專利名稱：新型組織型纖溶酶原激活物突變體及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域和蛋白質(zhì)大規(guī)模純化工藝領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種新的組織型纖溶酶原激活物突變體(Reteplase Mutant，r-PAM)，和該新型r-PAM的生產(chǎn)方法，以及有關(guān)的工程細(xì)胞的構(gòu)建、新型r-PAM的表達(dá)和純化工藝。
背景技術(shù)：
組織型纖溶酶原激活蛋白(tissue-type plasminogcn activator，t-PA)是一種高效特異性的生理性溶血栓藥物，屬絲氨酸蛋白水解酶，為第二代溶栓劑。t-PA分子有5個(gè)功能區(qū)F、E、K1、K2、P，分別有不同的功能。它能選擇性地將血栓上的纖維蛋白溶酶原變成纖維蛋白溶酶，從而使血栓溶解。但臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)它存在幾個(gè)明顯的不足，如血管再栓塞、顱內(nèi)出血及價(jià)格昂貴等。近年來(lái)通過(guò)對(duì)t-PA進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，已成功開(kāi)發(fā)出了一些新型t-PA突變體，它們?cè)谘娱L(zhǎng)體內(nèi)半衰期、增強(qiáng)對(duì)血纖維蛋白的選擇性和溶栓效力等方面均有較大改進(jìn)。
組織型纖溶酶原激活劑突變體Reteplase(r-PA)是經(jīng)基因工程改造的缺失突變體，它只有t-PA的K2區(qū)及P區(qū)，即只包含了天然t-PA的第1-3和176-527位氨基酸，共355個(gè)氨基酸，含有9對(duì)二硫鍵，而F區(qū)、E區(qū)和K1區(qū)缺失。K2區(qū)的存在使r-PA保存了t-PA的纖維蛋白特異性；缺失F區(qū)是使其血漿半衰期大大超過(guò)t-PA的關(guān)鍵。臨床上主要用于腦栓塞、心肌梗塞等血栓病的治療，其主要優(yōu)點(diǎn)是減少了血漿清除率，延長(zhǎng)了體內(nèi)半衰期，降低了出血性等副作用，被認(rèn)為是第三代安全、有效的溶栓藥物。
國(guó)外上市產(chǎn)品都是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得，大腸桿菌表達(dá)的r-PA為不溶性的包涵體，無(wú)活性。需通過(guò)體外變復(fù)性，獲得有活性的單鏈多肽。由于r-PA分子內(nèi)含有許多二硫鍵，很容易錯(cuò)配，因此給復(fù)性和純化帶來(lái)許多困難，導(dǎo)致最終得率小于1％。
我們對(duì)r-PA研究后作了點(diǎn)突變處理，得到了一種r-PA突變體(r-PAM)，并以畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)對(duì)此r-PAM進(jìn)行表達(dá)研究。表達(dá)蛋白屬于胞外分泌型，發(fā)酵上清可直接進(jìn)行純化，純化后，得到的高活性的r-PAM純品。因此純化方便，得率高，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低。這一點(diǎn)是大腸桿菌表達(dá)的r-PA無(wú)法相比的。
本發(fā)明提供了一種新型組織型纖溶酶原激活劑突變體Reteplase Mutant(r-PAM)及其生產(chǎn)方法，采用新型畢赤酵母表達(dá)體系分泌表達(dá)該新型組織型纖溶酶原激活劑突變體，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵與純化工藝，整個(gè)過(guò)程穩(wěn)定、快速、簡(jiǎn)便，獲得活性高的新型組織型纖溶酶原激活劑。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新型組織型纖溶酶原激活物突變體。
本發(fā)明的另一目的就是提供該新型組織型纖溶酶原激活物突變體的生產(chǎn)方法，包括用于該方法的表達(dá)載體及工程細(xì)胞。
在本發(fā)明的第一方面，就是提供了一種新型組織型纖溶酶原激活物突變體(r-PAM)的氨基酸序列，其特征在于，其序列為A-B-C-D-E，其中A為組織型纖溶酶原激活物突變體(r-PA)的第1-76位氨基酸，B為r-PA第77和78位氨基酸中至少一個(gè)突變?yōu)榉菈A性氨基酸，C為r-PA第79-125位氨基酸，D為r-PA第126和127位氨基酸中至少一個(gè)突變?yōu)榉菈A性氨基酸，E為r-PA第128-355位氨基酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區(qū)與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一優(yōu)選例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種表達(dá)載體，其特征在于，所述的表達(dá)載體含有上文所述的r-PAM編碼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是pPICZαA/r-PAM-1。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種工程細(xì)胞，其特征在于，它整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的工程細(xì)胞是畢赤酵母。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)重組新型組織型纖溶酶原激活物突變體的方法，該方法包括步驟c)在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，從而分泌表達(dá)出新型組織型纖溶酶原激活物突變體；d)分離純化新型組織型纖溶酶原激活物突變體。
圖1是重組質(zhì)粒pPICZαA/r-PAM-1構(gòu)建示意圖。
圖2r-PAM-1純化樣品非還原SDS-PAGE電泳圖譜。1.非還原樣品；M.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(從上到下分子量為97.4KD、66.2KD、43.0KD、31.0KD、20.1KD、14.4KD)。
圖3重組r-PAM-1的Western-blot分析。A.SDS-PAGE考馬氏蘭染膠；B.Western-blot印跡膜；1.r-PA標(biāo)準(zhǔn)品(大腸桿菌表達(dá))；2.r-PAM-1樣品還原電泳；3.陰性對(duì)照；4.r-PAM-1樣品非還原電泳。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人通過(guò)深入而廣泛的研究，通過(guò)PCR隨機(jī)突變r(jià)-PA cDNA，通過(guò)表達(dá)穩(wěn)定性研究，獲得了能在畢赤酵母細(xì)胞和其它酵母表達(dá)體系中穩(wěn)定高效分泌表達(dá)的新型組織型纖溶酶原激活物突變體編碼序列。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
對(duì)組織型纖溶酶原激活物突變體基因(r-PA)的cDNA序列進(jìn)行PCR隨機(jī)點(diǎn)突變，獲得r-PA突變體cDNA庫(kù)。將cDNA庫(kù)克隆到pPICZαA并轉(zhuǎn)染畢赤酵母，或其它酵母宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)后用纖維蛋白溶圈法，篩選到具有溶纖維蛋白活性的克隆。然后對(duì)篩選出的克隆施加不同濃度Zeocin，篩選抗Zeocin抗性最強(qiáng)克隆，進(jìn)行誘導(dǎo)篩選，得到高表達(dá)菌株。進(jìn)一步對(duì)高活性表達(dá)菌株進(jìn)行r-PA突變體cDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)其整合的序列編碼的氨基酸序列其第77，78位及126，127位氨基酸殘基部分或全部突變成非堿性氨基酸。為了盡可能減少氨基酸突變的數(shù)量，我們把第78、127位精氨酸突變成丙氨酸，再次轉(zhuǎn)染酵母，獲得一株高穩(wěn)定表達(dá)的工程細(xì)胞，該工程細(xì)胞的表達(dá)量比上述細(xì)胞株的高1倍以上。
在獲得工程細(xì)胞后，便可在適合的條件下培養(yǎng)工程細(xì)胞。在本發(fā)明中，工程細(xì)胞表達(dá)的新型組織型纖溶酶原激活物突變體發(fā)酵條件沒(méi)有特別限制。可以采用本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵條件。例如，合適的培養(yǎng)基包括(但不限于)以下組成(i)氮源含有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源，其中有機(jī)氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，總濃度0.1-3％；無(wú)機(jī)氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等銨鹽，濃度0-1.5％。
(ii)無(wú)機(jī)鹽包括磷酸鹽、枸鹽酸鹽、Mg2+鹽等。較佳地，磷酸鹽緩沖體系濃度20-200mM，pH5-8；Mg2+鹽0-5mM。
(iii)在培養(yǎng)基中添加維生素B1作為補(bǔ)充維生素，濃度1～1000PPM。
(iv)根據(jù)M9培養(yǎng)基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(v)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等?？梢允菃我惶荚?，也可以是混合碳源。較佳地，碳源選自下組甘油濃度為0.1-3％；乳糖濃度為0.1-3％；葡萄糖濃度為0.1-1.5％。
為大規(guī)模獲得新型組織型纖溶酶原激活物突變體，需要在發(fā)酵罐中進(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)。本發(fā)明研究了中試發(fā)酵工藝，優(yōu)化后的表達(dá)水平可達(dá)到500mg/L。
在發(fā)酵表達(dá)新型組織型纖溶酶原激活物突變體后，對(duì)表達(dá)的r-PAM進(jìn)行分離純化。
通常，發(fā)酵樣品先以離心、過(guò)濾等方式獲得發(fā)酵液上清，去除菌體。發(fā)酵液上清可通過(guò)鹽析、超濾等方法進(jìn)行初步純化后再進(jìn)行層析純化，也可直接進(jìn)行層析純化。
適用于本發(fā)明的層析技術(shù)包括疏水層析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、親和層析等。
經(jīng)過(guò)2-3步純化，可得到r-PAM純品，純化得率30％以上，純度95％以上，純品得率約150mg/L發(fā)酵上清液。
純化后r-PAM經(jīng)活性測(cè)定，其比活約為5×105IU/mg。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)例中，提供了組織型纖溶酶原激活物突變體基因點(diǎn)突變及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，通過(guò)篩選獲得了穩(wěn)定高效表達(dá)新型組織型纖溶酶原激活物突變體的菌株。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)例中，經(jīng)過(guò)純化工藝優(yōu)化，可得到純品150mg/L。
中試研究表明，產(chǎn)品制造工藝穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，周期短，成本低，每升發(fā)酵上清液可獲得新型組織型纖溶酶原激活物突變體純品150mg。適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)具有高穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)。對(duì)組織型纖溶酶原激活物突變體基因序列進(jìn)行了突變，并導(dǎo)入酵母表達(dá)載體pPICZαA，篩選得到高穩(wěn)定性表達(dá)的新型組織型纖溶酶原激活物突變體基因。
(2)通過(guò)控制關(guān)鍵的發(fā)酵工藝條件，使表達(dá)水平進(jìn)一步提高。
(3)純化工藝簡(jiǎn)便，回收率高。由于是分泌蛋白，因此簡(jiǎn)化了純化工序，使純化回收率大大提高，使大規(guī)模生產(chǎn)新型組織型纖溶酶原激活物突變體成為可能。
(4)采用畢赤酵母為工程細(xì)胞，很好地保持了組織型纖溶酶原激活物突變體的活性。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人的“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)”中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1基因突變及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建對(duì)組織型纖溶酶原激活物突變體基因(r-PA)的cDNA序列進(jìn)行PCR隨機(jī)點(diǎn)突變，獲得r-PA突變體cDNA庫(kù)。將cDNA庫(kù)克隆到pPICZαA并轉(zhuǎn)染畢赤酵母，或其它酵母宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)后用纖維蛋白溶圈法，篩選到具有溶纖維蛋白活性的克隆。然后對(duì)篩選出的克隆施加不同濃度Zeocin，篩選抗Zeocin抗性最強(qiáng)克隆，進(jìn)行誘導(dǎo)篩選，得到高表達(dá)菌株。
進(jìn)一步對(duì)高活性表達(dá)菌株進(jìn)行r-PA突變體cDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)其整合的序列編碼的氨基酸序列其第77，78位及126，127位氨基酸殘基部分或全部突變成非堿性氨基酸。為了盡可能減少氨基酸突變的數(shù)量，我們把第78、127位精氨酸突變成丙氨酸，得到一個(gè)cDNA序列。這個(gè)序列以及所表達(dá)的相應(yīng)蛋白，我們定名為rPAM-1。rPAM-1cDNA克隆到pPICZαA，再次轉(zhuǎn)染酵母，獲得一株高穩(wěn)定表達(dá)的工程細(xì)胞。該工程細(xì)胞的表達(dá)量比上述細(xì)胞株的高1倍以上。
重組質(zhì)粒構(gòu)建線路如圖1所示，將獲得的點(diǎn)突變過(guò)的組織型纖溶酶原激活物突變體rPAM-1cDNA用XhoI+NotI雙酶切處理，瓊脂糖凝膠電泳回收約1kb片段；同時(shí)將質(zhì)粒pPICZαA進(jìn)行同樣的雙酶切處理，回收大片段。將兩個(gè)片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α。小量制備質(zhì)粒，通過(guò)酶切鑒定的方法篩選出含rPAM-1cDNA的陽(yáng)性克隆。
實(shí)施例2高穩(wěn)定表達(dá)新型組織型纖溶酶原激活物突變體的菌株的篩選將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pPICZαA/rPAM-1大量制備，線性化，電穿孔轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞P.pastoris GS115，涂布含有不同濃度抗生素Zeocin的YPDS平板篩選高抗的陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行小搖表達(dá)實(shí)驗(yàn)，篩選得到高穩(wěn)定表達(dá)的工程酵母菌株，分析獲得的高穩(wěn)定表達(dá)的工程細(xì)胞，工程酵母菌株含有SEQ ID NO1序列，其編碼SEQ ID NO2序列。
實(shí)施例3純化工藝優(yōu)化對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，將發(fā)酵液的緩沖體系替換為磷酸鹽溶液(PB)。使用Millipore超濾器，超濾膜截流分子量為10KD，超濾時(shí)留取濃縮液，加入PB，繼續(xù)超濾；反復(fù)此程序，直至樣品的電導(dǎo)水平與pH和PB緩沖液相同。
層析1離子交換層析層析介質(zhì)SP-Sepharose FF方法將超濾后的含r-PAM發(fā)酵液過(guò)柱。上樣后用磷酸鹽緩沖液洗滌層析柱，至OD280＜0.05。用0-1M NaCl梯度將目的蛋白洗脫。
層析2分子篩層析層析介質(zhì)Sephacryl S200緩沖液磷酸鹽緩沖液離子交換得到的rPAM-1樣品峰上樣后，用PB溶液恒速過(guò)層析柱，收集含活性的蛋白峰。
樣品經(jīng)過(guò)此三步純化，即超濾，陰離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析以后，純度提高至95％以上，可得純品150mg/L。
rPAM-1純化后樣品非還原SDS-PAGE電泳圖譜見(jiàn)圖2。
采用大腸桿菌表達(dá)的r-PA做對(duì)照。用鼠抗重組人纖溶酶原激活劑一突變體抗體對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行Western-Blot免疫印跡試驗(yàn)，見(jiàn)圖3。結(jié)果表明r-PA對(duì)照品和rPAM-1都能被鼠抗重組人纖溶酶原激活劑一突變體抗體識(shí)別。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
序列表<110>上海新生源醫(yī)藥研究有限公司<120>新型組織型纖溶酶原激活物突變體及其生產(chǎn)方法<160>2<210>1<211>1068<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)…(1068)<223>新型組織型纖溶酶原激活物突變體序列<400>1tcttaccaag gaaacagtga ctgctacttt gggaatgggt cagcctaccg tggcacgcac 60agcctcaccg agtcgggtgc ctcctgcctc ccgtggaatt ccatgatcct gataggcaag 120gtttacacag cacagaaccc cagtgcccag gcactgggcc taggcaaaca taattactgc 180cggaatcctg atggggatgc caagccctgg tgccacgtgc tgaagaaccg cgccctgacg 240tgggagtact gtgatgtgcc ctcctgctcc acctgcggcc tgagacagta cagccagcct 300cagtttcgca tcaaaggagg gctcttcgcc gacatcgcct cccacccctg gcaggctgcc 360atctttgcca agcacagggc ttcgcccgga gagcggttcc tgtgcggggg catactcatc 420agctcctgct ggattctctc tgccgcccac tgcttccagg agaggtttcc gccccaccac 480ctgacggtga tcttgggcag aacataccgg gtggtccctg gcgaggagga gcagaaattt 540gaagtcgaaa aatacattgt ccataaggaa ttcgatgatg acacttacga caatgacatt 600gcgctgctgc agctgaaatc ggattcgtcc cgctgtgccc aggagagcag cgtggtccgc 660actgtgtgcc ttcccccggc ggacctgcag ctgccggact ggacggagtg tgagctctcc 720ggctacggca agcatgaggc cttgtctcct ttctattcgg agcggctgaa ggaggctcat 780gtcagactgt acccatccag ccgctgcaca tcacaacatt tacttaacag aacagtcacc 840gacaacatgc tgtgtgctgg agacactcgg agcggcgggc cccaggcaaa cttgcacgac 900gcctgccagg gcgattcggg aggccccctg gtgtgtctga acgatggccg catgactttg 960gtgggcatca tcagctgggg cctgggctgt ggacagaagg atgtcccggg tgtgtacacc 1020aaggttacca actacctaga ctggattcgt gacaacatgc gaccgtga 1068<210>2<211>355<212>PRT<213>智人
<400>2Ser Tyr Gln Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg1 510 15Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser20 25 30Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala35 40 45 50Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys55 60 65Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Ala Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp70 75 80 85Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe90 95 100Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala105 110 115Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Ala Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly120 125 130 135Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln140 145 150Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg155 160 165 170Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val175 180 185His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln190 195 200Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr205 210 215220Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu225 230 235
Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg240 245 250 255Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln260 265 270His Leu Leu Asn Arg Thr Vsl Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr275 280 285Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser290 295 300 305Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile310 315 320Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr325 330 335 340Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro345 350 35權(quán)利要求
1.一種編碼新型組織型纖溶酶原激活物突變體(r-PAM)的核苷酸序列，其特征在于，其編碼的氨基酸序列為A-B-C-D-E，其中，A為組織型纖溶酶原激活物突變體(r-PA)的第1-76位氨基酸；B為r-PA第77和78位氨基酸中至少一個(gè)突變?yōu)榉菈A性氨基酸；C為r-PA第79-126位氨基酸；D為r-PA第126和127位氨基酸中至少一個(gè)突變?yōu)榉菈A性氨基酸；E為r-PA第128-355位氨基酸。
2.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的核苷酸序列。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于，它是一種酵母表達(dá)載體。
4.一種工程細(xì)胞，其特征在于，它整合有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的工程細(xì)胞，其特征在于，它是畢赤酵母。
6.一種新型組織型纖溶酶原激活物突變體的生產(chǎn)方法，其特征在于，該方法包括步驟a)在適合的表達(dá)條件下，培養(yǎng)如權(quán)利要求5所述的工程細(xì)胞，從而分泌表達(dá)出新型組織型纖溶酶原激活物突變體；b)分離純化出表達(dá)的新型組織型纖溶酶原激活物突變體。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(a)所示的表達(dá)條件為誘導(dǎo)時(shí)間為12-120小時(shí)，較佳的為24-100小時(shí)；誘導(dǎo)pH為3-9，較佳的為5-7。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(b)所示的表達(dá)條件為(1).發(fā)酵液通過(guò)簡(jiǎn)單離心或超濾獲得含有目的蛋白的上清液；(2).通過(guò)簡(jiǎn)單的離子交換層析、分子篩層析等簡(jiǎn)單步驟，即可獲得純度在95％以上的純品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型組織型纖溶酶原激活物突變體，及穩(wěn)定生產(chǎn)該新型組織型纖溶酶原激活物突變體的方法，以及有關(guān)的表達(dá)載體與工程細(xì)胞構(gòu)建、表達(dá)和純化的工藝。突變后的組織型纖溶酶原激活物突變體基因在畢赤酵母中分泌表達(dá)非常穩(wěn)定，同時(shí)通過(guò)發(fā)酵與純化工藝優(yōu)化，提高了表達(dá)量和純化得率，具有穩(wěn)定性好、表達(dá)水平高、活性高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明可高效、簡(jiǎn)便、低成本的獲得新型組織型纖溶酶原激活物突變體純品。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1958798SQ200510030960
公開(kāi)日2007年5月9日 申請(qǐng)日期2005年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月2日
發(fā)明者孫九如, 任軍, 黃陽(yáng)濱, 張翊, 顧小偉, 黃智華, 蔣劍, 杜碧金 申請(qǐng)人:上海新生源醫(yī)藥研究有限公司