專利名稱：一種完整藻膽體的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種完整藻膽體的制備方法，具體地涉及從紅藻和藍藻中分離制備完整藻膽體的方法，屬于海洋生物技術領域。
背景技術：
藻膽蛋白是一類光合作用捕光色素-蛋白質復合物，主要存在于藍藻、紅藻、隱藻和少數甲藻中。在光合作用中起捕獲和傳遞光能的作用，具有強烈的熒光。在藍藻和紅藻中，由2-3種藻膽蛋白組成超分子結構藻膽體，形成高效的能量傳遞序列。在80年代中期，美國研究藻類光合作用的學者提出將藻膽蛋白作為熒光標記物，用于診斷試劑。由于其獨特的優點，藻膽蛋白和藻膽蛋白標記的診斷試劑在90年代初進入國際市場。
同常用的熒光標記物相比，藻膽蛋白具有下列優點生產過程安全、無毒，光能吸收強，熒光產率高，超過90％，背景光干擾和假陽性率低，在pH4-11的范圍內穩定，可以作雙色、三色和四色標記。所以，這類試劑的應用范圍不斷擴大。但是，由于價格昂貴，尚未應用到普及型的臨床診斷試劑。我國全部進口，也僅限于用細胞流式儀進行的診斷。
藻膽蛋白做為熒光探針，有其獨特的優勢，但單個的藻膽蛋白分子，由于其分子較小、分子中含有的色素基團較少，因此，產生熒光的亮度不夠，使得在高分辨率的檢測中靈敏度不高。美國莫森曼(J.P.Morseman)提出，應用固定化的完整藻膽體做為熒光探針，可用于多種生物醫學檢測。由于藻膽體中含有更多的色素基團，因此，其亮度較高，并且，激發波長為藻紅蛋白(PE)或藻藍蛋白(PC)的吸收波長，而熒光發射來自APC，因此，激發波長和發射波長相距更遠，避免相互干擾。其中，低成本的完整藻膽體的快速制備技術是制約該技術能否推廣應用的關鍵。目前，藻膽體的制備技術都采用蔗糖密度離心的方法，由于蔗糖密度梯度法制備藻膽體操作繁瑣，且必需超高速離心機，因而，尋找簡便、迅速、規模化制備藻膽體替代方法顯得尤為重要。
發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種完整藻膽體的制備方法，工藝簡便、迅速，可規模化生產完整藻膽體。
本發明的完整藻膽體的制備方法，步驟如下(1)原料的破碎以新鮮的藍藻和紅藻為原料，溶于pH＝6.8～7.0的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液中，采用超聲波破碎細胞。
上述藍藻選自鈍頂螺旋藻或極大螺旋藻，紅藻選自單細胞紅藻紫球藻、大型紅藻多管藻或三叉仙菜。
(2)藻膽體解離在破碎的藻體中加入去污劑吐溫X-100(TritonX-100)，使藻膽體從類囊體膜上解離下來。離心，去除去污劑和破碎的細胞，得藻膽體的粗提物。
去污劑的加入量本發明不作特別限定，按本領域現有技術，以能使藻膽體從類囊體膜上解離為宜。
(3)藻膽體的濃縮用聚乙二醇沉淀藻膽體，收集沉淀。將沉淀重新溶解于pH＝6.8～7.0磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀溶液中。
(4)完整藻膽體的純化將上述藻膽體溶液過Sepharose CL-4B柱層析，收集洗脫前端的藍紫色溶液，得到完整的藻膽體溶液。
上述步驟(1)原料的破碎具體為新鮮藻體0.75～1.0g，溶于15～20mL 1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液(pH＝6.8～7.0)中，超聲波破碎，破碎功率為12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，間隔2～3min。
上述步驟(2)藻膽體解離具體為在破碎的藻體溶液中加入體積百分比濃度為1.9～2.1％TritonX-100(V/V)，室溫下，緩慢攪拌1小時～1.5小時，13000rpm～15000rpm離心3-4次，去除表層的TritonX-100、葉綠素和底部的細胞碎片，收集出離心管中部的溶液，即為藻膽體粗提液，其中混有少量的破碎藻膽體。
上述步驟(3)藻膽體的濃縮中所用聚乙二醇為聚乙二醇6000， 所用的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液pH＝6.8～7.0，濃度1mol·L-1，磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液的用量以能溶解沉淀為宜，沒有特別限定。
上述步驟(4)Sepharose CL-4B柱為2.0×30cm，用pH＝6.98濃度0.8mol·L-1～0.9mol·L-1磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液洗脫，流速為0.4～0.5mL·min-1。
本發明以紅藻和藍藻為材料，應用超聲波破碎細胞、去污劑TritonX-100從類囊體膜上解離藻膽體、常規離心去除TritonX-100、葉綠素和細胞碎片、聚乙二醇沉淀、最后經Sepharose CL-4B柱層析得到純的完整藻膽體。本方法省去了傳統的蔗糖密度剃度超速離心方法對設備要求高、操作復雜、并且很難進行大量制備的缺點，優良效果在于可以應用常規設備、對設備要求簡單，容易大量制備并且大大降低了藻膽體的制備成本，從而為將藻膽體應用于超靈敏的生物醫學檢測奠定了基礎，具有很好的應用前景和經濟效益。
圖1是實施例1層析法制備的藻膽體的吸收和室溫熒光光譜。曲線1熒光激發光譜，Em＝680nm；曲線2吸收光譜；曲線3熒光發射光，Ex＝580nm曲線4熒光發射光譜，Ex＝436nm。
具體實施方式
實施例1完整藻膽體的制備方法，包括如下步驟(1)原料的破碎新鮮的藍藻鈍頂螺旋藻0.5g、單細胞紅藻紫球藻0.4g為原料，溶于pH＝6.9的20mL 1mol·L-1磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液中，采用超聲波破碎細胞，破碎功率為15W，破碎5次，每次2min，間隔2min。
(2)藻膽體解離在破碎的藻體中加入去污劑TritonX-100濃度2.0％(體積)，藻體與去污劑體積比為1∶0.2，室溫下，緩慢攪拌1.5小時，使藻膽體從類囊體膜上解離下來。14000rpm離心4次，去除表層的TritonX-100、葉綠素和底部的細胞碎片，收集出離心管中部的溶液，即為藻膽體粗提液，其中混有少量的破碎藻膽體。
(3)藻膽體的濃縮用聚乙二醇6000沉淀藻膽體，收集沉淀。將沉淀重新溶解于pH＝6.8～7.0濃度1mol·L-1的磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀溶液中。
(4)完整藻膽體的純化將上述藻膽體溶液過2.0×30cm的Sepharose CL-4B柱層析，用pH＝6.98濃度0.9mol·L-1磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液洗脫，流速為0.45mL·min-1。收集洗脫前端的藍紫色溶液，得到完成的藻膽體溶液。
圖1顯示，鈍頂螺旋藻藻膽體的吸收峰在620nm處，沒有436nm的葉綠色的特征吸收峰(曲線2)。用580nm波長的光激發，藻膽體的發射波長在680nm(曲線3)，這與蔗糖密度梯度高速離心法制備的藻膽體的發射波長相同，說明該種藻膽體是完整的；而用436nm波長的光激發，其發射波長依然為680nm(曲線4)，沒有出現葉綠素的特征熒光峰，且其680nm激發峰在621nm，也未出現葉綠素的特征峰值(曲線1)，說明藻膽體溶液內不含葉綠素。
實施例2如實施例1所述，所不同的是步驟(1)原料為新鮮的鈍頂螺旋藻(藍藻)0.4g和多管藻(大型紅藻)0.5g，溶于pH＝7.0的16mL 1mol·L-1磷酸氫二鈉—磷酸二氫鉀緩沖液中，采用超聲波破碎細胞，破碎功率為14W，破碎6次，每次1.5min，間隔3min。
實施例3如實施例1所述，所不同的是步驟(1)原料為鈍頂螺旋藻0.3g和多管藻0.7g。
實施例4如實施例1所述，所不同的是步驟(1)原料為鈍頂螺旋藻0.5g和三叉仙菜0.5g。
權利要求
1.一種完整藻膽體的制備方法，步驟如下(1)原料的破碎以新鮮的藍藻和紅藻為原料，溶于pH＝6.8～7.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中，采用超聲波破碎細胞；(2)藻膽體解離在破碎的藻體中加入去污劑吐溫X-100，使藻膽體從類囊體膜上解離下來，離心，去除去污劑和破碎的細胞，得藻膽體的粗提物；(3)藻膽體的濃縮用聚乙二醇沉淀藻膽體，收集沉淀；將沉淀重新溶解于pH＝6.8～7.0磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀溶液中；(4)完整藻膽體的純化將上述藻膽體溶液過Sepharose CL-4B柱層析，收集洗脫前端的藍紫色溶液，得到完整的藻膽體溶液。
2.如權利要求1所述的完整藻膽體的制備方法，其特征在于，所述藍藻選自鈍頂螺旋藻或極大螺旋藻。
3.如權利要求1所述的完整藻膽體的制備方法，其特征在于，所述紅藻選自單細胞紅藻紫球藻、大型紅藻多管藻或三叉仙菜。
4.如權利要求1所述的完整藻膽體的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)原料0.75g～1.0g，溶于15～20mL 1mol·L-1的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液中。
5.如權利要求1所述的完整藻膽體的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)的超聲波破碎，破碎功率為12～15W，破碎5～6次，每次1.5～2min，間隔2～3min。
6.如權利要求1所述的完整藻膽體的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)藻膽體解離具體為加入體積百分比濃度為1.9～2.1％的去污劑吐溫X-100，室溫下，緩慢攪拌1小時～1.5小時，13000rpm～15000rpm離心3-4次。
7.如權利要求1所述的完整藻膽體的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)Sepharose CL-4B柱為2.0×30cm，用pH＝6.98濃度0.8mol·L-1～0.9mol·L-1磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液洗脫，流速為0.4～0.5mL·min-1。
全文摘要
一種完整藻膽體的制備方法，屬于海洋生物技術領域。本發明以紅藻和藍藻為材料，應用超聲波破碎細胞、去污劑從類囊體膜上解離藻膽體、常規離心去除去污劑、葉綠素和細胞碎片、聚乙二醇沉淀、最后經Sepharose CL－4B柱層析得到純的完整藻膽體。本方法省去了傳統的蔗糖密度剃度超速離心方法對設備要求高、操作復雜、并且很難進行大量制備的缺點，優良效果在于可以應用常規設備、對設備要求簡單，容易大量制備并且大大降低了藻膽體的制備成本，從而為將藻膽體應用于超靈敏的生物醫學檢測奠定了基礎，具有很好的應用前景和經濟效益。
文檔編號C12N1/12GK1654629SQ200510042029
公開日2005年8月17日 申請日期2005年1月17日 優先權日2005年1月17日
發明者張玉忠, 張熙穎, 陳秀蘭, 周百成 申請人:山東大學