專利名稱：深圳5號非洲菊的轉基因技術的制作方法
技術領域：
本發明涉及非洲菊(Gerbera hybrida)深圳5號(S5)的轉基因技術，即通過轉基因技術獲得轉基因植株的方法。
背景技術：
非洲菊別名扶郎花，為世界六大切花之一，也是重要的盆栽花卉。它的園藝品種多，觀賞價值高。育種工作者一直都在致力于獲得各種花色、花型、花香、以及瓶插壽命長，具有抗性、耐熱、耐冷的新品種。傳統育種技術存在雜交育種時間長、雜交難以引入親緣性較遠種的優良性狀，引入某一或某些優良性狀時往往伴隨一些不良的性狀引入等缺點。利用基因工程技術將有望實現對非洲菊花色、花形、抗性、花期、瓶插壽命、花香等性狀進行改良。
目前為止，國外對非洲菊轉基因進行了初步的研究工作，但也僅限于一兩個實驗室的報道，且轉化效率很低。例如，Elomaa等(1993)以紅色品種Terra Regina試管苗的葉柄為外植體，利用根癌農桿菌將外源基因導入外植體，然后進行卡那霉素(Kan)選擇，最后每100個外植體獲得0.1-2個轉基因苗(Biotechnology，1993，11508-511)。國內的非洲菊轉基因研究還只是處于摸索轉化條件的階段，尚未能獲得轉基因植株[葉華等，2003，云南大學學報(自然科學版)，25(增刊)128-130；劉慧，2004，華中農業大學碩士學位論文]。深圳5號(S5)舌狀花為桔黃色，內輪盤狀花為黑色，花色鮮艷，很受人們喜愛。目前該品種植株再生頻率很低。另外各種病毒、微生物和害蟲的侵害以及本身的耐熱性、耐冷性不高，使非洲菊的品質提高以及廣泛應用于市場受到很大限制。
(三)發明的內容本發明的目的在于提供一種深圳5號非洲菊的轉基因方法，該方法具有穩定性好、再生和轉化效率高的優點。將含有嵌合的CaMV35S.HPT基因(潮霉素磷酸轉移酶基因)和一個嵌合的CaMV35S.GUS基因轉化深圳5號非洲菊單芽，獲得了轉基因植株，為生產上轉化其它目的基因、獲得轉基因非洲菊新品系(種)提供技術。
本發明的方法包括如下步驟步驟一，質粒導入根癌農桿菌按照常規的中間載體質粒DNA直接導入農桿菌的方法(可參照王關林和方宏筠2002年編著的《植物基因工程原理與技術》，北京科學出版社)，將pCAMBIA1301(CAMBIA公司，澳大利亞)導入根癌農桿菌LBA4404中；涂板培養，培養基采用配方為YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L鏈霉素的固體培養基A，在28±1℃條件恒溫培養46～50h；步驟二，LBA4404種子液的制備和保存挑取上述培養獲得的含pCAMBIA1301質粒的LBA4404單菌落，接種至培養基B即YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L鏈霉素的液體培養基中，28±1℃、180～220r/min條件下振蕩培養24～36h；加入體積百分比濃度為80％的甘油，直至甘油菌液混合液中最終甘油濃度為20％；將甘油菌液混合液，即LBA4404種子液分裝至eppendof管中，置于-70～-80℃條件下保存備用；步驟三，農桿菌的轉化包括如下步驟(1)活化農桿菌取步驟二所得LBA4404種子液5～8μl接種于10～15ml步驟二的培養基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養條件培養23～25h；取1ml的菌液轉接到40～50ml新鮮培養基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養條件繼續培養10～14h；將培養的菌液轉入eppendof管中，5000r/min，離心5min，去除上清液；用植物誘導培養基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培養基懸浮沉淀；在分光光度計上測定所得菌液的OD600值，OD600值為0.4～0.5時為活化的菌液，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮最終濃度為20～30mg/L，備用；(2)外植體與菌液共培養將分步驟(1)所獲得的備用菌液，在28±1℃、180～220r/min條件下振蕩培養1～2h；切取S5組培苗的單芽，在菌液中浸泡10～15min后置于配方為MS+BA 2～3mg/L+IAA 0.2～0.5mg/L+乙酰丁香酮20～30mg/L+蔗糖3％+瓊脂1％、pH5.2～5.5的共培養基中，24±1℃、黑暗條件下共培養3～4d；(3)除菌培養將分步驟(2)培養后的單芽外植體用含500mg/L頭孢拉定的無菌水沖洗，吸去表面水分；轉入MS+BA 2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+頭孢拉定400～500mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6～5.8的除菌培養基上除菌培養3～4d，培養條件為24±1℃、12h光照/12h黑暗；(4)抗生素篩選將除菌培養后的單芽轉入MS+BA2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+頭孢拉定300～400mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6～5.8的選擇培養基上培養，每7～10d轉瓶一次，轉瓶3～4次后，單芽基部誘導出不定芽；(5)擬轉基因植株的復壯和增殖培養將分步驟(4)誘導出的不定芽切下，轉入MS+BA 0.5～0.8mg/L+IAA 0.3～0.5mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.8％，pH5.6～5.8的不定芽復壯和增殖培養基上，進行復壯和增殖10～15d；再將不定芽轉入與分步驟(4)相同的選擇培養基上繼續培養30～40d；最后將生活力強的擬轉基因不定芽轉至MS+IAA 0.3～0.5mg/L+10mg/L潮霉素的生根培養基上培養，20～30d可獲得具有根的完整的擬轉基因植株，用于分子鑒定。
在本辦法步驟一中，中間載體質粒DNA直接導入農桿菌的方法一般包括根癌農桿菌感受態的制備、質DNA轉化和檢測等步驟；恒溫培養一般是在恒溫培養箱中進行的。步驟二和步驟三之(2)中，振蕩培養一般是在恒溫振蕩培養箱中進行的。在步驟三之(2)中，組培苗的獲得方法屬于現有技術，一般包括花托外植體的消毒、接種、培養、幼苗增殖和繼代培養等步驟而獲得健壯幼苗的單芽。在步驟三之(3)中，單芽外植體一般用30～50mL含頭孢拉定的無菌水沖洗2～3次，然后用吸水紙吸去表面水分。
本發明具有如下的優點和效果1、通過轉基因，經GUS穩定性表達檢測和PCR、Southern雜交檢測結果表明，轉基因苗誘導頻率最高可達到7.43％。
2、轉基因方法中采用無菌組培苗的單芽為外植體，這樣實驗材料的獲得就有了保證，而不受季節和外界環境條件變化的影響。
3、采用單芽直接誘導出不定芽(單芽增殖)這一基因轉化途徑可在較短時間(從單芽外植體接種于共培養基到獲得抗性芽約30～45d)獲得擬轉基因不定芽，再經過20～30d可獲得完整的擬轉基因組培苗。
4、本轉基因方法中不定芽再生途徑在非洲菊各品種中的研究已很成熟，因此可實現非洲菊其它品種轉基因體系的建立和后續基因工程的研究。
(四)具體的實施方式下面結合實施例1-3對本發明進行進一步的說明。
實施例1步驟一，質粒導入根癌農桿菌按照常規的中間載體質粒DNA直接導入農桿菌的方法，將pCAMBIA1301導入根癌農桿菌LBA4404中；涂板培養，培養基采用配方為YEB+50mg/L卡那霉素+50mg/L鏈霉素的固體培養基A，在28±1℃條件恒溫培養46h；步驟二，LBA4404種子液的制備和保存挑取上述培養獲得的含pCAMBIA1301質粒的LBA4404單菌落，接種至培養基B即YEB+50mg/L卡那霉素+50mg/L鏈霉素的液體培養基中，28±1℃、180r/min條件下振蕩培養24h；將已經配好的體積百分比濃度為80％的甘油與培養好的菌液混合，使甘油菌液混合液中的最終甘油濃度達到20％。將甘油菌液混合液分裝至1.5ml的eppendof管中，置于-70℃條件下保存備用；步驟三，農桿菌的轉化
(1)活化農桿菌取步驟二所得LBA4404種子液5μl接種于10ml步驟二的培養基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養條件培養23h；取1ml的菌液轉接到40ml新鮮培養基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養條件繼續培養10h；將培養的菌液轉入10ml eppendof管中，5000r/min，離心5min，去除上清液；用10ml植物誘導培養基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培養基懸浮沉淀；取所得的菌液1ml，在分光光度計上測菌液的OD600值，結果OD600值為0.4，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使最終濃度達到20mg/L，備用；(2)外植體與菌液共培養將分步驟(1)所獲得的備用菌液，在28±1℃、220r/min條件下振蕩培養1h；切取S5組培苗的單芽，在菌液中浸泡10min后置于配方為MS+BA 2mg/L+IAA 0.2mg/L+乙酰丁香酮20mg/L+蔗糖3％+瓊脂1％、pH5.5的共培養基中，24±1℃、黑暗條件下共培養3d；(3)除菌培養將分步驟(2)培養后的單芽外植體用含500mg/L頭孢拉定的無菌水沖洗3次，用吸水紙吸去表面水分；轉入MS+BA2mg/L+IAA0.2mg/L+頭孢拉定400mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6的除菌培養基上除菌培養3d，培養條件為24±1℃、12h光照/12h黑暗；(4)抗生素篩選將除菌培養后的單芽轉入MS+BA2mg/L+IAA0.2mg/L+頭孢拉定300mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6的選擇培養基上培養，每7d轉瓶一次，轉瓶3次后，單芽基部誘導出不定芽；(5)擬轉基因植株的復壯和增殖培養將分步驟(4)誘導出的不定芽切下，轉入MS+BA 0.5mg/L+IAA 0.3mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.8％，pH5.8的不定芽復壯和增殖培養基上，進行復壯和增殖10d；再將不定芽轉入與分步驟(4)相同的選擇培養基上繼續培養30d；最后將生活力強的擬轉基因不定芽轉至MS+IAA 0.3mg/L+10mg/L潮霉素的生根培養基上培養，20d可獲得具有根的完整的擬轉基因植株，用于分子鑒定。
檢測結果單芽外植體中GUS瞬時表達率為20％，抗性不定芽發生頻率達20％，最終能獲得轉基因不定芽頻率達7.43％。
實施例2其它同實施例1，不同的是步驟一培養基A為YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L鏈霉素的固體培養基，培養時間為50h；步驟二培養基B為YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L鏈霉素的液體培養基，培養條件28±1℃、220r/min，培養時間36h；LBA4404種子液分裝至1.5ml eppendof管中，置于-80℃條件下保存備用。
步驟三(1)活化農桿菌取步驟二所得LBA4404種子液8μl接種于15ml步驟二的培養基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養條件培養25h；取1ml的菌液轉接到50ml新鮮培養基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養條件繼續培養14h；將培養的菌液轉入10mleppendof管中，5000r/min，離心5min，去除上清液；用10ml植物誘導培養基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培養基懸浮沉淀；取所得的菌液1ml，在分光光度計上測菌液的OD600值，結果OD600值為0.5，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使最終濃度達到30mg/L，備用；(2)外植體與菌液共培養將分步驟(1)所獲得的備用菌液，在28±1℃、180r/min條件下振蕩培養2h；切取S5組培苗的單芽，在菌液中浸泡15min后置于配方為MS+BA 3mg/L+IAA 0.5mg/L+乙酰丁香酮30mg/L+蔗糖3％+瓊脂1％、pH5.2的共培養基中，24±1℃、黑暗條件下共培養4d；(3)除菌培養將分步驟(2)培養后的單芽外植體用含500mg/L頭孢拉定的無菌水沖洗3次，用吸水紙吸去表面水分；轉入MS+BA3mg/L+IAA0.5mg/L+頭孢拉定500mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.8的除菌培養基上除菌培養4d，培養條件為24±1℃、12h光照/12h黑暗；(4)抗生素篩選將除菌培養后的單芽轉入MS+BA3mg/L+IAA0.5mg/L+頭孢拉定400mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.8的選擇培養基上培養，每10d轉瓶一次，轉瓶4次后，單芽基部誘導出不定芽；
(5)擬轉基因植株的復壯和增殖培養將分步驟(4)誘導出的不定芽切下，轉入MS+BA 0.8mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.8％，pH5.8的不定芽復壯和增殖培養基上，進行復壯和增殖15d；再將不定芽轉入與分步驟(4)相同的選擇培養基上繼續培養40d；最后將生活力強的擬轉基因不定芽轉至MS+IAA 0.5mg/L+10mg/L潮霉素的生根培養基上培養，30d可獲得具有根的完整的擬轉基因植株，用于分子鑒定。
檢測結果單芽外植體中GUS瞬時表達率為18％，抗性不定芽發生頻率達18％，最終能獲得轉基因不定芽頻率達6.86％。
實施例3其它同實施例1，不同的是步驟1培養基A為YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L鏈霉素的固體培養基；步驟2培養基B為YEB+100mg/L卡那霉素+100mg/L鏈霉素的液體培養基，培養時間36h；步驟3(1)完成后，OD600值為0.5；(2)中備用菌液振蕩培養時間為2h；(3)外植體在除菌培養基pH為5.8條件下除菌培養3d；(4)中培養基pH為5.8；(5)中不定芽復壯和增殖培養基pH值為5.6；在生根培養基上培養的時間為30d。
檢測結果單芽外植體中GUS瞬時表達率為20.3％，抗性不定芽發生頻率達20.3％，最終能獲得轉基因不定芽頻率達7.35％。
權利要求
1.一種深圳5號非洲菊的轉基因技術，其特征在于包括如下步驟步驟一，質粒導入根癌農桿菌按照常規的中間載體質粒DNA直接導入農桿菌的方法，將pCAMBIA1301導入根癌農桿菌LBA4404中；涂板培養，培養基采用配方為YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L鏈霉素的固體培養基A，在28±1℃條件恒溫培養46～50h；步驟二，LBA4404種子液的制備和保存挑取上述培養獲得的含pCAMBIA1301質粒的LBA4404單菌落，接種至培養基B即YEB+50～100mg/L卡那霉素+50～100mg/L鏈霉素的液體培養基中，28±1℃、180～220r/min條件下振蕩培養24～36h；加入體積百分比濃度為80％的甘油，直至甘油菌液混合液中最終甘油濃度為20％；將甘油菌液混合液，即LBA4404種子液分裝至eppendof管中，置于-70～-80℃條件下保存備用；步驟三，農桿菌的轉化包括如下步驟(1)活化農桿菌取步驟二所得LBA4404種子液5～8μl接種于10～15ml步驟二的培養基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養條件培養23～25h；取1ml的菌液轉接到40～50ml新鮮培養基B中，按步驟二的溫度和振蕩培養條件繼續培養10～14h；將培養的菌液轉入eppendof管中，5000r/min，離心5min，去除上清液；用植物誘導培養基即1/2MS+3％蔗糖，pH5.2的培養基懸浮沉淀；在分光光度計上測定所得菌液的OD600值，OD600值為0.4～0.5時為活化的菌液，在此菌液中添加乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮最終濃度為20～30mg/L，備用；(2)外植體與菌液共培養將分步驟(1)所獲得的備用菌液，在28±1℃、180～220r/min條件下振蕩培養1～2h；切取S5組培苗的單芽，在菌液中浸泡10～15min后置于配方為MS+BA 2～3mg/L+IAA 0.2～0.5mg/L+乙酰丁香酮20～30mg/L+蔗糖3％+瓊脂1％、pH 5.2～5.5的共培養基中，24±1℃、黑暗條件下共培養3～4d；(3)除菌培養將分步驟(2)培養后的單芽外植體用含500mg/L頭孢拉定的無菌水沖洗，吸去表面水分；轉入MS+BA 2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+頭孢拉定400～500mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6～5.8的除菌培養基上除菌培養3～4d，培養條件為24±1℃、12h光照/12h黑暗；(4)抗生素篩選將除菌培養后的單芽轉入MS+BA2～3mg/L+IAA0.2～0.5mg/L+頭孢拉定300～400mg/L+潮霉素10mg/L+蔗糖3％+瓊脂條0.8％，pH5.6～5.8的選擇培養基上培養，每7～10d轉瓶一次，轉瓶3～4次后，單芽基部誘導出不定芽；(5)擬轉基因植株的復壯和增殖培養將分步驟(4)誘導出的不定芽切下，轉入MS+BA 0.5～0.8mg/L+IAA 0.3～0.5mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.8％，pH5.6～5.8的不定芽復壯和增殖培養基上，進行復壯和增殖10～15d；再將不定芽轉入與分步驟(4)相同的選擇培養基上繼續培養30～40d；最后將生活力強的擬轉基因不定芽轉至MS+IAA 0.3～0.5mg/L+10mg/L潮霉素的生根培養基上培養，20～30d可獲得具有根的完整的擬轉基因植株。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟一中，恒溫培養是在恒溫培養箱中進行的；步驟二和步驟三之(2)中，振蕩培養是在恒溫振蕩培養箱中進行的；在步驟三之(3)中，單芽外植體用30～50mL含頭孢拉定的無菌水沖洗2～3次，然后用吸水紙吸去表面水分。
全文摘要
一種深圳5號非洲菊的轉基因技術，其特征在于包括質粒導入根癌農桿菌、LBA4404種子液的制備和保存、農桿菌的轉化三大步驟，其中，步驟三——農桿菌的轉化包括活化農桿菌、外植體與菌液共培養、除菌培養、抗生素篩選、擬轉基因植株的復壯和增殖培養五個分步驟。本方法將含有嵌合的CaMV35S.HPT基因和一個嵌合的CaMV35S.GUS基因轉化深圳5號非洲菊單芽，獲得了轉基因植株，為生產上轉化其它目的基因、獲得轉基因非洲菊新品系(種)提供技術。本方法具有穩定性好、再生和轉化效率高的優點。
文檔編號C12N5/04GK1769461SQ20051003740
公開日2006年5月10日 申請日期2005年9月22日 優先權日2005年9月22日
發明者王小菁, 張妙彬 申請人:華南師范大學