專利名稱：一種多樣本微生物污染快速篩揀的方法
技術領域：
本發明涉及生物學、醫學及公共安全領域，具體是用生物ATP(三磷酸腺苷)熒光能量法結合現代生物芯片技術實現多樣本微生物污染快速篩揀的方法。
背景技術：
隨著化妝品、食品、藥品等公共衛生事業對微生物的控制和檢測要求越來越嚴格，迫切需要提出一種新的快速檢測的方法和相應的自動化儀器，對生產環境清潔度實時監控。而至今國家標準規定的微生物檢測方法仍然是瓊脂平板培養法，此法的主要的缺陷是耗時長(細菌24h，霉菌96h，某些微生物如分支桿菌等則需時更長。)除此，對微生物病原菌的檢測、鑒別和分型技術和方法還有很多種，生化鑒定、核酸(DNA標記探針、PCR等)技術、抗體檢測(ELISA酶聯檢測、免疫熒光等)、上述諸多“經典”方法雖然在檢測某種病原菌時有很好的特異性或敏感性，但對任何一種方法而言難以實現對多種病原菌的廣譜檢測。同時上述諸多方法的實現需要依賴較復雜的儀器，且要耗費較長的檢測時間，通常只能在遭到微生物污染后才能查找到原因，不能滿足多樣本現場的快速檢測要求。
經申請人進行的資料檢索，目前已有利用生物ATP能量進行檢測微生物總量的，但均未見針對ATP檢測特異性差的缺點進行改進。如中國專利申請號95225687.8，公開了一種菌落熒光檢測儀的方法，中國專利申請號99816384.8，做了試劑上的改進，但實際情況中不但要求要確定污染總量，還要求迅速找到污染源，及確定污染物，這就要求必須針對ATP檢測特異性差的缺點進行改進。
發明內容
針對現有微生物污染檢測存在的問題，本發明的目的在于，提供一種多樣本微生物污染快速篩揀的方法，完全不同于傳統方法對每個樣個不加區別的進行同樣的檢測，大大提高了檢測效率，滿足實際要求的大樣本微生物污染現場快速檢測要求。
本發明具體包括兩方面內容的集成(一)ATP(Adenosine Triphosphate，三磷酸腺苷)是一種存在于所有活的細胞體內的化學物質，它是微生物能量的主要載體。細胞死亡后由于細胞內有ATP酶的存在，ATP迅速被水解。因此測定內源性ATP的含量可以反映活細胞的數量。如果樣本中污染了微生物，用有機溶劑等專用試劑破菌后，ATP就被釋放出來ATP的量和活的細胞體的活性、種類和數量呈現一定的關系。ATP在有氧的情況下可以和熒光素相互酶化作用而發出一定波長(562nm)的生物光。
即蟲熒光素+ATP+O2→蟲熒光素(被氧化的)+AMP+CO2+PPi+光(562nm)；(d-Luciferin+ATP+O2→Oxgluciferin+AMP+CO2+Pyrophosphate+Light)。
光的強度和微生物的數量呈一定的函數關系。通過檢測生物光的強度來反映出微生物的數量，這就是通過分析ATP熒光來檢測包括病原菌在內的活微生物的基本原理。
(二)生物芯片技術是指探針分子固定在支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，一旦熒光標記樣品和微陣列上的連接物反應后，就會產生熒光信號，可通過熒光檢測裝置進行檢測。生物芯片在單位面積上排列著大量的生物材料，從而達到一次實驗同時檢測多種疾病或分析多種生物樣本的目的。
本發明融合ATP生物熒光檢測和生物芯片技術，實現快速篩查與特異檢測的最優化，首先利用ATP生物熒光檢測方法快速敏感的優勢，完成大樣本的篩查，細菌總量低于閾值的將不再進行特異性檢測；對于細菌總量超標的少量樣本再利用生物芯片技術進行有害微生物進行鑒定和分型。這樣在充分利用二者的優勢的基礎上，彌補了ATP熒光檢測法對目標微生物特異型的不足和生物芯片在檢測通量上的不足。
與本發明方法相對應的實現裝置關鍵是利用了二者在檢測信號和反應機理的相似性，都是檢測熒光，從而可以使活微生物自身ATP熒光和生物芯片作用過程中產生熒光用同一套微光檢測裝置完成，提高了檢測效率也降低了成本。不同的只是要檢測的熒光波長不同，比如生物ATP發出的熒光波長是固定的562nm，被測樣本生物污染物如大腸桿菌、沙門氏菌等經處理后釋放的熒光波長λi是隨處理方法而異(如可使其分別對應530nm、670nm等)，但是方法或試劑一旦確定，熒光波長與污染菌類的對應關系就確定了。本發明成果可直接用于公共衛生，食品安全，環境檢測，健康工程等領域的微生物現場快速檢測，特別是對應對突發公共事件有重要意義。
為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是，一種多樣本微生物污染快速篩揀的方法，關鍵是采用生物ATP熒光能量法大樣本有害微生物篩查和現代生物芯片技術特異性檢測相結合，用一套熒光檢測裝置完成多樣本微生物污染快速篩揀，熒光檢測裝置主要包括設置在暗室中的一個檢測平臺和熒光檢測系統，檢測系統中的熒光檢測探頭設有濾光片轉盤，其上設有若干不同波長的濾光片，由與其相連的步進電機帶動轉盤旋轉，可以切換不同的波長，過濾不同波長的熒光；其特征在于，快速篩揀包括以下步驟1)將采集的樣本分別加在檢測平臺對應序號的多聯生物芯片上，首先將熒光檢測系統的濾光片轉到生物ATP熒光能量法的熒光相對應的熒光波長位置，利用生物ATP熒光能量法的快速敏感性，對樣本中的反應微生物總量進行生物ATP熒光波長檢測，如發明第一方面所述，活微生物的總量決定熒光的強弱，將檢測到樣本的熒光信號轉化成相應的電信號，根據預先設定的閾值進行比較，篩掉樣本中細菌總量低于閾值的樣本，篩掉的樣本判定為合格，無需做特異性檢測，開始進行下一個樣本檢測；2)若樣本中的細菌總量經上述生物ATP熒光波長篩查后，如果發現存在超標樣本，則通過驅動步進電機使濾光片轉盤旋轉到不同波長的濾光片的位置，對超標樣本進行特異檢測，濾光片轉盤上的每一種熒光波長都對應一種特定的細菌或病原體，檢測超標樣本中是否含有其它特定波長熒光，判定超標樣本中是否含有與這些波長相對應的細菌；3)步進電機帶動檢測平臺來回移動，熒光檢測系統依次完成對全部樣本的不同波長熒光強度的掃描，即可快速篩揀出樣本中存在的與不同波長的濾光片相吻合的所有菌類。
與上述檢測方法相對應的檢測裝置主要包括暗室內的檢測平臺、位置傳感器，驅動電機，單片機主板、還有置于暗室外的鍵盤、顯示裝置以及與PC通信等外圍設備構建的熒光檢測系統。
單片機采用內部集成A/D的MSP430超低功耗微處理器。
所說的檢測平臺上面均勻分布著48(8*6)個凹槽，多聯生物芯片嵌入其中，平臺的X、Y方向分別與一個驅動電機相連，微處理器輸出的驅動信號通過驅動電路驅動步進電機，控制步進電機實現往復式直線運動，依次完成對所有樣本位置上的芯片熒光強度的檢測，平臺上設有位置傳感器，用于開機自檢，檢測平臺是否移動正常。
測量平臺上面與軸線垂直的熒光檢測系統，包括熒光檢測探頭和電壓轉換兩部分，熒光檢測探頭固定不動，由兩束光纖匯聚而成，其中一束和光源相連可以傳輸激發光，另一束光纖傳輸熒光，至下而上分別是濾光片轉盤，其上設有若干不同波長的濾光片，可以由與其相連的步進電機帶動旋轉切換不同的波長，過濾不同波長的熒光，接著是APD模塊，它的窗口與濾光片某個波長相對，激發光經過濾光片由熒光檢測探頭傳輸給APD模塊接收并轉換成相應的電信號，其中APD模塊采用C5331，集成了溫度補償電路，它體積小，重量輕，工作電壓低，響應速度快，抗外部電磁干擾性好，性價比明顯高于通常所用光電倍增管、硅光電二級管。
APD模塊將光信號轉換成電流信號，再由電壓轉換裝置將其轉變為放大的電壓信號，輸給微處理器的A/D端處理。其中程控放大器采用MAX5426精密電阻網絡，增益Av＝1、2、4、8可根據實際程控選擇。
本發明首次提出了活微生物群中目標有害病源菌快速“篩揀”的概念，并給出了具體的實現方法。該方法采用的ATP生物熒光檢測與生物芯片技術相結合有如下特點1.檢測的快速性對于每個樣本檢測時間只需約一分鐘而并非像傳統方法的幾小時甚至幾天；2.檢測的高廣譜敏感性它能以很高的靈敏度檢測微生物群總數，將細菌總量超標的樣本再進行特定病原菌分型，迅速確定污染物，可以實現定量檢測；3.檢測方法、過程簡單，完全不同于傳統方法對每個樣本不加區別的同等檢測，便于現場操作。
本發明完全不同于傳統方法對樣本不加區分的檢測，能夠快速而準確地對導致生物污染的多種致病或有害微生物、病原菌進行定性或定量檢測、監測，是控制疾病流行、醫院感染以及保證生物安全。
圖1是本發明的多樣本微生物污染篩揀系統示意圖；圖2是系統裝置整體設計示意圖；圖3電壓轉換裝置；
圖4是步進電機驅動的一種具體電路實例。
以下結合附圖對本發明作進一步詳細描述。
具體實施例方式
參照圖1，按照本發明方法制備的多樣本微生物污染快速篩檢系統，實現了現場快速大樣本微生物污染的篩檢，使用時采用的是多聯芯片，不同于普通多聯生物芯片，該多聯芯片將ATP生物熒光的連接物也固定在芯片微陣列上，可以使大樣本有害微生物篩查與特異性檢測用同一芯片，結合到芯片的樣品可以通過熒光檢測裝置檢測到，一次便可完成多種項目的檢測，如ATP，大腸桿菌，痢疾桿菌、白色念珠菌等，還可以根據實際情況更換芯片，提高檢測效率。除此，系統的優勢尤其在大樣本的時候尤為顯著。具體的說，對采集到的樣本，首先將濾光片轉到562nm波長(ATP熒光波長)，也是系統默認位置，利用ATP的快速敏感性對樣本微生物總量檢測，進行“篩”查，根據預先設定的閾值篩掉細菌總量低于閾值的，即判定合格，無須再對其進行特異性檢測，節省時間，對于細菌總量超標的少量樣本再對其進行鑒定分型。通過步進電機使濾光片轉盤旋轉到下一個位置，依次檢測λi(i＝1，2，3…，N，N為濾光盤上濾光片數)，比如710nm(對應葡萄球菌)，如果仍檢測到熒光，說明樣本中含有與此波長相對應的細菌，然后再旋轉濾光盤到下一個位置進行檢測，以此類推，對樣本進行多種微生物檢測，通常濾光盤上的濾光片數N＝6，假設樣品總數是48個，其中有2個超標的，其中一個污染一項，另一個污染三項，我們作個對比本方法耗時48×1+1×6+1×6＝60分；生物芯片法48×6＝288分；普通方法2小時/項，48×6×120＝34560分；很明顯，傳統的方法已經遠遠不能滿足現場檢測要求，本法完全不同于后兩種方法對樣本不加區分的檢測，而是采取先篩后揀的辦法，如果樣本再大一點，本方法的優勢更為明顯。
圖2是系統裝置整體設計示意圖，主要包括置于暗室內的反應及檢測裝置和暗室外的微處理器控制部分，通過單片機進行控制各部分工作，工作時，首先開機系統進行自檢，平臺位置檢測傳感器將信號傳入微處理器，確定平臺是否移動正常，否則系統提示出錯，按下控制面板上的‘開始’檢測，微處理器輸出的驅動信號進入步進電機驅動器達林頓管TIP122，控制X，Y兩個方向上的步進電機實現往復式直線步進，帶動平臺來回移動，依次完成對全部樣本的不同波長熒光強度的掃描。具體的說，當按編號將樣本放置好，系統開始檢測，首先是ATP熒光檢測，不需要激發光照射，光源關閉，樣本發出得熒光經過濾光片變成單色光，由熒光檢測裝置中的APD(雪崩光電二極管)模塊經電壓轉換后輸入到單片機的A/D數字化后再由微處理器處理，根據預先設定得閾值，若低于閾值，直接判為合格，進行下一個樣本，如果高于閾值，說明該樣本微生物總量超標，需要對其進行特異性檢測，確定污染物，微處理器將發出指令，驅動電機使濾光盤旋轉到下一個位置，同時打開光源，再進行其他波長熒光檢測，由檢測到得熒光波長確定相對應的微生物，并將結果液晶顯示，也可以通過PC串行通行輸給計算機，接口可采用RS232，處理成直觀易懂的曲線或圖標顯示，依次下去，將每個樣本的情況打印輸出。
圖3是電壓轉換裝置，APD模塊將熒光信號的強度轉換成相應的電流信號，再由電壓轉換裝置將其轉變為放大的電壓信號，輸給微處理器的A/D端處理。其中程控放大器采用MAX5426精密電阻網絡，增益Av＝1、2、4、8可根據實際程控選擇。
圖4是步進電機驅動電路的一個具體實例，本發明中用到了三個電機，驅動基本類似，此例中，電機驅動是達林頓管，型號為TIP122。
本發明的多樣本微生物污染快速篩查系統，結合了ATP生物熒光能量法和現代生物芯片技術的最優化，滿足了多樣本微生物污染現場檢測的快速性及特異性的要求。
權利要求
1.一種多樣本微生物污染快速篩揀的方法，采用生物三磷酸腺苷即ATP熒光能量法和生物芯片技術相結合，通過使用特殊多聯芯片，用一套熒光檢測裝置完成多樣本微生物污染快速篩揀，熒光檢測裝置主要包括設置在暗室中的一個檢測平臺和熒光檢測系統，熒光探頭上還設有濾光片轉盤，其上設有若干不同波長的濾光片，由與其相連的步進電機帶動旋轉，并切換不同的波長，過濾不同波長的熒光；其特征在于，快速篩揀具體包括以下步驟1)將采集的樣本分別加在檢測平臺對應序號的多聯生物芯片上，首先將熒光檢測系統的濾光片轉到生物ATP熒光能量法的熒光相對應的熒光波長位置，利用生物ATP熒光能量法的快速敏感性，對樣本中的反應微生物總量進行生物ATP熒光波長檢測，活微生物的總量決定熒光的強弱，將檢測到樣本的熒光信號轉化成相應的電信號，根據預先設定的閾值進行比較，篩掉樣本中細菌總量低于閾值的樣本，篩掉的樣本判定為合格，無需做特異性檢測，開始進行下一個樣本檢測；2)若樣本中的細菌總量經上述生物ATP熒光波長篩查后，如果還存在超標樣本，則通過驅動步進電機使濾光片轉盤旋轉到不同波長的濾光片的位置，對超標樣本進行特異檢測，濾光片轉盤上的每一種熒光波長都對應一種特定的細菌或病原體，檢測超標樣本中是否含有其它特定波長熒光，判定超標樣本中是否含有與這些波長相對應的細菌；3)步進電機帶動檢測平臺來回移動，熒光檢測系統依次完成對全部樣本的不同波長熒光強度的掃描，即可快速篩揀出樣本中存在的與不同波長的濾光片相吻合的所有菌類。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，檢測平臺上面均勻分布著8*6個凹槽，多聯生物芯片嵌入其中，檢測平臺的X、Y方向分別與一個步進電機相連，由微處理器輸出的驅動信號通過驅動電路驅動步進電機，控制步進電機實現往復式直線運動，依次完成對所有樣本位置上的芯片熒光強度的檢測，檢測平臺上設有位置傳感器，用于開機自檢，判斷檢測平臺是否移動正常。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，熒光檢測系統，包括微處理器控制部分、熒光檢測探頭和電壓轉換裝置；熒光檢測系統設置在測量平臺上與軸線垂直的位置，熒光檢測探頭固定不動，由兩束光纖匯聚而成，其中一束和光源相連，以傳輸激發光，另一束光纖傳輸熒光，激發光經過濾光片由熒光檢測探頭傳輸給電壓轉換裝置，電壓轉換裝置中有雪崩二極管模塊和程控放大器，由雪崩二極管模塊將激發光轉換成相應的電信號，再由程控放大器將其轉變為放大的電壓信號，傳輸給微處理器。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述電壓轉換裝置中的雪崩二極管模塊采用C5331，其中集成了溫度補償電路。
5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述電壓轉換裝置中的程控放大器采用MAX5426。
6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述超低功耗微處理器采用MSP430。
全文摘要
本發明公開了一種多樣本微生物污染快速篩揀的方法，該方法結合ATP生物熒光能量法和現代生物芯片技術實現快速與特異檢測，先借助ATP生物熒光檢測方法快速敏感的優勢，完成大樣本的篩查，然后利用生物芯片技術對細菌總量超標的小樣本集合進行有害微生物的鑒定和分型。以彌補了ATP熒光檢測法對目標微生物特異型的不足和生物芯片在檢測通量上的不足，縮短檢測時間，本發明采用二者在檢測信號和反應機理的相似性，從而可以使活微生物自身ATP熒光和生物芯片作用過程中產生熒光用同一套微光檢測裝置完成，提高了檢測效率和降低檢測成本。可直接用于公共衛生、食品安全、環境檢測、健康工程等領域的微生物現場快速檢測，特別是應對突發公共事件有重要意義。
文檔編號C12Q1/02GK1743834SQ20051004268
公開日2006年3月8日 申請日期2005年5月23日 優先權日2005年5月23日
發明者彭年才, 張鎮西, 李煒, 冀曉燕 申請人:西安交通大學