水稻葉片內卷基因及其應用的制作方法

專利名稱：水稻葉片內卷基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及植物學領域。具體而言，本發明涉及新的水稻葉片內卷基因OsRL及其應用。本發明還涉及使水稻葉片發生內卷從而提高水稻產量的方法。此外，本發明還涉及一種改良植物的方法。此外，利用葉片內卷性狀作為一種基因轉化植株后代的追蹤標記。此外，還可利用該基因的葉片內卷特性作為雜交制種過程中真雜種的指示標記。
背景技術：
水稻是主要的糧食作物之一，由于人口不斷增加而可耕地面積逐漸減少，高產和超高產是水稻育種和栽培永恒的主題。水稻株形是指在群體條件下，植株個體的莖、蘗、葉、穗、根在不同生育階段的整體形態特征及其變化動態。理想株形則是育種家建立的某種株形模式，在群體條件下植株一生的綜合形態始終處于最佳受光姿勢，在當地生態條件下充分利用光能，使生物學產量和經濟系數均達到較高水平。指由有利植株光合作用、生長發育和籽粒產量的性狀所組成的理想化株型，它能最大限度地提高群體光能利用率，增加生物學產量和提高經濟系數等。卷葉是水稻的1種葉片性狀，是理想株形的重要組成部分，其明顯效應是保持葉片直立而不披垂，改善水稻生長中后期群體基部的受光條件。
研究表明，在水稻株形形態指標中，葉片的形態性狀，特別是上部3片功能葉的形態性狀直接影響群體的葉面積指數和受光效率從而影響產量的高低。因此，葉片形態性狀一直是水稻遺傳育種家關注的焦點。葉片直立可以增加群體的光合效率，早在70年代，松島省三等提出“理想稻”概念，闡述了水稻葉片性狀，其中重要的一點即為“直立”；此外，眾多的株形研究也反復論述或驗證了葉片直立(較小的葉基角)的重要性。而葉片的長、寬都影響葉面積指數的大小，但過長過寬容易造成葉片披垂；在高產育種及株形改良中，在如何解決既能增加葉面積又避免葉片披垂的問題上，許多研究者注意到了水稻葉片內卷這一性狀，希望通過葉片適當內卷減輕葉片披垂。
在中國提出的超級雜交稻株形模式中，就設想超級雜交稻葉片性狀為上三張葉長50-70cm，葉片內卷；最新的高產株形研究成果關于葉片特點的描述也提出葉片卷曲的觀點葉片上舉、卷曲、直立、比葉重大，葉綠素含量高。有研究表明，葉片卷曲具有使葉片挺直、葉基角較小、葉綠素含量增加、葉面積指數增大、消光系數降低等有利于充分利用光能的效應。因此，這一性狀受到許多水稻遺傳育種工作者的關注，并廣泛開展工作，希望將此性狀引入水稻品種中，構建理想株形，實現水稻產量新的突破。

發明內容
本發明人通過T-DNA插入的方法克隆到一個未曾報道的水稻基因，即水稻OsRL基因，發現并證實控制水稻OsRL的表達可使水稻葉片發生內卷，水稻OsRL可作為一個元件用于水稻的分子育種，以獲得葉片適度內卷的水稻品種。此外，利用葉片內卷性狀作為一種基因轉化植株后代的追蹤標記。此外，還可利用該基因的葉片內卷特性作為雜交制種過程中真雜種的指示標記。
因此，本發明第一方面提供一種一種分離的OsRL蛋白，該蛋白含有具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的多肽或其保守性變異多肽。
本發明第二方面提供編碼本發明所述的OsRL蛋白的多核苷酸。
在另一個實施例中，所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的多肽和驅動該基因表達的上游啟動子區序列。
在另一實施例中，所述多核苷酸選自以下序列中的一種(a)SEQ ID NO1第1962-6088或第2001-6067位核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO2所示的序列；(c)具有SEQ ID NO1中第2001-2463、3290-4544和4639-6067位核苷酸的序列；以及它們的簡并異構體。
本發明又一方面涉及含有本發明所述的多核苷酸的載體以及含有該載體或基因組中整合有本發明多核苷酸的遺傳工程化的宿主細胞。
再一方面，本發明涉及一種使水稻葉片發生內卷的方法，該方法包括增加所述植物中OsRL基因或其同源基因的表達。
在一個實施例中，本發明通過插入T-DNA序列或用強啟動子驅動從而增強該OsRL基因或其同源基因的表達。
本發明還涉及一種改良水稻的方法，該方法包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有權利要求1所述的OsRL蛋白的DNA編碼序列；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使該OsRL蛋白DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入所述OsRL蛋白DNA編碼序列的植物細胞或組織；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織再生成植株。


圖1為在水稻內卷突變體中T-DNA插入OsRL基因啟動子區域的結構示意圖。
圖2顯示Ubi啟動子啟動OsRL基因轉化中花11獲得的過量表達植株。
圖3顯示突變體及轉基因水稻中OsRL基因表達的RT-PCR檢測。1-7分別為中花11、內卷突變體、過量轉化植株1(卷葉)、過量轉化植株2(正常葉)、過量轉化植株3(卷葉)、過量轉化植株4(卷葉)、過量轉化植株5(卷葉)。
圖4顯示OsRL基因的啟動子與GUS基因融合在水稻幼苗中的表達。
具體實施例方式
在本發明人檢測一個T-DNA插入的水稻群體時，發現一個單株出現葉片向內卷曲的突變體。該突變體在營養生長早期葉片內卷程度較低(卷曲度LRI為10-20)，后期葉片內卷程度增加(卷曲度LRI為30-50)。在開花期，突變體從上倒數第二葉片LRI最大(47.8)，旗葉次之(LRI為44.6)，倒數第三葉片最低(LRI為36.9)。而對照中花11的上部三葉的LRI值都為0。從上到下三片葉片，突變體的開花期葉片挺直度(LEI)分別為100.0、100.0、97.8，而對照中花11為98.7、97.3、97.1。在開花20天后，一般葉片都發生自然彎曲，但是突變體由于葉片向內卷曲，引起葉片挺直不披垂，使整個植株的株型直立。此時，突變體的旗葉挺直度沒有變化仍為100，下部兩葉的變化幅度也沒有對照中花11的大。另外，突變體的下部兩葉披垂度(DAL)小于對照中花11。本發明人利用T-DNA標簽法分離了該水稻葉片向內卷曲的OsRL基因。
因此，本發明第一方面涉及一種分離的OsRL蛋白(“OsRL”的全部英文名稱是Oryza sativa rolling leaf，水稻卷葉)。OsRL基因屬于Argonaute基因家屬，含有三個結構域Gly-rich.、PAZ、PIWI。水稻中Alignment(序列匹配)分析表明，PIWI結構域比較保守，而PAZ結構域有變化。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的OsRL蛋白或多肽”是指OsRL蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化OsRL蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括OsRL蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然OsRL蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據本文的定義這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發明中，術語“OsRL蛋白”指具有OsRL蛋白活性的SEQ ID NO3序列的多肽。該術語還包括具有與OsRL蛋白相同功能的、SEQ ID NO3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個、1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括OsRL蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與OsRL蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗OsRL蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含OsRL蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了OsRL蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有OsRL蛋白序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。
發明還提供OsRL蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然OsRL蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，“OsRL蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO3的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
本發明第二方面提供編碼本發明OsRL蛋白或其保守性變異多肽的多核苷酸序列。
本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO2所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO3的蛋白質，但與SEQ ID NO2所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO3的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO3所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼OsRL蛋白的多聚核苷酸。
應理解，雖然本發明的OsRL基因優選得自水稻，但是得自其它植物的與水稻OsRL基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本發明考慮的范圍之內。比對序列相同性的方法和工具也是本領域周知的，例如BLAST。
本發明的OsRL蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或OsRL蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的OsRL蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼OsRL蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，OsRL蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含OsRL蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法、水稻幼胚轉化法等。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規方法再生成植株，從而獲得葉片形狀發生改變的植物。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的OsRL蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進或對抗OsRL蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組OsRL蛋白篩選多肽庫可用于尋找有價值的能抑制或刺激OsRL蛋白功能的多肽分子。
本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析。用OsRL蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測OsRL蛋白的轉錄產物。
本發明第三方面涉及一種使水稻葉片發生內卷的方法，該方法包括增加所述植物中OsRL基因或其同源基因的表達。增加OsRL基因或其同源基因表達的方法是本領域周知的。例如。可通過插入T-DNA序列或用強啟動子驅動從而增強該OsRL基因或其同源基因的表達。或者通過增強子(如水稻waxy基因第一內含子、Actin基因第一內含子等)來增強該OsRL基因的表達。適用于本發明方法的強啟動子包括35s啟動子、水稻、玉米的Ubi啟動子等。
本發明第四方面涉及一種改良水稻的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有OsRL蛋白DNA編碼序列；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使該OsRL蛋白DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入所述OsRL蛋白DNA編碼序列的植物細胞或組織；和(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織再生成植株。可采用任何適當的手段，包括試劑、溫度、壓力條件等來實施此方法。
本發明測量葉片內卷性狀用到以下指標“卷曲度LRI”、“挺直度LEI”和“披垂度DAL”，它們分別按下式計算在開花期，葉片自然卷曲(指內卷)后，測定最寬處葉緣間距離(Ln)，然后把葉片展開測量其寬度(Lw)；在開花20天后，葉片發生自然彎曲，測定葉枕到葉尖的直線距離(LNL)及葉片挺直時的長度(LEL)，同時測定葉片自然彎曲后的葉片與莖的夾角(BAL)，葉枕到葉尖的連線與莖的夾角(AL)。
葉片卷曲度(Leaf rolling index，LRI)(％)＝(Lw-Ln)/Lw×100葉片挺直度(erecting index，LEI)＝LNL/LEL×100葉披垂度(drooping angle of leaf，DAL)＝AL-BAL此外，本發明還涉及利用葉片內卷性狀作為一種基因轉化植株后代的追蹤標記。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗指南(第二版)(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1995)或植物分子生物學-實驗手冊(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark編，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
II.實施例(A)材料與方法本發具體實施方式
中使用到以下的材料和方法。但應理解，可采用這些方法的其它合適替換形式來實施本發明。本發明范圍并不受到這些具體實施例的限制。
一.材料本發明使用的是粳稻“中花11”(Oryza sativa L.subsp.Japonica CVZhonghua No.11)進行研究。但應理解，也可使用其它種類進行研究。
二.水稻葉片總DNA簡易抽提法1.取2cm長的水稻幼嫩葉片，于1.5ml管中，加入200μl TPS抽提液，1ml tip將葉片搗碎。
2.搗碎的葉片放入75℃水浴中溫浴20min。
3.12000g×5min離心。
4.取120μl上清于0.5ml tube中加入120μl異丙醇室溫5min，12000g×10min離心。
5.去上清，加入120μl-300μl 70％乙醇洗滌，12000g×5min離心。
6.去上清，干燥沉淀，加入30μl水(TE)溶解，PCR時取0.8-1.0μl(10μl PCR體系)做模板。
試劑TPS100mM Tris-Cl(pH＝8.0)
10mM EDTA(pH＝8.0)1M KCl三.TAIL-PCRTAIL-PCR依照Liu等敘述的方法(見Plant Molecμlar Biology Reporter 16175-181，1998)。T-DNA左端嵌套引物序列是T-DNA-1CAAAATCCAGTACTAAAATCCAGA； (SEQ ID NO4)T-DNA-3ATTCGGCGTTAATTCAGTACA； (SEQ ID NO5)和T-DNA-5GTGTTATTAAGTTGTCTAAGC (SEQ ID NO6)。
這三個引物分別與5個隨機的簡并引物AD1-AD5當中的一個配對組合進行PCR，擴增T-DNA左端的旁臨序列。TAIL-PCR產物于1.5％的瓊脂糖凝膠上電泳進行分析。TAIL-PCR的產物直接送測序公司進行測序。
四.凍融法將質粒導入根癌農桿菌1.根癌農桿菌YEB(成分見分子克隆實驗指南)(無抗生素)固體平板挑單菌落。5ml YEB液體培養基28℃ 200rpm培養過夜。按1％接種量轉入50mlYEB(500μl菌液加入)，28℃ 200rpm培養3-4小時至細菌對數期。
2.4℃5000g離心10min，沉淀用5ml預冷的TE(Ph7.5)洗滌一次，加入5ml YEB液體(含10～15％甘油)重新懸浮。分裝成200μl一管，液氮速凍后，于-70度保存。
3.取200μl菌液+0.5-1.0ug質粒(＜10μl)混勻，依次在冰上、液氮、37℃水浴各放置5min，用YEB稀釋至1ml后，于28℃振搖培養2-4hr。
4.取200μl菌液涂布于含相應抗生素的YEB培養基平板上，28℃2-3天。
5.挑單菌落，重新在相應抗生素的YEB培養基平板上劃單菌落兩次。
五.水稻材料的培養A.愈傷組織的誘導取授粉后12-15天的水稻未成熟種子經70％乙醇浸泡1分鐘后，于2％的NaClO溶液中(加2-3滴吐溫20)消毒60分鐘以上，用無菌水沖洗4-5次，然后用解剖刀和攝子挑出幼胚并接種于N6D2培養基上誘導愈傷組織，在26±1℃、避光條件下培育，4天后可用于轉化。
B.農桿菌的培養和懸浮從YEB平板上挑取單菌落農桿菌接種到3ml含50mg/L卡那霉素(Km)的YEB液體培養基中于28℃振搖培養過夜，第2天按1％接種量轉接入50ml含Km 50mg/L的AB液體培養基中，200rpm繼續振搖培養至OD600為0.8左右時，將新鮮的農桿菌菌液于6000g4℃離心5分鐘，收集并重懸于1/3體積的AAM液體培養基中，此時即可用于轉化水稻各種受體材料。
C. 感染和共培養于6cm培養皿中將各種水稻受體材料浸泡入新鮮的AAM農桿菌菌液中并不時搖動，20分鐘后將水稻材料移出，在無菌濾紙上吸去過多的菌液，隨即轉移到N6D2C培養基上，于26℃共培養3天。在轉化材料轉入前，事先在N6D2C培養基上鋪一層無菌濾紙，并用少量新鮮AAM液體培養基濕潤。共培養3天后，從共培養培養基上取出轉化材料，用無菌濾紙吸干菌液和水分，然后轉入選擇培養基進行篩選培養。
D.愈傷組織的篩選、分化與移栽預培養4天的幼胚與農桿菌共培養后，切去胚芽并轉入選擇培養基N6D2S1進行選擇培養，2周后從幼胚盾片處長出的愈傷組織分成小塊轉到N6D2S2選擇培養基上繼續篩選2代(2周/代)，6周后生長旺盛的抗性愈傷組織轉移到再生培養基MSRCH上分化(12小時光照/天)；再生的小苗在1/2MSENH上生根壯苗，隨后移入網室或人工氣候室盆土栽培。
試劑各基礎培養基大量鹽份(20x)g/L

*獨立溶解后加入。
各基礎培養基微量鹽份(100x)mg/L

1.N6D2培養基1)1X大量鹽份；2)1X微量鹽份3)鐵鹽FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；4)維生素甘氨酸2mg/L；維生素B1(VB1) 1mg/L；維生素B6(VB6)0.5mg/L；煙酸0.5mg/L；肌醇100mg/L5)0.5g/L酪蛋白水解物(LH)，30g/L蔗糖，2mg/L 2，4-D，2.5g/Lphytagel(Sigma公司)，pH5.8。
2.AB液體培養基K2HPO43g/L；Na2H2PO41g/L；NH4Cl 1g/L；MgSO4·7H2O 300mg/L；KCl 150mg/L；CaCl210mg/L；FeSO4·7H2O 2.5mg/L；葡萄糖5g/L，pH7.0。
3.AAM液體培養基1)1X AA大量鹽分；1X AA微量鹽分；2)氨基酸L-Gln 880mg/L；L-Asp 270mg/L；L-Arg 230mg/L；L-Gly 80mg/L3)維生素甘氨酸2mg/L；維生素B1(VB1) 1mg/L；維生素B6(VB6)0.5mg/L；煙酸0.5mg/L；肌醇100mg/L4)0.5g/L酪蛋白水解物(LH)，36g/L葡萄糖，68.5g/L蔗糖，PH5.24.N6D2CN6D2，葡萄糖10g/L，乙酰丁香酮20mg/L(56℃加入)。
5.N6D2S1
N6D2，25mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，300mg/L頭孢霉素。
6.N6D2S2N6D2，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，300mg/L頭孢霉素。
7.MSRCH1)1X MS大量鹽分，1X MS微量鹽分，2)鐵鹽FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；3)維生素甘氨酸2mg/L；維生素B1(VB1)1mg/L；維生素B6(VB6)0.5mg/L；煙酸0.5mg/L；肌醇100mg/L4)6-芐基氨基嘌呤(6BA)2mg/L，荼乙酸(NAA)0.2mg/L，玉米素(Zeatin)05mg/L，激動素(KT)0.5mg/L，5)蔗糖30g/L，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，phytagel(Sigma公司)2.5g/L，pH5.88.1/2MSENH1)1/2 X MS大量鹽分；1/2 X MS微量鹽分，2)鐵鹽FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；3)維生素甘氨酸2mg/L；維生素B1(VB1)1mg/L；維生素B6(VB6)0.5mg/L；煙酸0.5mg/L；肌醇100mg/L4)多效唑(MET)1mg/l；荼乙酸(NAA)0.5mg/l5)30g/L蔗糖，50mg/L潮霉素(HYGROMYCIN)，2.0g/L PHYTAGEL(Sigma公司)，PH5.8六.植物組織提取RNA1.先將水稻幼苗在液氮中研磨成粉。將粉末分裝到離心管中，每管分裝100mg左右。每管加入1ml TRIZOL試劑(Invitrigen公司)，混勻，室溫放置5min。加入氯仿200μl，用力振蕩15sec，室溫孵育2～3min。
2.4℃下離心(12000×g，15min)，混合物分為紅色的酚-氯仿相(下相)、白色的中間相以及無色的上層水相。RNA在上層水相中。
3.轉移上層水相(500μl)到一個新的Eppendorf管中，加入1ml無水乙醇，以沉淀RNA。
4.室溫孵育10min以上，4℃條件下離心(12000×g，10min)，可見白色的RNA沉淀貼于管底壁。
5.吸棄上清，用70％的乙醇洗滌RNA沉淀一次，4℃條件下離心(7500×g，5min)6.吸棄上清，空氣中自然干燥，用DEPC水溶解沉淀，-70℃保存備用。用紫外分光光度計測定RNA濃度及存度，A260/A280＞1.8。
七.RT-PCR按照Promega廠商所建議的條件進行實驗。
試劑反轉錄試劑盒Reverse Transcription System(Cat.#A3500)(Promega廠商)，DNase(無RNase)(Promega廠商)，DEPC(華舜生物工程有限公司)八.5’race和3’race實驗按照Roche廠商所建議的條件進行實驗。
試劑RACE Kit(Cat.#3353621)(Roche廠商)九.GUS染色試劑GUS染液0.5mg/ml X-Gluc(Duchefa公司)，50mM KHPO4(pH 7)，0.5mMK3Fe(CN)6，0.5mM K4Fe(CN)6，20％(v/v)甲醇，0.1％(v/v)Triton-X100(華舜生物工程有限公司)。
步驟1.轉入GUS染液中，500mmHg真空抽氣。
2.37℃染色過夜。
3.95％乙醇脫色后觀察。
此外，Southern雜交和植物總DNA提取方法(CTAB法)均按照《分子克隆實驗指南》(Sambrook等人，第二版，New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1995)中所述的方法進行。
(B)具體實施例實施例1OsRL突變體植株的獲得T-DNA標簽分離基因仍然是植物功能基因研究的最重要手段之一。T-DNA(transfer DNA)是位于根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti(tumorinducing)質粒或發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)Ri(root inducing)質粒上的一段DNA，它可以從農桿菌中轉移并穩定的整合到植物染色體上，因此可作為一類外源基因載體，將外源DNA轉移到植物細胞，并再生出能夠表達外源基因的轉基因植物；也可能使插入位點基因的表達受到影響，從而產生可篩選的突變表型，由于T-DNA序列已知，一旦遺傳分析確定突變表型與插入的標簽連鎖，即可通過IPCR或TAIL-PCR方法獲得標簽兩端的側翼序列，然后將側翼序列與基因組序列相比較獲得突變基因的信息。由于農桿菌轉化異源宿主單子葉植物水稻非常有效，利用T-DNA建立各類突變體庫是目前了解水稻整個功能基因組最廣泛采用的方法。在我們構建的T-DNA轉化群體中，發現一個水稻葉片向內卷曲的突變體。葉片向內卷曲突變體的遺傳學分析表明，葉片向內卷曲為顯性基因控制，T2群體中葉片內卷植株葉片正常植株的分離比為3∶1，并且葉片與T-DNA整合為完全連鎖分離。分別用HindIII和BamHI酶切內卷突變體的基因組總DNA，Southern Blot分析T-DNA插入的拷貝數實驗表明，T-DNA為單拷貝插入。本發明人利用T-DNA標簽法分離了該水稻葉片向內卷曲的基因。
實施例2OsRL突變體植株的形態學觀察本發明人發現的一個葉片向內卷曲的突變體，在營養生長早期葉片內卷程度較低(卷曲度LRI為10-20)，后期葉片內卷程度增加(卷曲度LRI為30-50)。在開花期，突變體從上倒數第二葉片LRI最大(47.8)，旗葉次之(LRI為44.6)，倒數第三葉片最低(LRI為36.9)。而對照中花11的上部三葉的LRI值都為0。從上到下三片葉片，突變體的開花期葉片挺直度(LEI)分別為100.0、100.0、97.8，而對照中花11為98.7、97.3、97.1。在開花20天后，一般葉片都發生自然彎曲，但是突變體由于葉片向內卷曲，引起葉片挺直不披垂，使整個植株的株型直立。此時，突變體的旗葉挺直度沒有變化仍為100，下部兩葉的變化幅度也沒有對照中花11的大。另外，突變體的下部兩葉披垂度(DAL)小于對照中花11。
實施例3OsRL基因的克隆葉片向內卷曲突變體的遺傳學分析表明，葉片向內卷曲為顯性基因控制，T2群體中葉片內卷植株∶正常葉片植株的分離比為3∶1，并且葉片內卷性狀與T-DNA整合為完全連鎖分離。分別用HindIII和BamHI酶切內卷突變體的基因組總DNA，Southern Blot分析T-DNA插入的拷貝數實驗表明，T-DNA為單拷貝插入。用Tail-PCR分離T-DNA插入位點的旁鄰序列表明，T-DNA插入在水稻第三染色體上，并且位于OsRL基因位點的啟動子區域，離起始密碼子ATG有320bp。見圖1。以這個旁鄰序列分析出T-DNA插入的水稻染色體位點，從水稻BAC克隆OSJNBa0034E08(得自國際水稻基因組測序計劃研究組織)中通過XhoI和SalI雙酶切分離出整個OsRL基因，通過測序得到SEQ ID NO1。利用水稻抽提的總RNA，以RT-PCR分段分離出OsRL基因的mRNA片段并測序，整合出OsRL基因的編碼序列SEQ ID NO2。根據水稻通用密碼子編碼規律，及OsRL基因的編碼序列SEQ ID NO2推導出OsRL蛋白的序列。
實施例4OsRL基因的序列分析利用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/網頁中“Align two sequences(b12seq)”和“Protein-protein BLAST(blastp)”分析工具對OsRL基因的序列進行分析。分析結果如下SEQ ID NO1顯示，OsRL基因組序列中，1-2000區域為啟動子，2001-2003位為起始密碼子ATG，6065-6067位為終止密碼子TAG，2001-2463、3290-4544、4639-6067為外顯子，2464-3289、4545-4638為內顯子。
SEQ ID NO2顯示，OsRL基因mRNA的編碼序列中第1-3位為起始密碼子ATG，3145-3147位為終止密碼子TAG。
SEQ ID NO3顯示，OsRL蛋白質編碼序列中17-47位為富含Gly的結構域，423-553位為PAZ結構域，708-1017位為PIWI結構域，其中PIWI比PAZ更保守。
實施例5OsRL基因的過量表達導致水稻的內卷利用分離的OsRL基因克隆，將SEQ ID NO1中1962-6088區域，包含了整個OsRL基因的編碼序列，接在玉米的Ubiquitin基因的強啟動子下，通過水稻轉化方法導入對照中花11材料中，結果發現獲得的55株當代過量表達的植株，有90％的轉化植株出現內卷現象，3個株系的后代種于大田，內卷性狀與Ubipro::RL整合完全連鎖分離(見圖2)。另外，OsRL基因表達的RT-PCR分析結果表明內卷突變體OsRL基因的表達比對照中花11強；在過量表達的轉化植株中OsRL基因的表達比內卷突變體強，葉片內卷的程度也比原來的內卷突變體更明顯(見圖3)。OsRL基因的啟動子與GUS基因融合在中花11中的表達實驗表明OsRL基因在幼苗中，葉片、葉鞘、特別是葉枕處有較強的表達(見圖4)。
上述實驗，進一步說明本發明人分離的OsRL基因能夠控制水稻葉片的內卷現象。
序列表<110>中國科學院上海生命科學研究院上海市農業科學院<120>水稻葉片內卷基因及其應用<130>054994<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>6200<212>DNA<213>粳稻“中花11”(Oryza sativa L.subsp.Japonica CV Zhonghua No.11)<400>1atcacctccc atttaaattt atctctattc aatccccaag taccactcca cttcagcact 60cctaaacata catcatttaa taggaggcac tacaattttt ttaaaatcgt aatttatact120aaactatcta gaacaataag tattttagaa tggagtactc atttttgaga ccaaagcaag180gcaatactta agggtttcat tgcagttagt accagtttac taccctaacg acacccacaa240tgtaggctca ggggtgtaaa gttttggtgt gtcacatcaa atatacggac acatatttga300agtattaaac gtagtctaac aaaacaaatt acagaatccg cctgcaaacc gcgagatgaa360tttattaagc ctaattaatc cgtcattaga aaatgtttac tgtagcacca cattgtcaaa420tcatggcgta attaggctta aaagattcgt ctcgcaattt acacgcaata tgtgtaatta480gttatttttt cgtttatatt taatattcta tgcatgtgtc caaacattcg atgtgacagt540gtgtaaaatt ttgtcggagg atctaaacag gccagtagta taaaactagt ccataagcaa600tacaatattt cattcagcca cctaataata ttgtggaact agtcaatagc aaggaaatag660caaaagccac ccataagcat atgggttgcc tatacagaat aaaatatgtt actatttttc720tttactagct ctctcctcgt aatattactt gctatctagg gtgtgtttag ttcacgtcaa780aattggaagt ttggttgaaa ttggatagat gtgatggaaa aattggaagt ttgtgtgtgt840agaaaagttt tgatgtgatg gaaaagctaa aagtttgaag aaaaagtttg gaactgaact900cggccctact tcctccgtcc taaaaaaatc caaaactggg tttgaatctg gacatgcact960gtgtccagat ttaaacccag gattgatttt tttcagatgg agggagtata tatattgtga 1020atattacaat aattaaaacc aatatatata tgggtcctac ctatacgtat tactcactcc 1080gtctcataat ataaaggatt ttaagttttt gcttacactg tttgaccact cgtcttattc 1140aaaaaatttt ggatttatta tttatttttt tacttacttt attatccaaa gtactttaag 1200cacaactttt cgttttttat atttgcacaa attttttaaa taagacgagt ggtcaaataa 1260taaaaaaaaa cttacaattg agacggaggg agtacttttg ctatatatat atatatatat 1320atatatatat atatatatat atatatatat tgtgagaggg agggagagag ggaacagagg 1380aaggcaccaa agaaagaggt gggggtagag ccgcagagag agcctctctt aactgcagcc 1440ataaattatc cacccttgcc acattgagaa tttcggaaca cggtgcagga gggcagcagc 1500agaagcagca gaatggagga aactttttaa agcagaagca gcgaggatgg atagcgttgc 1560atcgcacgct tattactact ctctgcttcc aagttgttgc aatgcaaaca gacccgtccc 1620ctttggctcc cttccccacc ttcccttcct tgcgcgcgca cacagcatat gaacagatgc 1680gctctctctc tctctctctc tgcttcctga ctgtgcctgt gtctgccact cccattaata 1740ccaaccccat ctcgctccca cttcagtcca cactcaagta gtactactac tccattccgc 1800
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Val Ser Leu Pro Leu Pro Leu Pro Pro Pro Val Leu Leu Tyr Leu Gln85 90 95Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Leu Pro Leu Leu Pro Lvs Val Ala Ala100 105 110Ala Thr Phe Tyr Gly Lys Pro Pro Lys Ala Ala Asp Ala Ala Pro Arg115 120 125Gly Ser Met Trp Lys His Arg Pro Ser Lys Lys Pro Pro Pro His Ala130 135 140Ile Thr Ala Ala Leu Leu Pro Leu Pro Arg Asp Gly Lys Ala Leu Gln145 150 155 160Glu Lys Ile Phe Phe Ala Asn Glu Arg Lys Thr Ser Glu Lys Glu Val165 170 175Asn His Val Asp Thr His Glu Lys Phe Thr Val Ala Pro Leu Asp Asn180 185 190Ala Ile Ala Arg Arg Pro Asp Met Gly Gly Val Glu Gly Ala Glu Ile195 200 205Pro Leu Ser Ala Asn His Phe Leu Val Gln Phe Asp Pro Gly Gln Lys210 215 220Ile Phe His Tyr Asn Val Asp Ile Ser Pro Arg Pro Ser Lys Glu Thr225 230 235 240Ala Arg Met Ile Lys Lys Lys Leu Val Glu Glu Asn Pro Ser Val Leu245 250 255Ser Gly Ser Gln Pro Ala Phe Asp Gly Arg Lys Asn Leu Tyr Ser Pro260 265 270Val Arg Phe Gln Glu Asp Arg Val Glu Phe Phe Val Ser Leu Pro Val275 280 285Ala Leu Ala Arg Cys Ser Val Val Lys Glu Asp Thr Gly His Met Leu290295 300Asp Lys Gln Lys Leu Lys Thr Phe Lys Val Asn Val Arg Leu Val Ser305 310 315 320Lys Leu Cys Gly Glu Asp Leu Asn Lys Tyr Leu Asn Glu Asp Lys Asp325 330 335Gly Ile Pro Leu Pro Gln Asp Tyr Leu His Ala Leu Asp Val Val Leu340 345 350Arg Glu Gly Ala Met Glu Ser Ser Ile Leu Val Gly Arg Ser Leu Tyr355 360 365Ala Arg Ser Met Gly Glu Ala Arg Asp Ile Gly Gly Gly Ala Val Gly370 375 380Leu Arg Gly Phe Phe Gln Arg Leu Arg Pro Thr Lys Gln Gly Leu Ala385 390 395 400Leu Asn Val Asp Leu Ser Leu Ser Ala Phe His Glu Ser Thr Gly Ile405 410 415Ile Ser Tyr Leu Gln Lys Arg Cys Asp Phe Leu Lys Asp Leu Pro Gln420 425 430Lys Lys Thr Arg Ala Leu Ala Glu Glu Glu His Arg Glu Val Glu Lys435 440 445Ala Leu Lys Asn Ile Arg Val Phe Val Cys His Arg Glu Thr Asn Gln450 455 460Arg Tyr His Val His Ser Leu Thr Lys Glu Thr Thr Glu Asn Leu Lys465 470 475 480Phe Arg Asp Arg Ser Gly Lys Asp Leu Met Val Val Asp Tyr Phe Lys
485 490 495Glu His Tyr Asn His Asp Ile Gln Phe Arg Asn Leu Pro Cys Leu Gln500 505 510Ile Gly Arg Ser Lys Pro Cys Tyr Val Pro Met Glu Leu Cys Val Val515 520 525Cys Glu Gly Gln Lys Phe Leu Gly Lys Leu Ser Asp Glu Gln Thr Ser530 535 540Lys Ile Leu Lys Met Gly Cys Glu Arg Pro Ser Glu Arg Lys Gly Ile545 550 555 560Ile Lys Gly Val Val Lys Gly Ala Phe His Ala Arg Ser Asp Thr Tyr565 570 575Ala Asp Gln Phe Ser Leu Gln Val Ser Lys His Met Thr Lys Leu Ser580 585 590Gly Arg Val Leu Leu Pro Pro Lys Leu Lys Leu Gly Ser Ser Gly Arg595 600 605Ile Lys Asp Ile Thr Pro Asp Arg Phe Asp Arg Gln Trp Ser Phe Leu610 615 620Asp Ser His Val Ala Glu Gly Ser Lys Ile Lys Ser Trp Ala Leu Ile625 630 635 640Ser Phe Gly Gly Thr Pro Glu Gln His Phe Cys Ile Thr Lys Phe Val645 650 655Asn Gln Leu Ser Asn Arg Cys Glu Gln Leu Gly Ile Leu Leu Asn Lys660 665 670Lys Thr Ile Ile Ser Pro Ile Phe Glu Arg Ile Gln Leu Leu Asn Asn675 680 685Val Gly Ile Leu Glu Gly Lys Leu Lys Lys Ile Gln Glu Ala Ala Ser690 695 700Gly Asn Leu Gln Leu Leu Ile Cys Val Met Glu Arg Arg His Gln Gly705 710 715 720Tyr Ala Asp Leu Lys Arg Ile Ala Glu Thr Ser Ile Gly Val Val Thr725 730 735Gln Cys Cys Leu Tyr Ser Asn Leu Ser Lys Leu Thr Ser Gln Phe Leu740 745 750Thr Asn Leu Ala Leu Lys Ile Asn Ala Lys Leu Gly Gly Cys Asn Ile755 760 765Ala Leu Tyr Ser Ser Phe Pro Cys Gln Ile Pro Arg Ile Phe Leu Ser770 775 780Glu Glu Pro Val Met Phe Met Gly Ala Asp Val Thr His Pro His Pro785 790 795 800Leu Asp Asp Ser Ser Pro Ser Val Val Ala Val Val Ala Ser Met Asn805 810 815Trp Pro Ser Ala Asn Lys Tyr Ile Ser Arg Met Arg Ser Gln Thr His820 825 830Arg Lys Glu Ile Ile Glu Gln Leu Asp Val Met Ala Gly Glu Leu Leu835 840 845Glu Glu Phe Leu Lys Glu Val Gly Lys Leu Pro Ser Arg Ile Ile Phe850 855 860Phe Arg Asp Gly Val Ser Glu Thr Gln Phe Tyr Lys Val Leu Lys Glu865 870 875 880Glu Met His Ala Val Arg Thr Thr Cys Ser Arg Tyr Pro Gly Tyr Lys885 890 895
Pro Leu Ile Thr Phe Ile Val Val Gln Lys Arg His His Thr Arg Leu900 905 910Phe His Arg Glu Arg Asn Gly Ser Ser Ser His Tyr Ser Asp Gln Asn915 920 925Ile Pro Pro Gly Thr Val Val Asp Thr Val Ile Thr His Pro Arg Glu930 935 940Phe Asp Phe Tyr Leu Cys Ser His Trp Gly Thr Lys Gly Thr Ser Arg945 950 955 960Pro Thr His Tyr His Val Leu Trp Asp Glu Asn Asn Phe Arg Ser Asp965 970 975Glu Val Gln Gln Leu Ile His Asn Leu Cys Tyr Thr Phe Ala Arg Cys980 985 990Thr Arg Pro Val Ser Leu Val Pro Pro Ala Tyr Tyr Ala His Leu Ala995 10001005Ala Tyr Arg Gly Arg Leu Tyr Leu Glu Arg Ser Asp Thr Thr Met101010151020Tyr Arg Val Ser Pro Leu Gln Thr Val Pro Leu Pro Lys Leu Arg102510301035Asp Asn Val Lys Arg Leu Met Phe Tyr Cys10401045<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>引物<400>6gtgttattaa gttgtctaag c
權利要求
1.一種分離的OsRL蛋白，其特征在于，它含有具有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽。
2.一種分離的多核苷酸，其特征在于，該核苷酸序列編碼權利要求1所述的OsRL蛋白。
3.如權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQID NO3所示氨基酸序列的多肽和驅動該基因表達的上游啟動子區序列。
4.如權利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自以下序列中的一種(a)SEQ ID NO1第1962-6088或第2001-6067位核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO2所示的序列；(c)具有SEQ ID NO1中第2001-2463、3290-4544和4639-6067位核苷酸的序列。
5.一種載體，其特征在于，它含有權利要求2所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體或基因組中整合有權利要求2所述的多核苷酸。
7.一種使水稻葉片發生內卷的方法，其特征在于，該方法包括增加所述植物中OsRL基因或其同源基因的表達。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，通過插入T-DNA序列或用強啟動子驅動從而增強該OsRL基因或其同源基因的表達。
9.一種改良水稻的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有權利要求1所述的OsRL蛋白的DNA編碼序列；(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使該OsRL蛋白DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入所述OsRL蛋白DNA編碼序列的植物細胞或組織；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織再生成植株。
全文摘要
本發明涉及新的水稻葉片內卷基因OsRL及其應用。本發明還涉及使水稻葉片發生內卷從而提高水稻產量的方法。此外，本發明還涉及一種改良植物的方法。采用本發明方法可使得水稻葉片內卷，增加葉片的挺直度從而增加葉片受光面積、使中下層葉片能受到較多的光照。此外，在密植狀態下通過使葉片內卷也可改善群體的通風透光性，減少發病機會。此外，還可利用葉片內卷性狀作為一種基因轉化植株后代的追蹤標記。此外，還可利用該基因的葉片內卷特性作為雜交制種過程中真雜種的指示標記。
文檔編號C12N15/63GK1951960SQ20051003064
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月19日 優先權日2005年10月19日
發明者張景六, 王江, 時振英, 沈革志, 王新其 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 上海市農業科學院