一種甜菜堿醛脫氫酶基因及其編碼的蛋白質的制作方法

專利名稱：一種甜菜堿醛脫氫酶基因及其編碼的蛋白質的制作方法
技術領域：
本發明公開了一種甜菜堿醛脫氫酶基因及其所編碼的蛋白質，屬于基因工程領域，具體地講涉及植物中編碼甜菜堿合成途徑的關鍵酶甜菜堿醛脫氫酶及其編碼基因。
背景技術：
植物在干旱、低溫、高鹽等脅迫條件下通過積累脯氨酸、甜菜堿、甘露醇等物質進行滲透調節。甜菜堿是細菌以及動植物生物體中起無毒滲透保護作用最主要的細胞相容性物質。分離和克隆甜菜堿合成途徑中的相關基因并進行遺傳轉化，對提高植物抵御干旱、低溫和高鹽等非生物脅迫，保證糧食安全具有重要的意義。近年來有關甜菜堿生物合成及基因工程應用方面取得了較大的進展。甜菜堿是以膽堿為底物經過兩步催化生成即膽堿——甜菜堿醛——甜菜堿。甜菜堿醛脫氫酶負責催化第二步反應。目前，已從菠菜(Weretilnyk et al，1990)、山菠菜(肖崗等，1995)、甜菜(McCue et al，1992)、三角葉濱藜(何曉蘭等，2004)、紅樹(Hibino et al，2001)、中亞濱藜(陳秀娟等，2001)、豌豆(Brauner et al，2003)等植物以及大腸桿菌(Andresenet al，1988；Boyd et al，1991)中已克隆了BADH基因，而且已經證明BADH基因的過量表達能提高植物的耐逆性(Boyd et al，1991；劉鳳華等，1997)。
我們首次報道了雙子葉植物播娘蒿的甜菜堿醛脫氫酶基因。

發明內容
技術問題 本發明的目的在于公開一種甜菜堿醛脫氫酶基因及其所編碼的蛋白質，該基因來自播娘蒿，可作為目的基因導入植物，提高植物耐鹽性，進行植物品種改良。
技術方案本發明甜菜堿醛脫氫酶(DsBADH)基因，其核苷酸序列SEQ ID NO.1為GCACCACGAATCCACGATCCAGTGAGCAGCAGCAACTCCACCTCCGGAAAAAGGAGAGAGAAGCTCTTGATTCAGATACGAAAATGGCGACGCCGATGCCTACTCGCCAACTATTCATCGACGGCGAGTGGAGAGAGCCCATCTTGAAGAAGCGAATCGAGATCGTGAATCCGGCTACTGAAGAGGTCATTGGTGATATCCCTGCAGCTACAACGGAGGACGTGGAGGTTGCAGTTAACGCTGCTCGAAGAGCATTTTCAAGGAATAAAGGAAAAGATTGGGCTAAAGCACCAGGAGCTGTTCGTGCTAAGTA
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上述的甜菜堿醛脫氫酶(DsBADH)基因來自播娘蒿，其編碼的蛋白質，來自播娘蒿(Descurainia sophia)，它具有如下所示的氨基酸序列SEQ ID NO.2MATPMPTRQLFIDGEWREPILKKRIEIVNPATEEVIGDIPAATTEDVEVAVNAARRAFSRNKGKDWAKAPGAVRAKYLRAIAAKVNERKSDLAKLEALDCGKPLDEAVWDMDDVAGCFEFYADLAEGLDAKQKAPVSLPMETFKSYVLKQPVGVVGLITPWNYPLLMAVWKVAPSLAAGCTAILKPSELASVTCLELADICREVGLPAGVLNVLTGYGSEAGAPLASHPGVDKIAFTGSFATGSKVMTAAAQLVKPVSMELGGKSPIIVFDD
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有益效果1、本發明公開了一種甜菜堿醛脫氫酶基因(DsBADH基因)及其所編碼的蛋白質。甜菜堿醛脫氫酶基因為雙子葉植物播娘蒿中的首次報道，有望應用于雙子葉植物的遺傳改良。該基因來自播娘蒿(Descurainia sophia)，可作為目的基因導入植物，提高植物耐鹽性，以進行植物品種改良。所編碼的蛋白質具有耐鹽功能。
2、本發明人提供的DsBADH基因功能是參予甜菜堿的生物合成。mRNA表達分析表明DsBADH基因無論在播娘蒿幼苗的地上部還是地下部都在高鹽(200mMNaCl)誘導條件下表達增強。
3、本發明的DsBADH基因來自播娘蒿，具有適合于播娘蒿等雙子葉植物表達的優化密碼子，其基因工程受體植物除了單子葉植物，如小麥、玉米、水稻等之外更加適合于擬南芥、油菜、煙草、棉花等雙子葉植物。
4、利用本發明DsBADH基因作為目的基因構建植物表達載體，其中可用任何一種啟動子例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子，該表達載體中必要時可包括增強子，不論是轉錄增強子或翻譯增強子。為了簡化轉化細胞的鑒定可使用選擇性標記包括對抗生素抗性的酶，也可利用顏色變化(例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發光(例如熒光素酶)來識別的化合物的酶類，也可用無標記選擇。所用的表達載體可使用Ti質粒，Ri質粒，植物病毒載體等。轉化方法可用經農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法或其它方法轉化植物。
具體實施例方式
實施例1選用播娘蒿“TX-1”(為耐逆境、耐鹽的雜草植物野生種，編號為TX-1)。待播娘蒿幼苗長至3cm后，用200mM NaCl進行處理，12小時后立即取葉片置于液氮中冷凍保存。根據擬南芥甜菜堿醛脫氫酶基因的全長編碼序列并結合播娘蒿的甜菜堿醛脫氫酶基因的3’端cDNA克隆，設計兩端引物P1GCACCACGAATCCACGATCCAG，P2AGCACAAAGATGGGACATAC以獲得播釀蒿甜菜堿醛脫氫酶基因的全長序列。以總RNA為模板，經反轉錄合成cDNA第一鏈后，用高保真Tag酶(購自Roche)進行PCR擴增。PCR程序如下94℃預變性3min，94℃變性50s，56℃復性90s，72℃延伸2min，35個循環后，72℃10min。經過普通Tag酶(購自鼎國公司，北京)加A后克隆至pGEM-T載體(購自Promega)。委托北京三博遠志生物有限公司測序。最終將PCR擴增的序列與播娘蒿的甜菜堿醛脫氫酶基因的3’端cDNA克隆進行拼接獲得了播娘蒿甜菜堿醛脫氫酶基因DsBADH的全長cDNA序列(見SEQ ID NO.1)。
BLAST的結果及分子建模結果證明從播娘蒿中新得到的基因確為一個編碼甜菜堿醛脫氫酶基因，因為該基因編碼產物為甜菜堿合成途徑中的關鍵酶，具有抗逆功能。
實施例2上述獲得播娘蒿甜菜堿醛脫氫酶基因DsBADH的cDNA序列SEQ ID NO.1其編碼的蛋白質，來自播娘蒿(Descurainia sophia)，它的氨基酸序列為SEQ ID NO.2，經在數據庫中比較它的編碼蛋白與菠菜、山菠菜和甜菜甜菜堿醛脫氫酶的氨基酸相似性分別為75％、75％、82％。(見SEQ ID NO.2)。其蛋白質序列在257～266包含一個編碼十肽的高度保守序列Val-Ser-Met-Glu-Leu-Gly-Gly-Lys-Ser-Pro，該結構在醛脫氫酶中是十分保守的；而且在294位點上含有與酶功能有關的醛脫氫酶高度保守的氨基酸殘基Cys，這些殘基可能包含NAD+結合位點及酶催化位點；DsBADH的N端的信號肽序列表明DsBADH定位于葉綠體中，與菠菜甜菜堿醛脫氫酶最初在葉綠體中被分離的結果一致。
實施例3用實例1中設計的DsBADH兩端引物P1、P2進行半定量RT-PCR分析播娘蒿根、莖與葉的表達，結果表明，播娘蒿根、莖與葉DsBADH的表達在2000mM NaCl處理下受鹽誘導正調節表達，說明DsBADH的表達與鹽脅迫有關。
實驗例4根據實施例1得到的DsBADH的全長序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定，如插入pBI121載體的BamHI位點則設計引物為AGGATCCGCACCACGAATCCACGATCCAG，AGGATCCAGCACAAAGATGGGACATAC)，以便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板，經PCR擴增后，將DsBADH的cDNA克隆至中間載體(如pGEM-T，promega)，進一步克隆到雙元表達載體(如pBI121和改進的pCAMBIA1301)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉入農桿菌中，轉入煙草。對獲得的轉基因植株進行PCR，Southern雜交以及Northern雜交驗證后進行植物的耐鹽性評價。將轉基因植株的T2代和對照植株進行200mMNaCl的持續處理，觀察它們的生長表現，結果表明轉基因煙草在1.2％NaCl處理3天后能夠在正常生長條件下恢復，而對照則死亡。
上述實施例1、2表明本發明為來源于播娘蒿的甜菜堿醛脫氫酶基因DsBADH。實驗例3、4表明該基因具有使植物耐鹽的功能。此類基因由于來源于雙子葉植物，具有雙子葉植物優化的密碼子，與單子葉植物來源的甜菜堿醛脫氫酶基因相比，更加適合于擬南芥、油菜、煙草、棉花等雙子葉作物的抗逆性遺傳改良。
本發明人從雙子葉植物播娘蒿(Descurainia sophia)中克隆了一個cDNA，編碼甜菜堿醛脫氫酶基因，命名為DsBADH。經在數據庫中比較它的編碼蛋白與菠菜、山菠菜和甜菜甜菜堿醛脫氫酶的氨基酸相似性分別為75％、75％、82％。DsBADHcDNA全長1776bp，含有1503bp的ORF，編碼含501個氨基酸的蛋白質，5’-UTR為83bp，3’-UTR為190bp。DsBADH編碼蛋白含有一個編碼十肽的高度保守序列，該結構在醛脫氫酶中是十分保守的，而且含有與酶功能有關的醛脫氫酶高度保守的氨基酸殘基Cys，N端信號肽序列表明其定位于葉綠體mRNA表達分析表明DsBADH無論在播娘蒿幼苗的地上部還是地下部都在高鹽(200mM NaCl)誘導條件下表達增強。轉基因研究表明，將DsBADH基因轉入煙草，轉基因植株在正常條件下的長勢類似對照而且基因過量表達的轉基因植株比對照有明顯高的耐鹽性。該基因可作為目的基因導入植物，提高植物耐鹽性，以進行植物品種改良。
綜上所述，本發明人提供的DsBADH基因是首次在播娘蒿中分離的新基因，其功能參予甜菜堿的生物合成。本發明所述的一種植物甜菜堿醛脫氫酶(基因)可能是來自所有植物包括山菠菜、菠菜、甜菜等。可利用本發明DsBADH基因作為目的基因構建植物表達載體，其中可用任何一種啟動子例如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動子，該表達載體中必要時可包括增強子，不論是轉錄增強子或翻譯增強子。為了簡化轉化細胞的鑒定可使用選擇性標記包括對抗生素抗性的酶，也可利用顏色變化(例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或發光(例如熒光素酶)來識別的化合物的酶類，也可用無標記選擇。所用的表達載體可使用Ti質粒，Ri質粒，植物病毒載體等。轉化方法可用經農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法或其它方法轉化植物。
本發明的DsBADH基因來自播娘蒿，具有適合于播娘蒿等雙子葉植物表達的優化密碼子，其基因工程受體植物除了單子葉植物，如小麥、玉米、水稻等之外更加適合于擬南芥、油菜、煙草、棉花等雙子葉植物。
本發明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度1776bp(B)類型核苷酸
(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型核苷酸(iii)序列描述SEQ ID NO.1(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度501a.a(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結構線性(ii)分子類型蛋白質(iii)序列描述SEQ ID NO.2序列表<110>南京農業大學<120>一種甜菜堿醛脫氫酶基因及其所編碼的蛋白質<141>2005-06-02<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1776<212>DNA<213>播娘蒿(Descurainia sophia)<221>CDS<222>(84)..(1589)<221>3’UTR<222>(1590)..(1776)<221>5’UTR<222>(1)..(83)<221>polyA_site<222>(1749)..(1776)<400>1gcaccacgaa tccacgatcc agtgagcagc agcaactcca cctccggaaa aaggagagag60
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260 265 270Val Asp Leu Asp Lys Ala Ala Glu Trp Ala Leu Phe Gly Cys Phe Trp275 280 285Thr Asn Gly Gln Ile Cys Ser Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val His Glu290 295 300Ser Ile Ala Ser Glu Phe Ile Glu Lys Leu Val Lys Trp Ser Lys Asn305 310 315 320Ile Lys Ile Ser Asp Pro Met Glu Glu Gly Cys Arg Leu Gly Pro Val325 330 335Val Ser Lys Gly Gln Tyr Glu Lys Ile Leu Lys Phe Ile Ser Thr Ala340 345 350Lys Asp Glu Gly Ala Thr Ile Val His Gly Gly Ser Arg Pro Glu His355 360 365Leu Glu Lys Gly Phe Phe Ile Glu Pro Thr Ile Ile Thr Asp Val Thr370 375 380Thr Ser Met Glu Ile Trp Arg Glu Glu Val Phe Gly Pro Val Leu Cys385 390 395 400Val Lys Thr Phe Gly Ser Glu Asp Glu Ala Ile Glu Leu Ala Asn Asp405 410 415Ser His Tyr Gly Leu Gly Ala Ala Val Ile Ser Asn Asp Thr Glu Arg420 425 430Cys Asp Arg Val Ser Gln Ala Phe Glu Ala Gly Ile Val Trp Val Asn435 440 445Cys Ser Gln Pro Cys Phe Thr Gln Ala Pro Trp Gly Gly Val Lys Arg450 455 460Ser Gly Phe Gly Arg Glu Leu Gly Glu Trp Gly Leu Asp Asn Tyr Leu465 470 475 480Ser Val Lys Gln Val Thr Leu Tyr Thr Ser Asn Asp Pro Trp Gly Trp485 490 495Tyr Lys Ser Pro Asn500
權利要求
1.一種甜菜堿醛脫氫酶基因(DsBADH)，來自播娘蒿(Descurainia sophia)，命名為DsBADH基因，其核苷酸序列SEQ ID NO.1為GCACCACGAATCCACGATCCAGTGAGCAGCAGCAACTCCACCTCCGGAAAAAGGAGAGAGAAGCTCTTGATTCAGATACGAAAATGGCGACGCCGATGCCTACTCGCCAACTATTCATCGACGGCGAGTGGAGAGAGCCCATCTTGAAGAAGCGAATCGAGATCGTGAATCCGGCTACTGAAGAGGTCATTGGTGATATCCCTGCAGCTACAACGGAGGACGTGGAGGTTGCAGTTAACGCTGCTCGAAGAGCATTTTCAAGGAATAAAGGAAAAGATTGGGCTAAAGCACCAGGAGCTGTTCGTGCTAAGTATTTACGTGCTATTGCTGCTAAGGTAAATGAAAGAAAGTCGGATCTGGCAAAGCTCGAGGCGCTTGATTGTGGTAAACCATTGGATGAAGCAGTCTGGGATATGGATGATGTTGCTGGATGTTTTGAATTTTATGCTGACCTTGCTGAAGGATTAGATGCTAAGCAGAAAGCACCAGTCTCGCTTCCCATGGAGACTTTTAAGAGTTATGTTCTGAAGCAACCTGTTGGAGTTGTGGGACTTATTACACCATGGAATTACCCACTTTTGATGGCTGTTTGGAAGGTGGCTCCTTCACTTGCTGCAGGGTGCACTGCGATTCTCAAGCCATCAGAGCTGGCATCAGTCACTTGTTTGGAGCTTGCTGATATATGTCGAGAAGTTGGTCTTCCAGCTGGGGTCCTCAATGTTTTGACTGGTTACGGTTCGGAAGCTGGTGCTCCTTTGGCATCACATCCCGGCGTAGACAAGATTGCATTTACTGGAAGTTTCGCCACAGGAAGTAAGGTCATGACAGCTGCTGCTCAGTTGGTGAAGCCTGTTTCTATGGAACTTGGTGGGAAGAGCCCTATCATTGTGTTTGATGACGTTGATCTTGATAAAGCTGCTGAATGGGCTCTCTTCGGTTGCTTCTGGACAAATGGTCAGATCTGCAGTGCAACTTCCCGGCTTCTTGTTCATGAAAGCATCGCATCTGAATTCATAGAAAAGCTTGTAAAATGGAGCAAAAACATTAAAATTTCAGACCCCATGGAAGAAGGATGCAGGCTTGGTCCTGTCGTTAGCAAAGGACAGTACGAGAAGATATTGAAGTTTATCTCAACGGCTAAGGATGAAGGTGCAACAATCGTGCATGGTGGTTCCCGACCTGAGCATCTAGAAAAGGGTTTCTTTATTGAACCAACCATCATAACTGATGTAACTACTTCAATGGAAATCTGGAGAGAAGAAGTTTTCGGGCCTGTTCTTTGTGTAAAAACATTTGGCAGTGAGGACGAGGCAATTGAGCTAGCAAACGACTCCCATTACGGGTTAGGAGCTGCAGTGATATCTAATGATACAGAAAGATGTGACCGTGTAAGCCAGGCCTTTGAAGCTGGGATTGTCTGGGTTAACTGCTCGCAGCCTTGCTTTACTCAAGCCCCATGGGGTGGAGTCAAACGCAGTGGGTTTGGACGTGAACTTGGAGAATGGGGACTTGATAACTACTTGAGTGTAAAACAAGTGACTCTTTACACTTCAAACGATCCCTGGGGATGGTACAAATCTCCCAACTAAGTAATGAATACATTGTCATGAAAGAGGAAGCCAAACTAAGTGATGTATGTCCCATCTTTGTGCTTTTTCTTATCAATCTGTCAAATTTAGTCCTGAAACTCCTCTTGTAAAACCTTTTGAGTTACGGAAAAGACAATGAATGAATAAAGATGCTTAGGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
2.權利要求1所述的一種雙子葉植物甜菜堿醛脫氫酶基因所編碼的蛋白質，來自播娘蒿(Descurainia sophia)，命名為DsBADH蛋白質，它具有如下所示的氨基酸序列SEQ ID NO.2MATPMPTRQLFIDGEWREPILKKRIEIVNPATEEVIGDIPAATTEDVEVAVNAARRAFSRNKGKDWAKAPGAVRAKYLRAIAAKVNERKSDLAKLEALDCGKPLDEAVWDMDDVAGCFEFYADLAEGLDAKQKAPVSLPMETFKSYVLKQPVGVVGLITPWNYPLLMAVWKVAPSLAAGCTAILKPSELASVTCLELADICREVGLPAGVLNVLTGYGSEAGAPLASHPGVDKIAFTGSFATGSKVMTAAAQLVKPVSMELGGKSPIIVFDDVDLDKAAEWALFGCFWTNGQICSATSRLLVHESIASEFIEKLVKWSKNIKISDPMEEGCRLGPVVSKGQYEKILKFISTAKDEGATIVHGGSRPEHLEKGFFIEPTIITDVTTSMEIWREEVFGPVLCVKTFGSEDEAIELANDSHYGLGAAVISNDTERCDRVSQAFEAGIVWVNCSQPCFTQAPWGGVKRSGFGRELGEWGLDNYLSVKQVTLYTSNDPWGWYKSPN。
全文摘要
本發明公開了一種甜菜堿醛脫氫酶基因及其所編碼的蛋白質，屬于基因工程領域。播娘蒿甜菜堿醛脫氫酶基因(DsBADH)的cDNA序列SEQ ID NO.1及其編碼的氨基酸序列SEQ ID NO.2。本發明基因為雙子葉植物播娘蒿的首次報道，參與播娘蒿甜菜堿的生物合成，mRNA表達分析表明該基因受高鹽的誘導。轉基因實驗證明該基因的超量表達提高了煙草的耐鹽性。DsBADH可作為目的基因導入植物，提高植物耐鹽性。
文檔編號C12N9/04GK1721539SQ20051004045
公開日2006年1月18日 申請日期2005年6月9日 優先權日2005年6月9日
發明者管榮展, 董海濱, 張紅生, 王建飛, 王慶亞 申請人:南京農業大學