專利名稱：基于凝膠固定核酸的dna微陣列芯片制備方法
技術領域：
本發明涉及一種DNA微陣列芯片的制備方法，尤其涉及一種基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法。
背景技術：
基因芯片是近年來在生命科學領域中迅速發展起來的一項高新技術。所謂基因芯片就是按特定的排列方式固定有大量基因探針(寡核苷酸探針或cDNA探針)的硅片、玻片、塑料片。基因芯片技術是高效地大規模獲取相關生物信息的主要手段。目前，該技術應用領域主要有基因表達譜分析、新基因發現、基因突變及多態性分析、基因組文庫作圖、疾病診斷和預測、藥物篩選、基因測序等。九十年代初以美國為主開始進行的各種生物芯片的研制，不到十年的功夫，芯片技術得以迅速發展，并呈現發展高峰。目前基因芯片的制備可以分成點樣制備和原位合成制備法。以Affymetrix公司為代表的原位合成制備法是構建高密度寡核酸陣列的最有效方法，但由于其缺乏靈活性而使單片芯片的價格高而不能被廣泛使用，況且該方法也無法制備通過PCR擴增的cDNA芯片。點樣法具有相當的靈活性適合大多數研究和臨床應用。對于中低密度的芯片而言，點樣法比原位合成具有更快的生產速度。該方法目前被大多數研究單位所采用。點樣法制備的基因芯片質量好壞的由下列兩個因素決定一是固定核酸的載體，另一個是在載體上固定核酸所采用的化學方法。換一種方法說就是核酸固定的效率和核酸雜交的效率是決定基因芯片的準確性和靈敏性的兩個最重要因素。在載體使用方面目前廣泛使用的載體是玻璃，石英等硬質載體，這類載體由于只能在其表面固定核酸，而且核酸固定密度太高往往會由于空間位阻效應而導致雜交效率的降低。在采用的化學固定方法方面不管使用玻璃等硬質載體還是凝膠載體，目前廣泛的使用的化學方法均需要多步化學反應過程對載體進行活化獲得與核酸連接的諸如醛基等活性基團，過程繁瑣，不但耗時長、工作量大，而且穩定性和重復性差，使得芯片質量很不穩定。
發明內容
本發明提供一種反應可控的基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，由本發明制得的DNA微陣列芯片具有很好的均勻性、重復性和高的準確性和高的靈敏性，并能提高雜交效率。
本發明采用如下技術方案一種基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，將丙烯酰胺修飾的核酸、丙烯酰胺單體、過硫酸銨、丙三醇和水混合成預聚合物，其中，核酸的濃度在0.001-100uM之間，丙烯酰胺單體重量濃度在1-30％之間，過硫酸銨重量濃度在0.01-5％之間，丙三醇的重量濃度為10-50％，然后將預聚合物點樣于固體基板上，點樣完后將點樣基片置于一放置有四甲基乙二胺的密閉盒中，使四甲基乙二胺揮發，揮發的四甲基乙二胺與固體基板上預聚合物陣點接觸并使其發生聚合反應，使各陣點上的核酸通過共聚反應在固體基板上得到固定。
與現有技術相比，本發明具有如下優點本發明利用一步不受外界影響的聚合反應在三維多孔凝膠上獲得更多的核酸固定容量，同時三維多孔凝膠能夠提供類似于液相的環境有利于雜交提高雜交效率，使制備的基因芯片具有好的準確性和高的靈敏性。核酸分子通過一步不容易受外界影響的聚合化學反應形成穩定的C-C鍵方式實現固定，因此具有很高的核酸固定效率及其獲得高穩定性的固定核酸，由于所用化學試劑的質量可以通過丙烯酰胺單體的現場聚合得到確認，因此重復性好。另一方面由于四甲基乙二胺是在丙烯酰胺修飾的核酸，丙烯酰胺單體，丙三醇，過硫酸銨和水等混合的預聚合物點樣于固體基板后通過真空揮發使預聚合物陣點聚合的，從而使這種聚合可控，預聚合物在點樣前不會發生聚合反應，點樣溶液的核酸濃度和樣品粘度保持不變，因此這種核酸固定方法制備的DNA微陣列具有很好的均勻性和重復性。
圖1是一種寡聚核苷酸微陣列芯片的雜交熒光圖象。
圖2是一種cDNA微陣列芯片的雜交熒光圖象。
具體實施例方式
實施例1
本實施例將丙烯酰胺修飾的不同核酸，分別與一定的比例的丙烯酰胺單體，丙三醇，過硫酸銨和水混合成預聚合物，然后將不同核酸的預聚合物置于點樣板的不同位置上，通過手工或者點樣儀器將核酸預聚合物點樣于固體基板的不同位置上(利用位置編碼使固體基板每個位置上的核酸分子為已知樣(序列))，點樣完后將點樣基片置于一放置有四甲基乙二胺密閉潮濕盒中，在真空作用下四甲基乙二胺揮發并與固體基板上預聚合物陣點接觸使其發生聚合反應，使各陣點上的核酸通過共聚反應在固體基板上得到固定。(參見圖1)將5’端丙烯酰胺修飾的不同序列的寡聚核苷酸和不含核酸的空白樣品(例如，分別與Cy3顏料標記序列Cy3-TGC TGT GAG TGA ACC TGC TGT GTT GA-3′完全正配，中央位置錯配1，2，3個堿基的序列5’-TCA ACA CAG CAG GTT CAC TCA CAG CA-3’(P0)；5’-TCAACA CAG CAG CTT CAC TCA CAG CA-3’(P1)；5’-TCA ACA CAG CAC GAT CAC TCACAG CA-3’(P2)；5’-TCA ACA CAG CAC CAT CAC TCA CAG CA-3’(P3)(下表帶下劃線的字母表示錯配堿基)分別與3％的丙烯酰胺單體，30％丙三醇，0.1％過硫酸銨和水混合成1uM探針的預聚合物，然后將這四種不同核酸的預聚合物置于點樣板的不同位置上，通過點樣儀將核酸預聚合物點樣于固體基板的不同位置上(分別表示P0，P1，P2，P3序列和不含核酸的空白樣品P的各10個寡核酸陣點構成寡核酸微陣列)，點樣完后將點樣基片置于一放置有四甲基乙二胺密閉潮濕盒中，在真空作用下四甲基乙二胺揮發并與固體基板上預聚合物陣點接觸使其發生聚合反應，使各陣點上的核酸通過共聚反應在固體基板上得到固定。固定完成后的DNA微陣列芯片在常溫下與10uM的Cy3-TGC TGT GAG TGA ACC TGC TGT GTTGA-3′序列雜交2小時，用掃描儀掃描得到微陣列芯片的雜交熒光圖象。在圖1中具有完全匹配序列(P0)具有最強的熒光信號，錯配序列的熒光信號均比完全匹配序列的低，其錯配1，2，3個堿基的熒光強度分別為完全正配的51.9％，2.48％和0.899％。很明顯信號強度隨著堿基錯配數目的增加而下降很快，能夠區分正配和單堿基錯配序列。
實施例2本實施例將低密度脂蛋白受體基因14417位點丙烯酰胺修飾的不同PCR產物，分別與一定的比例的丙烯酰胺單體，丙三醇，過硫酸銨和水混合成預聚合物，然后將不同核酸的預聚合物置于點樣板的不同位置上，通過手工或者點樣儀器將核酸預聚合物點樣于固體基板的不同位置上，制備成cDNA微陣列芯片。其具體過程為三個已知14417位點多態性冠心病病人的新鮮血樣本由在5’端丙烯酰胺修飾的前引物5’-TAC TAT CCT TCC CAG CTC CT和未修飾的反相引物5’-TTTTCA GCA ACT TGG CAT-3’擴增。50ulPCR體系中含有50ng基因組DNA，1×PCR緩沖液，3mM MgCl2，250uM dNTPs，20pmol引物of 2U Taq DNA聚合酶。DNA PCR條件為94℃預變性5分鐘，35個94℃30秒，55℃30秒，72℃30秒的循環，最后72℃延伸7分鐘。擴增完成后PCR樣品與3％的丙烯酰胺單體，30％丙三醇，1％過硫酸銨和水混合成大約0.1-0.2uM探針的預聚合物，然后將這三個樣本的PCR產物和空白樣四種預聚合物置于點樣板的不同位置上，通過點樣儀將核酸預聚合物點樣于固體基板的不同位置上，點樣完后將點樣基片置于一放置有四甲基乙二胺密閉潮濕盒中，在真空作用下四甲基乙二胺揮發并與固體基板上預聚合物陣點接觸使其發生聚合反應，使各陣點上的核酸通過共聚反應在固體基板上得到固定。固定完成后的cDNA微陣列芯片在常溫下與10uM的標記序列5’-Cy3-GGAAAA CAG CCA A-3’，5’-Cy5-GGA AAA GAG CCA A-3’序列雜交2小時，掃描得到雜交熒光圖象(圖2)。圖中純合子14417C/C給出強的CY3熒光信號(圖2中4，5行，綠色熒光)。純合子14417G/G給出強的Cy5熒光信號(圖2中7，8行，紅色熒光)。雜合型14417C/G即給出Cy3的熒光信號又同時給出Cy5的熒光信號，兩種染料疊加后，給出強的黃色熒光信號(圖2中1，2行)。
實施例3一種基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，將丙烯酰胺修飾的核酸、丙烯酰胺單體、過硫酸銨、丙三醇和水混合成預聚合物，其中，核酸的濃度在0.001-100uM之間，丙烯酰胺單體重量濃度在1-30％之間，過硫酸銨重量濃度在0.01-5％之間，丙三醇的重量濃度為10-50％，而核酸的最佳濃度范圍在0.1-10uM之間，丙烯酰胺單體的最佳濃度重量范圍在3-15％之間，過硫酸銨的最佳重量濃度范圍在0.1-1％之間，具體來說，核酸的濃度可選擇0.001、0.1、8、10、50或100uM之間，丙烯酰胺單體重量濃度可選擇1％、3％、15％、10％、24％或30％之間，過硫酸銨重量濃度可選擇0.01％、0.1％、1％、3％、5％之間，丙三醇的重量濃度可選擇10％、15％、32％、42％或50％，然后將預聚合物點樣于固體基板上，點樣完后將點樣基片置于一放置有四甲基乙二胺的密閉盒中，使四甲基乙二胺揮發，揮發的四甲基乙二胺與固體基板上預聚合物陣點接觸并使其發生聚合反應，使各陣點上的核酸通過共聚反應在固體基板上得到固定，所述四甲基乙二胺四甲基乙二胺的揮發方式可采用自然揮發、蒸發或真空揮發，放置四甲基乙二胺的密閉盒中的濕度為80-100％，固體基板采用玻璃、硅片、凝膠、塑料、橡膠或陶瓷中的一種，上述丙烯酰胺修飾的核酸可采用市售的丙烯酰胺修飾的核酸。
權利要求
1.一種基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，其特征在于將丙烯酰胺修飾的核酸、丙烯酰胺單體、過硫酸銨、丙三醇和水混合成預聚合物，其中，核酸的濃度在0.001-100uM之間，丙烯酰胺單體重量濃度在1-30％之間，過硫酸銨重量濃度在0.01-5％之間，丙三醇的重量濃度為10-50％，然后將預聚合物點樣于固體基板上，點樣完后將點樣基片置于一放置有四甲基乙二胺的密閉盒中，使四甲基乙二胺揮發，揮發的四甲基乙二胺與固體基板上預聚合物陣點接觸并使其發生聚合反應，使各陣點上的核酸通過共聚反應在固體基板上得到固定。
2.根據權利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，其特征在于核酸的最佳濃度范圍在0.1-10uM之間，丙烯酰胺單體的最佳濃度重量范圍在3-15％之間，過硫酸銨的最佳重量濃度范圍在0.1-1％之間。
3.根據權利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，其特征在于四甲基乙二胺四甲基乙二胺的揮發方式可采用自然揮發、蒸發或真空揮發。
4.根據權利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，其特征在于放置四甲基乙二胺的密閉盒中的濕度為80-100％。
5.根據權利要求1所述的基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，其特征在于固體基板采用玻璃、硅片、凝膠、塑料、橡膠或陶瓷中的一種。
全文摘要
本發明公開了一種基于凝膠固定核酸的DNA微陣列芯片制備方法，將丙烯酰胺修飾的核酸、丙烯酰胺單體、過硫酸銨、丙三醇和水混合成預聚合物，其中，核酸的濃度在0.001－100uM之間，丙烯酰胺單體重量濃度在1－30％之間，過硫酸銨重量濃度在0.01－5％之間，丙三醇的重量濃度為10－50％，然后將預聚合物點樣于固體基板上，點樣完后將點樣基片置于一放置有四甲基乙二胺的密閉盒中，使四甲基乙二胺揮發，揮發的四甲基乙二胺與固體基板上預聚合物陣點接觸并使其發生聚合反應，使各陣點上的核酸通過共聚反應在固體基板上得到固定。由本發明制得的DNA微陣列芯片具有很好的均勻性、重復性和高的準確性和高的靈敏性，并能提高雜交效率。
文檔編號C12Q1/68GK1733935SQ20051004059
公開日2006年2月15日 申請日期2005年6月17日 優先權日2005年6月17日
發明者肖鵬峰, 陸祖宏, 程璐 申請人:東南大學