專利名稱：發根農桿菌轉化植物發根培養植物寄生線蟲的方法
技術領域：
本發明屬于一種植物寄生線蟲的培養方法，具體的說是一種利用發根農桿菌轉化植物發根培養植物寄生線蟲的方法。
背景技術：
植物寄生線蟲是一類重要的病原生物，其中有許多是國際公認的毀滅性有害生物如松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)、香蕉穿孔線蟲(Radopholussimilis)、馬鈴薯白線蟲(G.loboderapallida)和馬鈴薯金線蟲(G.rostochiensis)等，全世界每年因植物寄生線蟲危害而造成的經濟損失超過1000億美元。植物寄生線蟲對植物的危害不僅表現在掠奪寄主植物營養以及取食活動所造成的機械損傷，更為重要的是其食道腺分泌物導致寄主植物發生一系列病理變化以及傳播其它病原物或刺激和促進其它病原物的繼發性侵染危害。
以我國北方薯區甘薯作物上最嚴重的病害甘薯莖線蟲病為例，線蟲侵入甘薯后，背食道腺分泌果膠酶、淀粉酶和蛋白酶等使甘薯細胞崩潰、組織腐爛，伴隨著其它真菌和細菌加劇危害，常形成“糠心”或龜裂，使甘薯失去食用價值，一般發病田塊減產20％～50％，重病田塊基本上絕產無收。
由于20世紀40年代初期至50年代中期，殺線蟲劑的發現和使用、一些毀滅性植物寄生線蟲病害的發生和蔓延以及植物線蟲與其它植物病原生物相互關系的揭示，人們逐步認識到植物寄生線蟲危害給農林業造成的重大經濟損失，從而使植物寄生線蟲研究得到重視和發展。
為了很好地控制線蟲病的發生和危害，必須發展和使用線蟲的生化和生物控制劑，發展生化和生物控制劑首先要了解植物寄生線蟲的生化和遺傳特性。要做到這一點，必須培養得到大量的一致的線蟲群體作為研究對象。植物寄生線蟲、植物宿主和環境之間的關系是極其復雜的，并且難以評估在土壤中所發生的變化。因而建立一個植物寄生線蟲有效的培養體系是植物線蟲研究的重要技術平臺。
圍繞植物寄生線蟲培養體系的研究已經取得一些重要進展。當前主要植物寄生線蟲的培養方法采取(1)、寄主植物培養；(2)、愈傷組織或離體根上單外源培養；(3)在微生物上培養；(4)在特定成分的培養基上進行無外源培養。表明植物寄生線蟲培養已由雜外源培養開始，過渡到單外源培養，現在發展到無外源培養。
由于絕大多數植物寄生線蟲都不能進行無外源培養，寄主植物培養可以分離得到大量的線蟲作為研究對象，缺點是由于植物寄生線蟲、植物宿主關系的復雜性，研究其生化很困難；愈傷組織或離體根上單外源培養，是目前研究植物寄生線蟲生化和遺傳發育特性上常采用的方法，缺點在于培養的線蟲群體數量小，不能繼代培養，影響實驗的連續性。這就要求盡快研究出植物寄生線蟲的單外源高效連續培養體系。土壤是大多數線蟲的家園。土壤有線蟲傳播的水分和線蟲食物來源的植物根系。植物寄生線蟲對植物根系有一定的趨向性，有很大一部分植物寄生線蟲是以取食植物根系作為危害方式的。
發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)是屬于根瘤菌科(Rhizobitaceae)農桿菌屬(Agrobacterium)的革蘭氏陰性菌，能侵染絕大多數的雙子葉植物和少數單子葉植物及個別的裸子植物，誘發被感染植物的受傷部位長出發根(hairy root)。當發根農桿菌感染植物受傷部位時，Ri質粒所含有的T-DNA片段就轉入植物的基因組。被感染的植物細胞能快速大量地繁殖，從而在形態學上表現出在被感染的部位長出發根。關于農桿菌刺激生根的機制，過去一直認為是一種“與植物生長素無關”，最近認為可能是通過一種間接的基因相互作用而導致類似生長素傳導模式的作用機理。由于每一條毛狀根起源于一個細胞，所以將每一條根作為一個克隆在含抗生素的培養基上培養，直到完全除菌。轉化根在不加外源激素的培養基中可快速生長，分支多，向地性基本喪失。
近20年來，人們運用發根農桿菌轉化有較高經濟價值的植物，誘導產生發根(hairy root)，利用發根培養技術來生產和提取有用的次生代謝產物。發根生長速度快，具激素自主性，分化水平高，遺傳特性穩定，合成能力較強，現已發展成為繼細胞培養技術之后的又一新的培養技術。
發明內容
本發明是利用發根農桿菌轉化植物發根培養植物寄生線蟲，其主要技術體系是在無菌條件下，利用不加外源激素的培養基上使發根農桿菌轉化植物發根快速生長，為植物寄生線蟲生長、發育和繁殖提供足夠的營養，完成線蟲的連續培養。
本發明的技術方案如下發根農桿菌轉化植物發根培養植物寄生線蟲的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、選取植物組織，并消毒；(2)、活化發根農桿菌；(3)、將發根農桿菌接種到植物組織上，誘發植物發根；(4)、將植物上生長的發根的根尖生長點部位轉接到培養基上生長；再截取培養基上發根的根尖生長點部位轉接到培養基上生長；如此重復，經過數代的連續根尖培養，得到無菌的植物發根；(5)、獲得分離出來的線蟲并消毒滅菌；(6)、植物寄生線蟲在無菌條件下在培養無菌的植物發根的培養基上生長；(7)、將培養基放在清水中，線蟲游離到清水中，實現分離。
所述的植物為胡蘿卜，培養基為MSR培養基。
所述發根農桿菌轉化植物發根培養植物寄生線蟲的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、選取干凈去皮胡蘿卜，用0.05％的次氯酸鈉表面消毒，并用無菌蒸餾水沖洗，切成0.5-1cm厚，將胡蘿卜片接種于1％水瓊脂培養基中；(2)、將活化的發根農桿菌ATCC11325菌液，取一滴于胡蘿卜切片中心處，2025℃培養，胡蘿卜圓片上，位于木質部與韌皮部之間的形成層處陸續產生發根；(3)、選擇生長迅速、粗壯的根，截取1～3厘米長的根尖生長點，轉接到MSR培養基生長發根；(4)、待發根根尖長大后，再截取2～3厘米長的根尖生長點，轉接到MSR培養基上生長；反復多次，經過數代連續根尖培養，得到純凈無菌的胡蘿卜發根；(5)、分離得到寄主植物甘薯發病薯塊上的甘薯莖線蟲；(6)、將線蟲表面用0.01-0.05％升汞消毒后，用無菌水沖洗，然后在無菌狀態下接種到培養有發根的培養皿里的MSR培養基中，密封，然后放置于無光照的培養箱中20-25℃培養；(7)、將培養基放到清水中，或者將清水放到培養基中，線蟲將游到清水中，分離出來。
在MSR培養基上面添加新鮮培養基，發根就進入上面的培養基又可以獲得生長所需的養分。
附圖
是本發明的工藝路線。
本發明的優點(1)、發根和線蟲可以同時生長，培養的線蟲數量大；(2)、發根上大量的側根和豐富的根毛為線蟲提供了適口的多取食位點；心(3)、培養體系是透明的，可以通過顯微鏡觀察線蟲的取食情況和生長發育情況；(4)、發根繼代方便，可以連續培養；(5)培養的線蟲分離方便。
本發明的用途(1)、利用該系統植物根系和植物寄生線蟲的侵染關系，建立植物對植物寄生線蟲抗性鑒定的體系。發根具有完整的正常根組織結構，符合植物內寄生線蟲的生長環境。因此用此系統更能反映出植物寄生線蟲和寄主相互作用的真實情況。
(2)、通過此培養方法，能夠得到大量無菌線蟲，可以直接用于接種和研究應用，避免了由于消毒所造成的線蟲活力的下降。同時這種單寄主培養體系也可以用于線蟲種質的保藏。
(3)、為研究工作提供大量一致的線蟲群體。用于教學部門，便于學生觀察了解線蟲的形態特征，取食特性；進行植物寄生線蟲生化和遺傳發育特性的連續性研究；(4)、利用該體系篩選、鑒定殺線蟲藥劑和研究無外源培養提供技術資料。
(5)根系可以用來作為轉基因的快速表達檢測實驗，這比用真實植物下種到盆里或地里周期短。
(6)研究植物線蟲的一個關鍵是研究線蟲與寄主細胞發生關系的直接部位，利用發根系統培養線蟲的方法，可為很多高技術實驗如微芯片研究和制作cDNA文庫等提供大量實驗材料。
具體實施例方式
由于發根農桿菌能侵染絕大多數的雙子葉植物和少數單子葉植物及個別的裸子植物，誘發被感染植物的受傷部位長出發根，因而可以建立發根農桿菌能侵染的重要農作物、經濟作物和果樹等等發根體系。并應用于植物寄生線蟲的培養和鑒定。以下以胡蘿卜發根培養甘薯莖線蟲為實施例，其過程如下一、胡蘿卜發根的誘導將胡蘿卜洗凈，削去胡蘿卜外表皮，用0.05％的次氯酸鈉表面消毒20min，無菌蒸餾水沖洗5次，然后用手術刀切成0.5-1cm厚，將胡蘿卜片接種于1％水瓊脂培養基中(胡蘿卜片底部浸漬在1％水瓊脂培養基中，上表面露出)，將活化的發根農桿菌ATCC11325菌液，取一滴于胡蘿卜切片中心處，25℃培養。經過10天培養，胡蘿卜圓片上，位于木質部與韌皮部之間的形成層處陸續產生發根。15天后發根長大3cm左右。選擇生長迅速、粗壯的根，截取2～3厘米長的根尖生長點，轉接到MSR培養基(發根切口部位插在MSR培養基上)；待根尖長大后，再截取2～3厘米長的根尖生長點，轉接到MSR培養基上生長；反復多次，經過數代連續根尖培養，以便除去發根表面可能帶有的土壤農桿菌，得到純凈無菌的胡蘿卜發根。
二、甘薯莖線蟲的分離用淺盤法分離得到寄主植物甘薯發病薯塊上的甘薯莖線蟲。
三、發根培養線蟲將線蟲表面用0.01-0.05％升汞消毒20min后，用無菌水沖洗數次，然后按每皿100條的線蟲量在無菌狀態下接種到培養有發根的培養皿里的MSR培養基中，用封口膠帶將培養皿蓋封口，然后放置于無光照的培養箱中25℃培養。一個月后可以看到培養皿中繁殖了多于開始幾倍的線蟲。
四、發根培養基的更新利用發根向上生長的特性，在老培養基上面放置新鮮培養基，發根就進入上面的培養基又可以獲得生長所需的養分，使得培養基地更新方便。
五、線蟲的分離在發根和發根培養基上生長著大量無菌寄生線蟲。線蟲具有趨水性，將培養基放到清水中，或者將清水放到培養基中，線蟲將游到清水中，分離出來。MSR培養基組分(mg/L)(Stephane Declerck 1989)
Stephane Declerck；Desire G.Strullu and Christian Plenchette Mycologia 90(4)1998，579
權利要求
1.發根農桿菌轉化植物發根培養植物寄生線蟲的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、選取植物組織，并消毒；(2)、活化發根農桿菌；(3)、將發根農桿菌接種到植物組織上，誘發植物發根；(4)、將植物上生長的發根的根尖生長點部位轉接到培養基上生長；再截取培養基上發根的根尖生長點部位轉接到培養基上生長；如此重復，經過數代的連續根尖培養，得到無菌的植物發根；(5)、獲得分離出來的線蟲并消毒滅菌；(6)、植物寄生線蟲在無菌條件下在培養無菌的植物發根的培養基上生長；(7)、將培養基放在清水中，線蟲游離到清水中，實現分離。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述的植物為胡蘿卜，培養基為MSR培養基。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步驟(1)、選取干凈去皮胡蘿卜，用0.05％的次氯酸鈉表面消毒，并用無菌蒸餾水沖洗，切成0.5～1cm厚，將胡蘿卜片接種于1％水瓊脂培養基中；(2)、將活化的發根農桿菌ATCC11325菌液，取一滴于胡蘿卜切片中心處，20～25℃培養，胡蘿卜圓片上，位于木質部與韌皮部之間的形成層處陸續產生發根；(3)、選擇生長迅速、粗壯的根，截取1～3厘米長的根尖生長點，轉接到MSR培養基生長發根；(4)、待發根根尖長大后，再截取2～3厘米長的根尖生長點，轉接到MSR培養基上生長；反復多次，經過數代連續根尖培養，得到純凈無菌的胡蘿卜發根；(5)、分離得到寄主植物甘薯發病薯塊上的甘薯莖線蟲；(6)、將線蟲表面用0.01-0.05％升汞消毒后，用無菌水沖洗，然后在無菌狀態下接種到培養有發根的培養皿里的MSR培養基中，密封，然后放置于無光照的培養箱中20~25℃培養；(7)、將培養基放到清水中，或者將清水放到培養基中，線蟲將游到清水中，分離出來。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于在(6)步中，在MSR培養基上面添加新鮮培養基，發根就進入上面的培養基又可以獲得生長所需的養分。
全文摘要
本發明公開了發根農桿菌轉化植物發根培養植物寄生線蟲的方法，在無菌條件下，利用不加外源激素的培養基上使發根農桿菌轉化植物發根快速生長，為植物寄生線蟲生長、發育和繁殖提供足夠的營養，完成線蟲的連續培養。通過此培養方法，能夠得到大量無菌線蟲，可以直接用于接種和研究應用。
文檔編號C12N5/06GK1737123SQ20051003841
公開日2006年2月22日 申請日期2005年3月10日 優先權日2005年3月10日
發明者阮龍, 肖翔, 王鈺, 劉兵, 吳躍進, 許安, 余增亮 申請人:中國科學院等離子體物理研究所