專利名稱：暫態表達重組蛋白雞輸卵管生物反應器的制造方法
技術領域：
本發明屬于基因工程和生物制藥領域。
背景技術：
目前，藥用重組蛋白的表達系統主要有細菌表達、動物細胞表達和轉基因動物生物反應器。細菌表達系統以大腸桿菌為典型代表，其技術難度不大，生產成本較低，現有的重組蛋白多用大腸桿菌表達，但表達的重組蛋白一般不能進行有效的折疊、加工和修飾，而且多為不溶性的包涵體，不僅活性低或無，而且對目的產物的純化不利。動物細胞表達的最大優點是產物的活性完全，但表達水平普遍偏低，生產成本較高。轉基因動物生物反應器是利用基因工程和胚胎工程技術，將編碼貴重蛋白的基因轉移到動物的基因組，以轉基因動物的組織或器官作為生產重組蛋白的生物工廠，具有表達水平高、表達產物活性完全和無污染等突出優點，具有十分光明的產業化前景，但其技術難度很大，許多理論和技術難題均有待突破。
對于制備轉基因動物生物反應器而言，雞具有十分突出的優勢，其輸卵管膨大部是合成蛋白的天然工廠，蛋清中的蛋白含量高達100克/升，而且能對蛋白進行正確的加工和修飾，所以表達產物的活性完全，加之飼養成本低、世代間隔(研制周期)短、產蛋易收集和不易污染等優點，特別適合作為生產重組蛋白的生物反應器。
家禽輸卵管生物反應器是利用卵清蛋白基因的表達調控序列指導外源基因在雞輸卵管細胞中表達，從蛋清中獲得表達產物的一種技術，包括用轉基因技術建立的轉基因雞輸卵管生物反應器和產蛋雞基因轉染為基礎的輸卵管暫態表達生物反應器。轉基因雞輸卵管生物反應器具有遺傳穩定、表達水平高等突出優點，制備方法主要有反轉錄病毒介導法、精子轉染法、原始生殖細胞轉染移植法、發育雞胚胚盤注射法和胚胎干細胞法，但其技術難度都很大，目前尚無具有產業化前景的轉基因雞生物反應器的報道。輸卵管暫態表達生物反應器的缺點是外源基因不能遺傳、表達水平低且時間短暫，但其技術難度不大，目前多作為研究雞蛋清蛋白基因表達調控機制和雞輸卵管定位表達載體質量檢驗的實驗模型。迄今為止，僅日本科學家于2002年嘗試用體內基因電子穿孔法，使人的堿性磷酸酶基因在雞的輸卵管細胞及蛋清中獲得表達，但該方法不僅需要特殊的儀器設備、對雞進行麻醉和外科手術，而且蛋清中重組酶的表達水平很低(納克/毫升)，維持時間很短(小于4天)，所以沒有實用價值。
發明內容
本發明的目的在于建立簡單、非手術、經濟、實用的暫態表達重組蛋白雞輸卵管生物反應器的制造方法。
本發明的技術方案包括雞卵清蛋白基因調控序列的分子克隆、雞輸卵管高效表達載體的構建及優化、基因轉染劑的選擇、重組載體注射方法、劑量和次數的選擇a、分子克隆雞卵清蛋白基因調控序列根據已發表的雞卵清蛋白基因序列(GenBank登錄號GI212504)設計引物，以中國狼山雞基因組DNA為模板，用高保真多聚酶鏈式反應(PCR)擴增長度分別為3.0kb的5′和3′雞卵清蛋白基因調控序列；b、構建雞輸卵管特異表達載體對粘粒載體pHC修飾獲得pHC20載體；對真核細胞表達載體pcDNA3.0修飾獲得pcDNA2.2載體；將雞卵清蛋白基因的5′和3′調控序列同時克隆入pHC20載體，獲得pOV1雞輸卵管特異表達載體；將雞卵清蛋白基因的5′和3′調控序列同時克隆入pcDNA2.2載體，獲得pOV2雞輸卵管特異表達載體；將雞卵清蛋白基因的5′調控序列單獨克隆入pcDNA2.2載體，獲得pOV3雞輸卵管特異表達載體；c、將含人組織激肽釋放酶cDNA(登錄號為GI22027643)的三種雞輸卵管特異表達重組載體與選定的雞體內基因轉染劑25kDa PEI混合，比例為1微克DNA∶2微升PEI；分別經翅靜脈注射產蛋雞，注射總劑量為2～3毫克重組載體，分一次或兩次注射。
與現有的同類技術相比，該發明不僅具有非手術、經濟、實用等優點，而且目的基因的表達水平高、表達維持時間長、表達產物的活性完全。表達在蛋清中的重組蛋白既可以純化后作為防治人、畜疾病的藥物，也可以不經純化直接作為人類的保健品或動物的飼料添加劑進行開發(視具體蛋白而定)。
本發明對pHC粘粒載體的修飾包括在其Sal I和Not I限制酶切位點之間增加Xcm I、Eco RI、Pst I、Sma I、Bam HI、Spe I、Xba I、Eag I酶切位點。
本發明對pcDNA3.0真核表達載體修飾為去掉其中的SV40病毒序列和新霉素(neo)抗性基因。
本發明中雞體內基因轉染劑25kDa聚乙烯亞胺(PEI)的濃度為10毫克/毫升。
圖1為構建的雞輸卵管特異表達載體結構示意圖。
具體實施例方式1、雞卵清蛋白基因調控序列的分子克隆根據已發表的雞卵清蛋白基因序列(GenBank登錄號GI212504)設計引物，用常規的基因組DNA提取方法提取中國狼山雞基因組DNA為模板，用大連寶生物公司的高保真多聚酶Pyrobest DNA Polymerase擴增雞卵清蛋白基因5′和3′調控序列，將獲得的擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳分析，結果表明與預計的大小相符(分別為3kb)；分別用連接酶將PCR擴增產物與商品化的PCR產物克隆載體pGEM-T連接，連接產物轉化DH5α大腸桿菌感受態細胞，經在含青霉素和X-gal的LB瓊脂平板上培養過夜后，挑取白色菌落進行液體培養和制備質粒DNA，經DNA序列測定證明，重組質粒中的5′和3′雞卵清蛋白基因調控序列的前500個核苷酸與公開發表的雞卵清蛋白基因(GenBank登錄號GI212504)無差異，獲得的重組質粒分別命名為pGEM5′和pGEM3′。
2、雞輸卵管特異表達載體的構建利用常規的基因操作技術對pHC粘粒載體和pcDNA3.0真核細胞表達載體進行改造和修飾。對pHC粘粒載體的修飾包括用Sal I和Not I限制酶消化pHC載體，去除其間的片斷后與含Sal I、Xcm I、Eco RI、Pst I、Sma I、BamHI、Spe I、Xba I、Eag I、Not I酶切位點的PCR擴增片斷連接，獲得的載體命名為pHC20。對pcDNA3.0真核細胞表達載體的修飾包括用PvuII酶消化，去除其中的SV40病毒序列和新霉素抗性基因(neo)，重新連接后的載體命名為pcDNA2.2。
用限制酶Sal I和BamH I將雞卵清蛋白基因的5′調控區從pGEM5′質粒中切出，與同樣酶消化的pHC20載體連接，獲得的重組質粒用Xho I和Not I酶消化，并與用同樣酶從pGEM3′質粒中切出的3′調控序列連接，獲得的雞輸卵管特異表達載體命名為pOV1；用相同的策略將雞卵清蛋白基因的5′和3′調控序列同時克隆入pcDNA2.2載體，獲得的雞輸卵管特異表達載體命名為pOV2；用Sal I和Xho I酶消化pcDNA2.2載體，與用同樣酶從pGEM5′質粒中切出的雞卵清蛋白基因的5′調控序列連接，獲得的雞輸卵管特異表達載體命名為pOV3。三種載體的的結構見附圖。
用于克隆雞卵清蛋白基因調控序列的PCR引物5′調控區正向引物5-TTGTCGACGCAGACTGACATGCATITCATAGG-35′調控區反向引物5-ATGGATCCCTCGAGGGTGAACTCTGAGTTGTCTAGAGC-33′調控區正向引物5-ATCTCGAGAGAGTGGCATCAATGGCTTCTGAG-33′調控區反向引物5-ATGCGGCCGCATTGGACACACTGCTCCAGATGAG-33、雞輸卵管表達載體的表達特性鑒定用Xho I酶切開三種雞輸卵管特異表達載體，末端補平后分別與從商品化質粒pSV-β-galactosidase中切出的lacZ報告基因連接，獲得的重組載體分別命名為pOV1lacZ、pOV2lacZ、pOV3lacZ，用其轉化的大腸桿菌進行LB液體培養，用標準的堿性裂解法和PEG沉淀法制備重組質粒，純化的三種重組質粒與雞體內基因轉染劑25kDaPEI混合后，分別經翅靜脈注射產蛋雞，每雞收集到一枚蛋后將其撲殺，取其心、肝、脾、腎和輸卵管組織，按商品試劑盒說明進行β-半乳糖苷酶的活性檢測，結果顯示在雞輸卵管細胞和蛋清中能檢測到β-半乳糖苷酶活性，而在心、肝、脾、腎等組織中不能檢測到β-半乳糖苷酶活性，證明三種載體不僅能指導報告基因在輸卵管細胞中表達，表達具有良好的組織特異性，而且能將表達產物分泌到蛋清中，符合雞輸卵管特異表達載體的設計要求，其中以pOV3的表達水平較高。
4、基因轉染劑的選擇將含lacZ報告基因的三種重組載體分別與商品化的脂質體(LipofectamineTMreagent)、100kDa和25kDa的PEI混合，然后分別注射產蛋雞和進行重組酶的活性檢測，結果發現PEI包被載體的表達水平與脂質體無明顯差異，而100kDa PEI的毒性較強，最終選擇25kDa PEI為轉染劑，使用濃度為10毫克/毫升。
5、基因注射劑量及次數的選擇用Xho I限制酶將克隆在pGEM-T質粒中的人組織激肽釋放酶cDNA切出，分別與同樣酶切開的三種雞輸卵管特異表達重組載體連接，用標準的堿性裂解法和PEG沉淀法從獲得的重組菌培養中制備重組質粒，與選定的雞體內基因轉染劑PEI混合，比例為1微克DNA∶2微升PEI，分別經翅靜脈注射產蛋雞，注射總量共2-3毫克重組載體，分一次或兩次(次日)注射，然后收集雞蛋，按標準的方法進行組織激肽釋放酶的活性測定，結果顯示三種載體均能指導目的基因在雞輸卵管細胞中的表達，表達產物能分泌到蛋清中，其中以pOV3的表達水平最高，高峰期的酶活性高達58U/毫升，表達時間維持10天左右。
6、雞品種對表達水平的影響選擇新揚州蛋雞和青殼蛋雞為實驗對象，用上述建立的方法進行基因注射和酶的活性測定，結果顯示兩個品種雞的外源基因表達水平無明顯差異。
7、重復注射對表達水平的影響在初次基因注射和重組酶表達下降至基因注射前水平時，用同樣的方法和劑量對試驗雞進行再次基因注射，蛋清中的酶活性測定結果顯示，再次注射后重組酶的表達水平較初次注射略高，說明試驗雞可以反復注射和利用。
8、重組酶的鑒定將重組載體注射前、后收集的雞蛋清進行聚丙烯酰胺電泳，用人組織激肽釋放酶特異單克隆抗體進行免疫轉印，與重組載體注射前的雞蛋清相比，在重組載體注射后的雞蛋清中出現分子量分別為36-37kDa和43kDa的兩條帶，前者與天然人組織激肽釋放酶的分子量相符，后者可能是保留7個氨基酸的原酶；將含重組酶的蛋清用不同pH的緩沖液稀釋，然后進行酶的活性測定，結果顯示蛋清中的重組酶在pH小于4.0和大于10.0時無活性，在pH5.0-10.0之間都有活性，以pH7.0時的活性最高；將含重組酶的蛋清分別在37℃、55℃、75℃和100℃孵育30分鐘，然后進行酶的活性測定，結果在37℃下孵育過程中，酶活性先呈上升趨勢，30分鐘時由原來的48U/毫升上升至340U/毫升，這是在37℃溫度下人組織激肽釋放酶自身激活的結果，30分鐘后呈逐漸下降趨勢，但孵育60分鐘后的酶活性仍高于37℃孵育前的酶活性，重組酶在其它溫度條件下的熱穩定性與已報道的天然人組織激肽釋放酶相似，100℃孵育30分鐘活性完全消失；用含不同單位重組酶的蛋清灌服自發性高血壓大鼠，然后用常規的方法定時測量大鼠的尾動脈舒張壓，結果在灌服2、4、6個單位重組酶后的7小時，高血壓大鼠的血壓均有明顯下降，灌服4和6單位重組酶的2天時，試驗大鼠的血壓與同齡正常大鼠接近，然后逐漸恢復到灌服前水平。
綜上所述，本發明構建的雞輸卵管表達載體不僅能有效指導lacZ報告基因和人組織激肽釋放酶基因在雞輸卵管細胞中表達，而且表達具有較強的組織特異性，其中pOV3的表達水平最高。重組載體注射雞的產蛋等生理指標無明顯影響，兩次基因注射后重組蛋白的表達維持時間為10天左右，不同品種雞的外源基因表達水平無明顯差異，重復注射對外源基因表達水平無明顯影響，說明所建立的雞輸卵管暫態表達重組蛋白技術具有通用性和實用性。表達在蛋清中的重組酶具有與天然酶相同的分子量、熱穩定性、活性pH范圍和降血壓作用，說明重組酶的理化及生物學特性與天然酶相同。重組載體用自行設計的方法(不包括在本發明內)從高密度發酵的重組菌培養物中純化所得，成本低廉，表達在雞蛋清中的人組織激肽釋放酶活性最高達58單位/毫升，37℃激活后可達340單位/毫升，用同樣方法表達的人溶菌酶接近1毫克/毫升，證明建立的雞輸卵管暫態表達重組蛋白生物反應器具有較高的表達水平和良好的產業化開發價值。
權利要求
1.暫態表達重組蛋白雞輸卵管生物反應器的制造方法，包括以下步驟a、分子克隆雞卵清蛋白基因調控序列根據已發表的雞卵清蛋白基因序列(GenBank登錄號GI212504)設計引物，以中國狼山雞基因組DNA為模板，用高保真多聚酶鏈式反應(PCR)克隆長度分別為3.0kb的5′和3′雞卵清蛋白基因調控序列；b、構建雞輸卵管特異表達載體對pHC粘粒載體修飾獲得pHC20載體；對pcDNA3.0真核表達載體修飾獲得pcDNA2.2載體；將雞卵清蛋白基因的5′和3′調控序列同時克隆入pHC20載體，獲得pOV1雞輸卵管特異表達載體；將雞卵清蛋白基因的5′和3′調控序列同時克隆入pcDNA2.2載體，獲得pOV2雞輸卵管特異表達載體；將雞卵清蛋白基因的5′調控序列克隆入pcDNA2.2載體，獲得pOV3雞輸卵管特異表達載體；c、將含人組織激肽釋放酶基因(GenBank登錄號為GI22027643)的三種雞輸卵管特異表達重組載體與選定的雞體內基因轉染劑25kDa聚乙烯亞胺(PEI)混合，比例為1微克DNA∶2微升PEI，分別經翅靜脈注射產蛋雞，注射劑總量為2～3毫克重組載體，分一次或兩次注射。
2.根據權利要求1所述暫態表達重組蛋白雞輸卵管生物反應器的制造方法，其特征在于對pHC粘粒載體的修飾包括在其Sal I和Not I限制酶切位點之間增加Xcm I、Eco RI、Pst I、Sma I、Bam HI、Spe I、Xba I、Eag I酶切位點。
3.根據權利要求1所述暫態表達重組蛋白雞輸卵管生物反應器的制造方法，其特征在于對pcDNA3.0真核表達載體修飾為去掉其中的SV40病毒序列和新霉素(neo)抗性基因。
4.根據權利要求1或2或3所述暫態表達重組蛋白雞輸卵管生物反應器的制造方法，其特征在于雞體內基因轉染劑25kDa聚乙烯亞胺(PEI)的濃度為10毫克/毫升。
全文摘要
暫態表達重組蛋白雞輸卵管生物反應器的制造方法，屬于基因工程和生物制藥領域。本發明的技術方案包括雞卵清蛋白基因調控序列的分子克隆、雞輸卵管高效表達載體的構建及優化、基因轉染劑的選擇、重組載體注射方法、劑量和次數的選擇。與現有的同類技術相比，該發明不僅具有非手術、經濟、實用等優點，而且目的基因的表達水平高、表達維持時間長、表達產物的活性完全。表達在蛋清中的重組蛋白既可以純化后作為防治人、畜疾病的藥物，也可以不經純化直接作為人類的保健品或動物的飼料添加劑進行開發。
文檔編號C12N15/87GK1673370SQ200510038300
公開日2005年9月28日 申請日期2005年1月28日 優先權日2005年1月28日
發明者孫懷昌 申請人:揚州大學