的慶大霉素，浸泡35分鐘，于超凈工作臺中進行二次消毒；以下操作均均為無菌狀態；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養皿中，向凹陷區加入0.5％胰蛋白酶1毫升消化6分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心點把每個角膜平均剪成4片，用眼科鑷將角膜內皮面朝下貼入24孔培養板的孔底，每孔貼入4塊角膜片；向貼入角膜片的培養孔中加入0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液；將培養板放入5％二氧化碳培養箱中，37℃進行培養。貼板培養48小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，再轉貼于同一塊24孔培養板的另一個新培養孔中，加入0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液，于同樣條件下繼續培養；24小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，再轉貼于同一塊24孔培養板的另一個新培養孔中，加入0.3毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液，于同樣條件下繼續培養；12小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，于倒置光學顯微鏡下觀察各培養孔的細胞，挑選出只含有人角膜內皮細胞的培養孔。用滴管輕輕吹下只含有人角膜內皮細胞培養孔中的細胞，收集后集中放入4個培養孔中，于5％二氧化碳培養箱中、37℃放置24小時。在人角膜內皮細胞專用培養液中，又添加了0.15‰的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、0.15‰的氨基葡萄糖鹽酸鹽、0.02‰的人表皮細胞生長因子和0.02‰的堿性成纖維細胞生長因子，更有利于人角膜內皮細胞的分裂和快速增殖。將每個培養孔中加入1毫升的上述培養液，于5％二氧化碳培養箱中、37℃培養；每間隔5天，除去舊培養液，以去除未貼壁的死細胞，加入1毫升新鮮的上述培養液。待人角膜內皮細胞長成單層后，吸出培養孔中的培養液，向每個培養孔中加入0.5毫升濃度為0.5％的胰蛋白酶溶液，靜置消化5分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養孔中加入1毫升的上述培養液，用滴管吹打培養孔底5分鐘制成人角膜內皮細胞懸液；從每培養孔中分別取出0.5毫升角膜內皮細胞懸液，分別加入到新的培養孔中，每培養孔補加上述培養液0.5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜內皮細胞再次長成單層后，仍以上述的相同方法進行傳代培養。
實施例3從眼庫中取出2個完整的人角膜，放入100毫升玻璃燒杯中，加入20毫升濃度為0.9％的生理鹽水，清洗7分鐘；吸出生理鹽水后，加入20毫升的濃度為1/4000的氯化汞溶液浸泡15分鐘，進行首次消毒；然后，吸出氯化汞溶液，再加入20毫升的濃度為50％的慶大霉素，浸泡20分鐘，于超凈工作臺中進行二次消毒；以下操作均為無菌狀態；用眼科鑷從慶大霉素液中取出角膜，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養皿中，向凹陷區加入0.4％胰蛋白酶0.7毫升消化5分鐘；去除胰蛋白酶液，用眼科剪沿角膜中心點把每個角膜平均剪成4片，用眼科鑷將角膜內皮面朝下貼入24孔培養板的孔底，每孔貼入4塊角膜片；向貼入角膜片的培養孔中加入0.2毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液；將培養板放入5％二氧化碳培養箱中，37℃進行培養。貼板培養36小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，再轉貼于同一塊24孔培養板的另一個新培養孔中，加入0.2毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液，于同樣條件下繼續培養；18小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，再轉貼于同一塊24孔培養板的另一個新培養孔中，加入0.2毫升含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液，于同樣條件下繼續培養；9小時后，用眼科鑷取出培養孔中的角膜片，于倒置光學顯微鏡下觀察各培養孔的細胞，挑選出只含有人角膜內皮細胞的培養孔。用滴管輕輕吹下只含有人角膜內皮細胞培養孔中的細胞，收集后集中放入3個培養孔中，于5％二氧化碳培養箱中、37℃放置18小時。在上述人角膜內皮細胞專用培養液中，又添加了0.15‰的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、0.15‰的氨基葡萄糖鹽酸鹽、0.02‰的人表皮細胞生長因子、0.02‰的堿性成纖維細胞生長因子和0.005‰的牛眼生素，以滿足人角膜內皮細胞的最佳增殖條件。將每個培養孔中加入1毫升的上述培養液，于5％二氧化碳培養箱中、37℃培養；每間隔4天，除去舊培養液，以去除未貼壁的死細胞，加入1毫升新鮮的上述培養液。待人角膜內皮細胞長成單層后，吸出培養孔中的培養液，向每個培養孔中加入0.3毫升濃度為0.2～0.5％的胰蛋白酶溶液，靜置消化4分鐘；吸去胰蛋白酶溶液，每培養孔中加入1毫升的上述培養液，用滴管吹打培養孔底4分鐘制成人角膜內皮細胞懸液；從每培養孔中分別取出0.5毫升角膜內皮細胞懸液，分別加入到新的培養孔中，每培養孔補加上述培養液0.5毫升，使之最終體積至1毫升；待人角膜內皮細胞再次長成單層后，仍以上述的相同方法進行傳代培養。
權利要求
1.一種人角膜內皮細胞系的構建方法，首先從眼庫中取出人角膜，分別用氯化汞溶液和慶大霉素消毒后置于超凈工作臺中，將角膜的凹面朝上平放于玻璃培養皿中，向凹陷區加入胰蛋白酶溶液消化數分鐘后；再把角膜平均剪成4片，按內皮面朝下的方向貼入24孔培養板的孔底，加入含有20％胎牛血清的DMEM/F12培養液，置于5％二氧化碳培養箱中、37℃進行貼板培養，并以時間梯度連續揭膜的培養方法將獲得的人角膜內皮細胞，于培養箱中放置12～24小時，在每個培養孔中加入1毫升的人角膜內皮細胞專用培養液，然后置5％二氧化碳培養箱中于37℃培養；每間隔3～5天更換人角膜內皮細胞專用培養液1次，待人角膜內皮細胞長成單層后，用0.2～0.5％胰蛋白酶溶液消化制成細胞懸液，按1瓶傳2瓶的方式進行傳代培養；待人角膜內皮細胞再次長成單層后，仍以相同方法進行傳代。
2.如權利要求1所述的構建方法，其特征是上述時間梯度連續揭膜的培養方法是將角膜片培養24～48小時后，取出角膜片轉貼于另一新培養孔中，加入同樣培養液繼續培養；于培養箱中12～24小時后，取出角膜片再轉貼于另一新培養孔中，再加入同樣培養液繼續培養；6～12小時后，取出角膜片，于倒置光學顯微鏡下挑選出只含有人角膜內皮細胞的培養孔中的角膜內皮細胞。
3.如權利要求1所述的構建方法，其特征是所述人內皮細胞專用培養液配方為DMEM/F12培養液，以及20％胎牛血清，0.25‰～1‰硫酸軟骨素和0.05‰～0.15‰羧甲基殼多糖。
4.如權利要求3所述的構建方法，其特征是上述人內皮細胞專用培養液中又添加了0.05‰～0.15‰的N-乙酰葡萄糖鹽酸鹽、0.05‰～0.15‰的氨基葡萄糖鹽酸鹽、0.01‰～0.02‰的人表皮細胞生長因子和0.01‰～0.02‰的人堿性成纖維細胞生長因子。
5.如權利要求4所述的構建方法，其特征是在4中所述內皮細胞培養液中還添加了0.0025‰～0.0075‰的牛眼生素。
全文摘要
一種人角膜內皮細胞系的構建方法，它是以角膜內皮為材料，先將角膜內皮面朝下進行貼板培養，采用時間梯度連續貼膜法獲得純凈角膜內皮細胞，在含20％胎牛血清、硫酸軟骨素氧化降解物、表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、牛眼生素的DMEM/F12培養液中培養；采用胰蛋白酶消化法進行傳代培養。該技術工藝科學合理，經這種方法所獲得的傳代細胞目前已傳至第106代。本發明的角膜內皮細胞未經任何病毒或癌基因轉染，因此獲得的人角膜內皮細胞沒有任何致瘤性，可望直接用于人工角膜生產和臨床應用。
文檔編號C12N5/08GK1749393SQ20051004414
公開日2006年3月22日 申請日期2005年7月27日 優先權日2005年7月27日
發明者樊廷俊, 付永鋒, 叢日山, 湯志宏, 孫文杰, 于秋濤, 王晶, 趙君 申請人:中國海洋大學