專利名稱：一種羧肽酶b的制備方法及其組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及酶學、含有酶的組合物及分離或純化方法技術領域，具體涉及一種羧肽酶B的制備方法及其組合物。
背景技術：
羧肽酶B(carboxypeptidase B，簡稱CPB，EC3.4.17.2)是一種含鋅的胰外肽酶，特異性水解肽鏈C末端的堿性氨基酸精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。羧肽酶B含307個氨基酸殘基，分子量35KDa。豬胰臟中存在的羧肽酶B是由前羧肽酶原B(preprocarboxypeptidase B)產生的。前羧肽酶原B的N末端包含108個氨基酸的片斷(其中13個氨基酸為信號肽序列、95個氨基酸殘基組成活性肽部分)與C末端的羧肽酶B相連，前羧肽酶原B在轉運到內質網的過程中，信號肽被剪切得到不具有活性的羧肽酶原B(procarboxypeptidase B)從細胞中分泌出來，然后通過胰蛋白酶酶解為具有活性的羧肽酶B和活性肽部分。
羧肽酶B廣泛用于蛋白質及肽類C末端氨基酸測序，或用于蛋白質或多肽的C末端堿性氨基酸殘基的修飾。在醫學上用于診斷胰腺炎。目前在基因工程領域獲得了越來越廣泛的應用，特別在重組人胰島素的生產過程中，羧肽酶B為不可或缺的雙酶之一，其比活性的高低及穩定性是影響胰島素原活化收率的一個重要參數〖周穎、楊樺、肖尚志、喬德水，羧肽酶B的穩定性考察，中國生化藥物雜志，2002，23(4)185-186〗。
現有的從動物胰臟提取羧肽酶B的生產方法是動物胰臟勻漿激活、分級鹽析、透析、離子交換層析，再鹽析、透析，最后加鹽凍存，其中鹽析和透析周期長，效率低；而且離子交換層析通常經過三步，回收率大為降低。文獻報道了采用勻漿、硫酸銨鹽析的方法進行初步提取，然后采用疏水層析、離子交換層析的方法進行純化，顯著提高了羧肽酶B的活力及得率〖王偉剛、曹雪梅、溫傳彬、戴素霞、楊樺、孔毅，從豬胰臟中提取及純化羧肽酶B工藝改進，武漢工業學院學報，2002，(2)P16-17、21〗。但是該方法由于是在勻漿后進行鹽析操作，勻漿液中存在的脂類不利于后續的抽提操作，羧肽酶B的得率較低，而且鹽析后活性羧肽酶B存在于清液中不利于長期保存，必須立即進行后續單元操作。
現有技術中羧肽酶B在離子交換層析后，加鹽濃縮凍存，其穩定性差，保存時間僅為2月。
發明內容
為了克服羧肽酶B制備方法的現有技術中存在的缺陷，發明人進行了廣泛而深入的研究。發明人比較了多種羧肽酶B的抽提方法及其純化工藝，通過使用丙酮破碎胰臟、制備丙酮粉的方法成功解決了上述技術缺陷，發明人對丙酮抽提方法進行了廣泛研究。
為了克服現有技術中羧肽酶B制劑不穩定的缺陷，發明人進行了廣泛研究。
基于上述研究，本發明所要解決的技術問題之一是提供一種羧肽酶B的制備方法，以克服現有技術中存在的羧肽酶B得率低的技術缺陷。
本發明所要解決的技術問題之二是提供一種穩定的羧肽酶B組合物以克服現有技術中羧肽酶B穩定性差的技術缺陷。
為解決上述羧肽酶B制備方法中存在的技術問題，發明人采取的技術方案是用丙酮抽提胰臟羧肽酶B，制備包含羧肽酶B的丙酮粉。然后采用疏水層析、離子交換層析純化羧肽酶B，本發明的技術路線如圖1。
其中，丙酮粉的制備方法是將胰臟用1～5倍量丙酮處理2～3次，制成丙酮粉。胰臟是新鮮的胰臟或者凍胰臟，胰臟用機械方法粉碎。優選地，選用凍胰臟用機械方法粉碎后，加1～5倍量預冷的丙酮處理2～3次。更優選地，凍胰臟機械粉碎后自溶16～24hr，加1～5倍量預冷的丙酮處理2～3次。每次用丙酮處理后收集濾渣，收集濾渣的方法在本領域是已知的，例如離心收集濾渣或者過濾收集濾渣。最后收集的濾渣干燥后即得丙酮粉。濾渣干燥的方法在本領域是已知的，如自然風干等。
優選地，制備包含羧肽酶B的丙酮粉的方法是將凍胰臟機械粉碎，用1～5倍量的預冷丙酮處理2～3次，收集最后濾渣后用1～5倍量丙酮/乙醚混合液(體積比1∶1)處理，收集濾渣干燥后獲得丙酮粉。更優選地，上述濾渣再用1～5倍量乙醚處理，收集濾渣干燥獲得丙酮粉。
上述所說的“1～5倍量”的含義是每g胰臟1～5ml丙酮或其它溶液，在下文中如沒有特別說明，凡提到“倍量”均為該含義。
在本發明羧肽酶B的制備方法中，丙酮粉加水攪拌后，用Tris-HCl緩沖液或者氫氧化鈉調節pH至7.0-8.0，攪拌抽提1～4hr，抽提液過濾或離心，每升清液中加入180～220g硫酸銨鹽析。該鹽析技術在本領域是公知的。鹽析液過濾或離心，清液經疏水層析和離子交換層析獲得純化的羧肽酶B。疏水層析介質可以選用本領域常用的苯基、C8或C4基瓊脂糖凝膠，如Butyl Sepharose 4Fast Flow、Octyl Sepharose 4 Fast Flow和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow等(GE Healthcare，Amersham Biosciences)或者FractogelEMD Phenyl(北京金歐亞科技發展有限公司)，按照廠家提供的說明書自己裝柱，或者選用預裝柱如HiLoadTMPhenyl Sepharose HP Columns或HiPrepTM或HiTrapTM等，疏水層析的操作按照廠家提供的說明書進行。疏水介質的平衡緩沖液為含有1.5M硫酸銨的20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.5，優選地pH7.0-8.0，最優選地pH8.0。洗脫緩沖液為20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.5，優選地pH7.0-8.0，最優選地pH8.0。操作流速10cm-18cm/hr，優選地操作流速12-16cm/hr。紫外檢測A280nm吸收值。峰值洗脫液進一步用離子交換層析純化。離子交換介質選用本領域常用的陰離子交換介質，如DEAE Sepharose Fast Flow、Q Sepharose FastFlow(GE Healthcare，Amersham Biosciences)或者FractogelEMD TMAE、FractogelEMD DEAE(北京金歐亞科技發展有限公司)等，按照廠家提供的說明書或者本領域公知的技術自己裝柱或者選用廠家預裝柱如HiLoadTMQSepharose等。離子交換介質的平衡緩沖液為20-50mMTris-HCl，pH7.0-8.5，優選地pH7.0-8.0，特別優選地pH7.5；洗脫緩沖液為20-50mMTris-HCl，pH7.0-8.5，優選地pH7.0-8.0，特別優選地pH7.5，氯化鈉線性梯度0-0.1M/(5-10柱體積)，操作流速16cm-26cm/hr，優選地18cm-24cm/hr。
為了解決上述羧肽酶B不穩定的技術問題，發明人所采取的技術方案是在純化的羧肽酶B中加入甘露醇，冷凍干燥獲得穩定的羧肽酶B組合物。
本發明提供的穩定的羧肽酶B組合物包括羧肽酶B，還含有3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇。
本發明的穩定的羧肽酶B組合物的制備方法，通過制備丙酮粉、硫酸銨鹽析、疏水層析、離子交換層析后的純化羧肽酶B溶液中加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，混勻，冷凍干燥即得。優選地離子交換層析后的純化羧肽酶B溶液經過濃縮，然后再加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，混勻，冷凍干燥即得。
本發明通過制備丙酮粉抽提羧肽酶B具有顯著的技術效果。丙酮可以有效破碎細胞膜，加速目標產物的釋放，而且丙酮可以脫去胰臟組織中的脂肪，便于后續的抽提。制備的丙酮粉具有蛋白活性，可以長時間保存，便于控制。同時該丙酮粉還可以用于提取其它胰酶。
本發明制備羧肽酶B的方法，羧肽酶B的得率達60U/g胰臟以上，得率提高了20％以上，羧肽酶B的比活性大于200U/mg，SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)純度與羧肽酶B對照品(SIGMA)在同一位置有單一條帶。另外本發明的制備羧肽酶B的方法大大縮短了生產周期，降低了生產成本，而且單元操作簡便，易于控制。應當說明的是在上下文中“得率”一詞的含義理解為每單位原料(動物胰臟)經過本發明的方法純化后獲得的羧肽酶B的活性(U)。
本發明的羧肽酶B組合物，其羧肽酶B的穩定性大大提高，活性穩定性保持兩年以上，而現有技術中羧肽酶B加鹽凍存僅為2月。
附圖1系制備羧肽酶B的工藝路線。
附圖2系羧肽酶B疏水層析洗脫曲線。
附圖3系羧肽酶B離子交換層析洗脫曲線，——為A280nm，——為羧肽酶B活性曲線。
附圖4系羧肽酶B的穩定性曲線。
以下結合具體實施方式
詳細說明本發明，但是所有具體實施方式
均應理解為說明性的，僅為闡明本發明的內容，不以任何方式限制本發明的范圍。
具體實施例方式
實施例一 丙酮粉的制備選用豬凍胰臟1kg，刨切成厚約2mm左右的薄片，室溫自溶16-24小時。自溶后，加預冷丙酮處理兩遍，每遍加3倍量丙酮(V/W)，攪拌，離心收集濾渣，濾渣自然風干即為包含羧肽酶B的丙酮粉。
實施例二 丙酮粉的制備選用新鮮豬胰臟1kg，用絞肉機絞碎，加入預冷的丙酮處理三遍，每遍用5倍量丙酮(v/w)，不斷攪拌，離心收集濾渣，濾渣自然風干后即為含有羧肽酶B的丙酮粉。
實施例三 丙酮粉的制備選用豬凍胰臟1kg，刨切成厚約2mm左右的薄片，室溫自溶16-24小時。自溶后，加預冷丙酮處理兩遍，每遍加3倍量丙酮(V/W)，攪拌，離心收集濾渣，再用2倍量丙酮∶乙醚(1∶1)混合液處理，不斷攪拌，離心收集濾渣，濾渣自然風干即為包含羧肽酶B的丙酮粉。
實施例四 丙酮粉的制備選用豬凍胰臟1kg，如實施例三一樣操作，經丙酮乙醚混合液處理后的濾渣，再用2倍量乙醚攪拌抽濾一遍，離心收集濾渣，攤平，自然晾干即得丙酮粉。
實施例五 羧肽酶B的純化取實施例一的丙酮粉加十倍量水，攪拌半小時后，用1mol/L氫氧化鈉調pH至8.0，繼續攪拌抽提1.5小時。抽提液用一層紗布過濾后，清液量體積，按1.5mol/L加入硫酸銨，放置1.5小時。鹽析液過濾后上疏水層析柱，疏水層析介質用平衡緩沖液平衡，穿透峰棄去，待A280nm下至基線后，用洗脫緩沖液洗脫，檢測A280nm吸光度值，收集洗脫峰。疏水層析條件如下層析柱11×20cm(介質床層高度)疏水介質Octyl Sepharose 4 Fast Flow流速12cm/hr平衡緩沖液20mmol/LTris-HCl，pH8.0，含1.5mol/L硫酸銨洗脫緩沖液20mmol/LTris-HCl，pH8.0洗脫曲線見附圖2。收集大洗脫峰(第一洗脫峰)洗脫液，即為含有羧肽酶B的洗脫液。疏水層析目的洗脫液上預先用平衡緩沖液平衡的陰離子交換層析柱，上樣完畢用平衡緩沖液平衡，穿透峰棄去，待A280nm下至基線后，開始梯度洗脫，收集含有羧肽酶B的洗脫峰。離子交換層析條件如下層析柱8×20cm(介質床層高度)離子交換介質DEAE Sepharose Fast Flow流速18cm/hr平衡緩沖液20mmol/LTris-HCl，pH8.0洗脫緩沖液20mmol/LTris-HCl，pH8.0線性梯度0～0.1MNaCl/5倍柱體積洗脫曲線如附圖3，第三個洗脫峰即為羧肽酶B洗脫峰。
羧肽酶B的純度檢測采用SDS-PAGE法〖張龍翔，張庭芳等SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質的相對分子量，生化實驗方法和技術，北京高等教育出版社，1989年版100-106〗，與對照品羧肽酶B(SIGMA)在同一位置，均為單一條帶。
羧肽酶B的濃度測定采用雙縮脲法〖張龍翔，張庭芳等雙縮脲法，生化實驗方法和技術，北京高等教育出版社，1989年版136-138〗。
羧肽酶B的活力測定采用紫外吸收法，參照Wolff法〖J.E.Folk，Gladner，KarlA.Piez，et alCarboxypeptidases B.J.Biol.Chem.，Vol.235，No.3，August 1960〗測定。底物為HIPPURYL-L-ARG。測定濃度為10-3mol/L，緩沖液為0.025MTris-HCl，pH7.5(含0.1MNaCl)，反應溫度為25℃。反應體系2.9ml加入酶液100μl后，立即搖勻校正零點并記時。在254nm測其吸收度增值，每隔30s讀數一次，5min內吸收度的增值應呈線性，否則酶液應稀釋后再測。
結果羧肽酶B的純度為單一條帶，比活大于200U/mg，羧肽酶B的收率65U/g胰臟。
實施例六 羧肽酶B的純化取實施例三的丙酮粉，如實施例五操作，疏水層析和離子交換層析pH控制為7.5，疏水層析線性流速16cm/hr，離子交換層析線性流速24cm/hr。結果羧肽酶B的SDS-PAGE純度呈單一條帶，羧肽酶B的比活大于200U/mg，羧肽酶B的收率64U/g胰臟。
實施例七 羧肽酶B的純化取實施例四的丙酮粉，如實施例五操作，所有緩沖液的濃度為50mmol/L。結果羧肽酶B的SDS-PAGE純度呈單一條帶，羧肽酶B的比活大于200U/mg，羧肽酶B的收率60U/g胰臟以上。
實施例八 羧肽酶B組合物實施例五的純化羧肽酶B，超濾濃縮后加入3％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，混勻，冷凍干燥即得羧肽酶B組合物。
實施例九 羧肽酶B組合物實施例六和七的純化羧肽酶B，超濾濃縮后加入5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，混勻，冷凍干燥即得羧肽酶B組合物。
實施例十 羧肽酶B的穩定性實施例八和九的羧肽酶B組合物，-20℃保存，定期取樣，用SDS-PAGE測定其純度、用雙縮脲法測定其濃度，用紫外吸收法測定其活性，結果活性保持兩年，附圖4。
權利要求
1.一種羧肽酶B的制備方法，包括鹽析、疏水層析和陰離子交換層析步驟，其特征在于還包括用丙酮抽提胰臟制備丙酮粉的步驟，即將胰臟用1～5倍量丙酮處理2～3次，制成丙酮粉。
2.根據權利要求1的羧肽酶B的制備方法，其特征在于將凍胰臟機械粉碎后自溶16～24hr，加1～5倍量預冷的丙酮處理2～3次，收集濾渣，再用1～5倍量丙酮/乙醚混合液(體積比1∶1)處理，收集濾渣干燥后獲得丙酮粉。
3.根據權利要求2的羧肽酶B的制備方法，其特征在于用丙酮/乙醚混合液處理后再用1～5倍量乙醚處理，收集濾渣干燥獲得丙酮粉。
4.根據權利要求1-3任一所述的羧肽酶B的制備方法，其特征在于(a)丙酮粉加水攪拌，調節pH至7.0-8.0，抽提1-4hr；(b)清液經疏水層析，條件為疏水層析介質是苯基、C8或C4基瓊脂糖凝膠，平衡緩沖液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0、含1.5M硫酸銨，洗脫緩沖液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0，流速12-16cm/hr，檢測A280nm收集大吸收峰；和(c)用陰離子交換層析純化，條件是介質為DEAE或者Q陰離子交換介質，平衡緩沖液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0，洗脫緩沖液是20-50mmol/LTris-HCl、pH7.0-8.0，NaCl線性梯度0-0.1M/(5-10倍柱體積)、流速16cm-26cm/hr檢測A280nm收集羧肽酶B吸收峰。
5.根據權利要求4的羧肽酶B的制備方法，其特征在于疏水層析介質為OctylSepharose 4 Fast Flow，緩沖液pH8.0；陰離子交換層析介質為DEAE SepharoseFast Flow，緩沖液pH7.5，線性流速18-24cm/hr。
6.穩定的羧肽酶B組合物，包括羧肽酶B，其特征在于還包括3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇。
7.根據權利要求6所述的羧肽酶B組合物的制造方法，其特征在于根據權利要求4純化羧肽酶B，收集含有羧肽酶B的洗脫液，然后加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，冷凍干燥即得穩定的羧肽酶B組合物。
8.根據權利要求6所述的羧肽酶B組合物的制造方法，其特征在于根據權利要求5純化羧肽酶B，收集含有羧肽酶B的洗脫液，然后加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，冷凍干燥即得穩定的羧肽酶B組合物。
9.根據權利要求7所述的羧肽酶B組合物的制造方法，其特征在于含有羧肽酶B的洗脫液經過超濾濃縮，然后加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，冷凍干燥即得。
10.根據權利要求8所述的羧肽酶B組合物的制造方法，其特征在于含有羧肽酶B的洗脫液經過超濾濃縮，然后加入3-5％(重量體積比，g/100ml)的甘露醇，冷凍干燥即得。
全文摘要
本發明一種羧肽酶B的制備方法及其組合物涉及酶學、含有酶的組合物及分離或純化方法技術領域。本發明所要解決的技術問題是提供一種羧肽酶B的制備方法及其組合物以解決現有技術中羧肽酶B制備方法得率低及羧肽酶B不穩定的缺陷。公開了一種制備羧肽酶B的方法，包括鹽析、疏水層析和陰離子交換層析的步驟，其特征在于用1～5倍量丙酮處理2～3次，制成丙酮粉；并公開了一種含有3－5％(重量體積比，g/100ml)甘露醇的羧肽酶B組合物。該發明羧肽酶B的得率達60U/g胰臟以上，收率提高了20％以上，羧肽酶B的比活性大于200U/mg，羧肽酶B穩定性2年。
文檔編號C12N9/48GK1948471SQ20051003039
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月11日 優先權日2005年10月11日
發明者李顯林, 楊煒, 王偉剛, 曹雪梅, 溫傳彬 申請人:江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司, 上海復星醫藥(集團)股份有限公司