專利名稱：：一種昆蟲病原線蟲共生菌的分離方法
技術領域：
：本發明涉及一種昆蟲病原線蟲共生菌分離的方法，具體說是嗜線蟲致病桿菌的分離方法。
背景技術：
：隨著全社會環保意識的日益增強，化學農藥大量使用帶來的環境污染、生態平衡破壞等副作用受到各國的高度重視，控制全球化合物的生物積聚的呼吁越來越強烈，化學農藥的生產、使用面臨嚴峻的挑戰。因此，對害物高效、對非靶標生物及環境安全的“生物合理農藥”(Biorationalpesticides)或“環境相容性農藥”(Environmentacceptablepesticides)的研究開發工作正方興未艾的開展起來，成為一個最誘人的領域。創制新型“生物合理農藥”的一條重要途徑是研究和開發生物源農藥，這是因為生物源農藥在生物體內、環境中容易降解，對人畜、天敵等非靶標生物比較安全，對環境友好，它能較好地符合有害生物綜合治(IPM)原則中對農藥的要求。因此，隨著生物技術的發展，生物源農藥，特別是微生物源農藥的研究開發與利用日益受到重視。昆蟲病原線蟲(Entomopathogenicnematode)是昆蟲的專化性寄生天敵，一般專指斯氏線蟲科(Steinernematidae)的斯氏線蟲屬(Steinernema)和異小桿線蟲科(Heterohabditidae)的異小桿屬(Heterohabditis)種類，是一類重要的生物防治因子。二屬分別與嗜線蟲致病桿菌屬(Xenorhabdus)和發光桿菌屬(Photorhabdus)共生，共同作用殺死寄主昆蟲。這兩類線蟲由于殺蟲能力強，是最具應用潛力的昆蟲病原線蟲。它們之間的共生關系可以概括為共生菌存在于線蟲的腸道內，線蟲攜帶共生菌進入寄主昆蟲體內，將共生菌釋放到昆蟲的血腔中；共生菌在昆蟲血腔內繁殖，產生毒素和抑菌物質，使昆蟲患敗血癥，一般在48小時內死亡；共生菌分解營養物質，提供線蟲繁殖發育所需的營養；同時共生菌產生的抗生素能抑制其它雜菌的污染，為線蟲的生長發育繁殖提供理想的環境。作為一種生物殺蟲劑，昆蟲病原線蟲寄主范圍廣泛，具主動搜索能力，對土棲性、鉆蛀性與隱蔽性害蟲有特殊防效，對人畜安全，不污染環境，亦不會產生抗性，并可工廠化生產，因此已廣泛應用于防治農林及牧草等害蟲，已引起國內外眾多學者及商業部門的高度重視，其應用規模逐漸擴大，全球約15家公司進行昆蟲病原線蟲的商品化生產。然而成功地利用線蟲防治農林及牧草等害蟲僅是極少數昆蟲，應用面積有限，限制其發展的主要因素是①較高的生產成本；②難以將害蟲控制到經濟閾值水平之下；③施用后持效性差；④難以如化學農藥一樣常溫下保存和運輸，不具備內吸作用，不能葉面噴施；⑤受環境因子特別是溫度和太陽輻射的影響較大，因此它的應用范圍受到了限制。這使得在昆蟲病原線蟲致病性中起關健作用的共生細菌的研究日益受到重視；另外，由于Bt的大量使用和轉Bt殺蟲晶體蛋白(ICPs)基因cry抗蟲植物的大面積種植，害蟲對Bt及轉基因抗蟲植物的抗性不斷增大，尋找新的殺蟲蛋白和殺蟲基因成為當務之急。昆蟲病原線蟲共生菌是寄生于昆蟲病原線蟲腸道內的一類細菌，屬腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，兼性厭氧、化能異養，革蘭氏染色陰性。包括致病桿菌屬(Xenorhabdus)和光桿狀菌屬(Photorhabdus)，分別與斯氏線蟲屬(Steinernema)和異小桿線蟲屬(Heterorhabditis)線蟲共生。在自然界，此類細菌存在于三齡侵染期線蟲的腸道內，隨著線蟲對昆蟲的侵染，共生菌被攜帶到昆蟲體內并釋放到寄主血腔中，共生菌大量繁殖，產生毒素和抑菌物質，與線蟲共同作用，殺死寄主昆蟲；另外，共生菌也能分解昆蟲組織，為線蟲和共生菌的生長和繁殖提供營養。昆蟲病原線蟲共生細菌Xenorhabdus和Photorhabdus能產生多種代謝產物。到目前為止，已從共生菌中分離鑒定出30多種生物活性成分，這些代謝產物不僅具有多種化學結構，而且在醫療衛生和農業上具有廣泛的生物活性，如抑菌、殺蟲、殺線蟲、抗潰瘍、抗腫瘤和抗病毒活性。特別是從P.luminescensW14中分離出一種外毒素蛋白復合體，對鱗翅目，鞘翅目、蜚蠊目和膜翅目等幾個目的多種害蟲均表現出很高的口服殺蟲活性，毒性與Btδ-內毒素相當；殺蟲基因轉入煙草、玉米和水稻后，對煙草天蛾幼蟲和玉米根葉甲幼蟲具有較強的致死和抑制生長作用；殺蟲蛋白基因在大腸桿菌細胞內也得到了有效表達。為生物農藥的開發和抗蟲基因工程提供了新的微生物殺蟲資源和殺蟲基因。昆蟲病原線蟲共生菌已成為一類新型的具有較大開發潛力和廣泛應用前景的生物資源。近年來，昆蟲病原線蟲共生菌的生理代謝特征成為國際上研究的熱點。從昆蟲病原線蟲與其共生菌的關系來看，線蟲的殺蟲活性主要是共生菌起作用；而共生菌是以線蟲為介體，線蟲侵染寄主昆蟲后，將共生菌釋放到血淋巴中，共生菌在血淋巴中大量繁殖，產生毒素和線蟲共同作用殺死昆蟲。毒素的作用部位是血淋巴，因而共生菌均有較高的注射活性，經口毒性可能是一種特殊情況。大多數菌株無經口毒性，作為殺蟲劑開發利用的價值較低。要挖掘共生菌殺蟲活性的應用潛力，還需進行廣泛的高毒力菌株的篩選。共生菌的分離方法主要是從線蟲侵染致死的大蠟螟中分離，即把感染了昆蟲病原線蟲死后24h的昆蟲尸體經體表消毒后用滅菌剪刀剪開背線(勿觸破腸道)將昆蟲血淋巴涂布于NBTA培養基上，以分離共生菌，或者蟲體用酒精浸后，在酒精燈上點燃，然后在進一步分離。利用這種方法分離時易污染，雜菌較多。
發明內容本發明針對從線蟲侵染致死的大蠟螟中分離共生菌的方法易污染，雜菌較多的問題，提供一種采用從線蟲中直接分離共生菌的方法。本發明的技術解決方案是，將昆蟲病原線蟲Steinernemasp(該線蟲從陜西楊陵篩選獲得，經鑒定為斯氏線蟲Steinernemasp)在無菌環境下，用消毒劑進行體表消毒，然后用無菌水沖洗，將消毒過的昆蟲病原線蟲直接散布在NBTA培養基平板上，在一定條件下培養，釋放出共生菌，形成藍綠色菌落，周圍培養基中的染料被吸收變為黃色，經反復純化，得到共生菌，經鑒定并命名為XenorhabdusnematophilusYL001。其中所述的NBTA培養基為牛肉膏3.0g、蛋白胨5.0g、營養瓊脂20g、TTC0.04g、BTB0.025g、水1000ml、PH7.2～7.4。本方法簡單方便，雜菌較少，分離得到的是初生型共生菌。具體實施例方式為了清楚的理解本發明，以下結合實施例詳細敘述本發明的直接從昆蟲病原線蟲中分離共生菌的方法，本發明不限于這些實施例。實施例11、首先用0.1％甲醛溶液將侵染期昆蟲病原線蟲(IJs)浸泡消毒3次，每次30min，每次消毒完后用無菌水沖洗；2、隨后用0.1％乙汞硫代水楊酸鈉將線蟲浸泡30min，消毒完后用無菌水沖洗3次；3、最后將消毒過的侵染期線蟲加到NBTA鑒別培養基平板上；4、將NBTA鑒別培養基平板在28℃黑暗條件下培養3-5d，3-5d內線蟲釋放出共生菌，形成藍綠色菌落，經反復純化，得到昆蟲病原線蟲共生菌。5.共生菌的鑒定通過形態及生理生化特征鑒定，確定共生菌為XenorhabdusnematophilusYL001。表1Steinernemasp共生菌的形態特征表2Steinernemasp共生菌的主要生化特征表3Steinernemasp共生菌與Xenorhabdus屬不同種特征的比較注+＝90-100％；[+]＝76-89％；d＝26-75％；[-]＝11-25％；-＝0-10％；w＝weakreaction；實施例21、用10％的次氯酸鈉或1％的升汞將線蟲浸泡30min，然后用無菌水沖洗3次；2、將消毒過的線蟲直接散布在NBTA鑒別培養基平板上；4.將NBTA平板在28℃黑暗條件下培養3-5d，3-5d內線蟲釋放出共生菌，形成藍綠色菌落，經反復純化，得到昆蟲病原線蟲共生菌。經進一步鑒定，確定Steinernemasp共生菌為XenorhabdusnematophilusYL001。權利要求1.一種昆蟲病原線蟲共生菌的分離方法，其特征在于，將昆蟲病原線蟲在無菌環境下，用消毒劑進行體表消毒，然后用無菌水沖洗，將消毒過的昆蟲病原線蟲直接散布在NBTA鑒別培養基平板上，在一定條件下培養，線蟲釋放出共生菌，形成藍綠色菌落，周圍培養基中的染料被吸收變為黃色，經反復純化，得到昆蟲病原線蟲共生菌。2.如權利要求1所述的分離方法，其特征在于消毒劑為甲醛、乙汞硫代水楊酸鈉、次氯酸鈉、氯化汞其中之一。3.如權利要求2所述的分離方法，其特征在于，所述甲醛濃度為0.1％，乙汞硫代水楊酸鈉濃度為0.1％，次氯酸鈉濃度為10％，氯化汞濃度為1％。4.如權利要求1所述的分離方法，其特征在于NBTA培養基平板的培養條件為，28℃、黑暗條件下培養3-5d。5.如權利要求1所述的分離方法，其特征在于，該方法包括下列步驟A、首先用0.1％甲醛溶液將浸染期的昆蟲病原線蟲(IJs)浸泡消毒3次，每次30min，每次消毒完后用無菌水沖洗；B、隨后用0.1％乙汞硫代水楊酸鈉將線蟲浸泡30min，消毒完后用無菌水沖洗3次，最后將消毒過的線蟲加到NBTA培養基平板上進行分離；C、用10％的次氯酸鈉或1％的升汞將侵染期昆蟲病原線蟲浸泡30min，然后用無菌水沖洗3次，將消毒過的線蟲直接散布在NBTA培養基上進行分離，NBTA培養基平板在28℃、黑暗條件下培養3-5d，線蟲釋放出共生菌，形成藍綠色菌落，周圍培養基中的染料被吸收變為黃色，即可得到昆蟲病原線蟲共生菌。全文摘要本發明公開了一種昆蟲病原線蟲共生菌的分離方法，將昆蟲病原線蟲在無菌環境下，用消毒劑進行體表消毒，然后用無菌水沖洗，將消毒過的昆蟲病原線蟲直接散布在NBTA培養基平板上，在一定條件下培養，釋放出共生菌，形成藍綠色菌落，菌落周圍培養基中的染料被吸收變為黃色，經反復純化，得到昆蟲病原線蟲共生菌。本方法簡單方便，雜菌較少，分離得到的是初生型共生菌。文檔編號C12N1/10GK1724650SQ20051004282公開日2006年1月25日申請日期2005年6月16日優先權日2005年6月16日發明者王永宏,許賢,馮俊濤,周一萬,李廣澤,陳安良,張興申請人:西北農林科技大學無公害農藥研究服務中心