專利名稱：從胰渣中提取及純化胰蛋白酶的方法
技術領域：
本發明涉及酶學、及其分離或純化方法技術領域，尤其涉及一種從胰渣中提取及純化胰蛋白酶的方法。
背景技術：
胰蛋白酶是一種常用的蛋白質水解酶，催化賴氨酸或精氨酸殘基羧基端組成的肽鍵水解，而無論該肽鏈的長短或其氨基酸序列。但是胰蛋白酶本身很容易自發降解，由原先的β-胰蛋白酶轉化為α-胰蛋白酶，再進一步降解為擬胰蛋白酶乃至碎片，活力因而也逐步下降直至完全喪失。
從胰臟中提取和純化胰蛋白酶具有重大的產業價值，因為胰蛋白酶作為蛋白質水解酶已經廣泛應用于醫學領域、去除啤酒霧和肉類嫩化。現在胰蛋白酶在蛋白質化學領域尤其蛋白質分析領域獲得了廣泛的應用，在基因工程領域如重組人胰島素的生產過程中也有廣泛的用途。
動物胰臟如豬胰臟、牛胰臟等含有大量具有生物學活性的化合物，如胰島素、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等。由于胰臟是相當昂貴的而且屠宰量也限制了胰臟的供應，因此應當回收胰臟中大部分的上述活性化合物，從而盡最大可能充分利用動物胰臟。
用傳統的純化方法如鹽析或溶劑沉淀的方法純化胰蛋白酶是非常困難的。傅渝濱等公開了一種從豬胰臟中提取胰酶的工藝，將冰凍胰臟或者新鮮胰臟與十二指腸一起絞碎，然后與乙醇水溶液混合后，先加入CaCl2，再加入NaOH在低溫下攪拌激活胰酶，過濾激活的胰漿、濾液經乙醇沉淀、壓榨、脫脂、干燥獲得胰酶原粉，系胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶的混合物〖傅渝濱、母昭德、景淑華、李勤耕、鄧春平、尚景川，從豬胰臟中提取胰酶的優化工藝探索，重慶醫科大學學報，1995，20(4)305-307〗。劉軍及趙小蘭也分別公開了一種胰酶制備工藝，前者采用十二指腸和Ca2+激活而后者采用苦膽和胰酶原粉激活，均采用乙醇、丙酮等有機溶劑脫脂〖劉軍，胰酶工藝研究，中國生化藥物雜志，1993，(2)40-41；趙小蘭，胰酶制備工藝研究，青海醫藥雜志，2000，30(4)56-57〗，產品均為胰酶混合物，胰酶激活程序復雜。
幾個基于蛋白質抑制劑的親和層析純化胰蛋白酶的方法已經被開發〖G.Feinstein，Biochim.Biophys.Acta，214，244，1970；G.Feinstein，Fed.Eur.Biochem.Soc.Lett.，7，353，1970；N.Robinson，R.Tye，H.Neurath and K.Walsh，Biochemistry，10，2743，1971〗。該系統由共價結合了配體分子(胰蛋白酶抑制劑)的固定化不溶性介質如纖維素衍生物、聚丙烯酰銨、聚苯乙烯、顆粒瓊脂糖等組成。該系統直接用于含有胰蛋白酶的抽提物時，由于采用的是填充柱的形式可能會存在堵塞和結垢的問題。
目前，超濾技術已經廣泛用于分離溶質分子。該技術除了易于放大外，還具有生產能力高、可以間歇操作或連續操作。然而超濾的缺點是其分辨率低，實踐中分子量相差十倍時可以獲得最佳分辨率。美國專利4973554公開了一種親和——超濾純化胰蛋白酶的方法，該方法包括將含有胰蛋白酶的水溶液和對胰蛋白酶具有親和力的水溶性親和聚合物混合保溫形成溶解的聚合物-胰蛋白酶復合物，而該聚合物是由N-丙稀酰-氨基苯甲醚和丙稀酰胺共聚而成，平均分子量至少約100000Da；超濾上述混合物去除未結合的胰蛋白酶，截留酶-親和聚合物復合物；用選擇性解離胰蛋白酶的洗脫液洗脫從酶-親和聚合物上去除胰蛋白酶，回收解離的聚合物；超濾上述洗脫液，分離胰蛋白酶和洗脫劑。該方法存在的缺點是采用苯甲醚洗脫對環境有污染，在連續操作時需要四個超濾系統而且超濾膜易于結垢，而且超濾系統價格昂貴。
發明內容
發明人廣泛而深入地研究了胰蛋白酶的提取和純化方法，選用提取過胰島素的胰渣作為原料提取和純化胰蛋白酶，并優化了抽提和激活胰蛋白酶的條件，對胰蛋白酶的純化方法進行了廣泛研究，最終提供了一種提取和純化胰蛋白酶的方法。
本發明的思路是通過胰渣抽提胰蛋白酶、然后激活，再經過離子交換和親和層析進一步純化胰蛋白酶，并對工藝條件進行優化。
因而，本發明所要解決的技術問題是提供一種從胰渣中提取和純化胰蛋白酶的方法，以解決現有技術中存在的胰酶激活程序復雜、胰蛋白酶親和層析柱易于結垢及純化過程中的有機溶劑對環境的污染的技術缺陷，最終本發明的方法達到提高胰蛋白酶的收率和活性、及降低成本減少污染的目的。
本發明所采用的技術方案是提取和純化胰蛋白酶的方法包括如下步驟(a)用無機酸從胰渣中抽提胰蛋白酶；(b)含有胰蛋白酶的抽提液調整pH至6.0-8.0，Ca2+激活；(c)調節上述(b)中的激活上清的pH至3.0-4.0，經陽離子交換層析收集含有胰蛋白酶活性的洗脫液；(d)上述(c)收集的含有胰蛋白酶的洗脫液與對胰蛋白酶有特異性親和力的介質接觸，洗去未結合的蛋白質，用解離胰蛋白酶的洗脫液洗脫結合的胰蛋白酶，收集洗脫液即得純化的胰蛋白酶。
其中步驟(a)中抽提胰蛋白酶的無機酸選自鹽酸、硫酸和磷酸，優選地采用鹽酸。胰渣用2-6倍量(v/w，mL/g)水混勻，用鹽酸將懸濁液pH調節至1.5-2.5，攪拌2-3hr，抽提胰蛋白酶。更優選地，胰渣先用4倍量(v/w，mL/g)水混勻，用6mol/L的鹽酸調節pH至1.5-2.5，攪拌2-3hr，抽提胰蛋白酶。另外，在本發明的一個實施例中直接用2-6倍量(v/w，mL/g)pH1.5-2.5的鹽酸混勻胰渣，攪拌2-3hr，抽提胰蛋白酶。
優選地提取和純化胰蛋白酶的方法中步驟(b)激活胰蛋白酶的方法是含有胰蛋白酶的抽提液用堿溶液如NaOH、KOH溶液調節pH至6.0-8.0，加入CaCl2使Ca2+濃度達到10-20mmol/L，攪拌2～3hr，離心或者過濾收集清液。優選地用10mol/L的NaOH調節pH。
提取和純化胰蛋白酶的方法中步驟(c)中的陽離子交換介質采用本領域技術人員公知的離子交換介質，如CM-SepharoseTMCL-6B、CM-SepharoseTMFast Flow、SP-SepharoseTMFast Flow(GE Healthcare，PharmaciaBiosciences)等，優選地采用SP-SepharoseTMFast Flow。平衡緩沖液為100-200mmol/L檸檬酸緩沖液(pH3.0-4.0)，洗脫緩沖液為100-200mmol/L檸檬酸緩沖液(pH3.0-4.0)、NaCl線性梯度0-1M/(5-10倍柱體積)，操作流速為8-15cm/hr。優選地緩沖液為200mmol/L檸檬酸緩沖液(pH3.0-4.0)、操作流速9.5-12.5cm/hr。層析柱的裝填按照廠家提供的說明書進行操作，或者選擇廠商提供的預裝柱如HiLoadTMSP Sepharose等，層析操作按照說明書進行。
提取和純化胰蛋白酶的方法中步驟(d)中采用Benzamindine Sepharose4FF H-sub(Pharmacia)，按照廠商提供的說明書進行操作，平衡緩沖液50mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，pH7.4；洗脫緩沖液10mmolHCl，0.5mol/LNaCl；操作流速40-100cm/hr，優選地55-90.5cm/hr。
優選地，提取和純化胰蛋白酶的方法另外包括濃縮步驟，濃縮采用本領域常用的方法，如可以將含有胰蛋白酶的親和層析洗脫液對含有3-5％(重量體積g/100mL)甘露醇的緩沖液透析濃縮，或者選用截留分子量為5000-10000Da的超濾膜超濾濃縮，在濃縮液中加入3-5％(重量體積g/100mL)的甘露醇。濃縮液冷凍干燥獲得胰蛋白酶干粉。
胰蛋白酶活力的測定采用紫外吸收法，參照《中華人民共和國藥典》(2000年版)的方法。具體為底物為N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽，配成吸收度為0.575～0.585的底物溶液，底物溶液制成后應在2小時內使用。反應體系為0.067mol/L磷酸鹽緩沖液，pH為7.6；反應溫度為25℃±0.5℃，首先在3.0ml底物溶液中，加0.001mol/L鹽酸溶液200μl作為空白，然后在3.0ml底物溶液中加入酶液200μl后，立即搖勻并記時。在253nm測其吸收度增值，每隔30s讀數一次，5min內吸收度的增值應呈線性，否則酶液應稀釋后再測。
胰蛋白酶濃度的測定采用雙縮脲法〖張龍翔，張庭芳等雙縮脲法，生化實驗方法和技術，136-138〗。
本發明的從胰渣中提取和純化胰蛋白酶的方法具有顯著的技術進步。本發明從提取過胰島素的胰渣中提取和純化胰蛋白酶，收率達1.2g胰蛋白酶/Kg胰渣，比活性大于10000U/mg胰蛋白酶，收率提高40％以上，胰蛋白酶的比活遠大于藥典2500U/mg蛋白質的標準。由于從胰渣出發達到了廢物利用的目的，可以充分利用昂貴的胰臟資源。僅用Ca2+在pH6.0-8.0條件下激活胰酶，因而操作簡單，易于操作。整個純化過程中未使用任何有機溶劑因而減少了環境污染。從陽離子交換層析洗脫胰蛋白酶后再經親和層析也大大降低了親和填充柱被堵塞和結垢的風險，無需任何特殊設備，便于常規操作及產業化生產。
本發明的提取和純化胰蛋白酶的方法用選自豬胰臟、牛胰臟等動物胰臟提取胰島素后的胰渣提取和純化胰蛋白酶。
本發明的方法雖然從胰渣出發提取和純化胰蛋白酶，但顯然也可以用于從胰臟組織出發提取和純化胰蛋白酶。
附圖1是提取和純化胰蛋白酶的工藝路線。
附圖2是陽離子交換層析圖譜，縱坐標為A280nm吸光度值，橫坐標為保留時間，峰1是穿透峰、峰2是雜質峰、峰3是含有胰蛋白酶的洗脫峰。
附圖3是親和層析圖譜，縱坐標為A280nm吸光度值，橫坐標為保留時間，峰1是穿透峰、峰2是含有胰蛋白酶的洗脫峰。
以下結合具體的實施方式詳細說明本發明，但所有這些實施方式只能理解為說明性的，僅為進一步闡明本發明的技術內容，不以任何方式限制本發明的范圍。
具體實施例方式
實施例一 胰蛋白酶的抽提和激活將提取過胰島素的胰渣250g用1000mL水混勻，用6mol/L HCl溶液調pH至1.5，攪拌2.5小時；過濾，收集清液。將抽提上清液，用10mol/L氫氧化鈉溶液調pH至6.0，加入氯化鈣，使Ca2+終濃度為10mmol/L，攪拌2.5小時；過濾，收集清液，操作溫度4-25℃。
實施例二 胰蛋白酶的抽提和激活直接用1000mLpH2.0的鹽酸和250g胰渣混勻，攪拌2.5hr，抽提胰蛋白酶，過濾，收集清液。將抽提上清液，用10mol/L氫氧化鈉溶液調pH至7.0，加入氯化鈣，使Ca2+終濃度為10mmol/L，攪拌2.5小時；過濾，收集清液。操作溫度4-25℃。
實施例三 胰蛋白酶的抽提和激活將提取過胰島素的胰渣250g用1000mL水混勻，用6mol/L HCl溶液調pH至2.5，攪拌2小時；過濾，收集清液。將抽提上清液，用10mol/L氫氧化鈉溶液調pH至7.0，加入氯化鈣，使Ca2+終濃度為20mmol/L，攪拌3小時；過濾，收集清液。操作溫度4-25℃。
實施例四 胰蛋白酶的抽提和激活將提取過胰島素的胰渣250g用1000mL水混勻，用6mol/L HCl溶液調pH至2.5，攪拌2小時；過濾，收集清液。將抽提上清液，用10mol/L氫氧化鈉溶液調pH至8.0，加入氯化鈣，使Ca2+終濃度為20mmol/L，攪拌3小時；過濾，收集清液。操作溫度4-25℃。
實施例五 胰蛋白酶的純化實施例一的激活清夜用6mol/LHCl溶液調節pH至3.5，上柱，用平衡緩沖液平衡，檢測A280nm，穿透峰棄去，待A280nm下至基線后，開始NaCl梯度洗脫，收集含有胰蛋白酶的洗脫峰。層析條件為
層析柱11×20cm離子交換介質SP Sepharose Fast Flow流速9.5cm/hr平衡緩沖液200mmol/L檸檬酸緩沖液，pH3.0洗脫緩沖液200mmol/L檸檬酸緩沖液，pH3.0，線性梯度0～1MNaCl/10倍柱體積洗脫曲線如附圖2，收集峰3洗脫液。
親和層析方法為上述峰3洗脫液上預先用平衡緩沖液平衡的層析柱，上樣完畢用平衡緩沖液平衡，穿透峰棄去，待A280nm下至基線后，洗脫緩沖液洗脫，收集目的洗脫峰，層析條件如下層析柱2.6×15cm凝膠Benzamindine Sepharose 4FF H-sub流速55cm/hr平衡液50mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，pH7.4洗脫液10mmolHCl，0.5mol/LNaCl，pH2.0洗脫曲線如附圖3，峰2為胰蛋白酶洗脫峰，收集該洗脫液，用雙縮脲法測定胰蛋白酶濃度，獲得300mg胰蛋白酶，用紫外吸收法測定胰蛋白酶活性，其比活為10500U/mg胰蛋白酶，胰蛋白酶收率為1200mg/kg胰渣。
實施例六取實施例二之激活清夜，按實施例五操作，離子交換層析pH4.0，流速12.5cm/hr。親和層析步驟流速55cm/hr。用雙縮脲法測定胰蛋白酶濃度，用紫外吸收法測定胰蛋白酶活性。結果獲得305mg胰蛋白酶，其比活為10050U/mg胰蛋白酶，胰蛋白酶收率為1220mg/kg胰渣。
實施例七取實施例三之激活上清，按照實施例五操作，離子交換層析pH4.0，流速12.5cm/hr。親和層析步驟流速100cm/hr。結果用雙縮脲法測定胰蛋白酶濃度，獲得310mg胰蛋白酶，胰蛋白酶收率1240mg/kg胰渣；用紫外吸收法測定胰蛋白酶活性，其比活為10100U/mg胰蛋白酶。
實施例八取實施例四之激活上清，按照實施例五操作，離子交換層析pH3.5，流速12.5cm/hr。親和層析步驟流速90.5cm/hr。結果用雙縮脲法測定胰蛋白酶濃度，獲得330mg胰蛋白酶，胰蛋白酶收率為1320mg/kg胰渣；用紫外吸收法測定胰蛋白酶活性，其比活為11000U/mg胰蛋白酶。
實施例九實施例七和八的純化胰蛋白酶，用截留分子量10000Da的超濾膜超濾，超濾濃縮液中加入3-5％(重量體積比g/100mL)甘露醇，冷凍干燥即得胰蛋白酶干粉。
權利要求
1.一種從胰渣中提取及純化胰蛋白酶的方法，包括如下步驟(a)用無機酸從胰渣中抽提胰蛋白酶；(b)調整含有胰蛋白酶的抽提液的pH至6.0-8.0，Ca2+激活；(c)調節上述(b)中的上清的pH至3.0-4.0，經陽離子交換層析收集含有胰蛋白酶的洗脫液；(d)上述(c)收集的含有胰蛋白酶的洗脫液與對胰蛋白酶有特異性親和力的介質接觸，洗去未結合的蛋白質，用解離胰蛋白酶的洗脫液洗脫結合的胰蛋白酶，收集洗脫液即得純化的胰蛋白酶。
2.根據權利要求1所述的提取和純化胰蛋白酶的方法，其特征在于用pH1.5-2.5的鹽酸抽提胰蛋白酶。
3.根據權利要求1所述的提取和純化胰蛋白酶的方法，其特征在于用NaOH調節步驟(a)的抽提液pH至6.0-8.0，Ca2+濃度10-20mmol/L激活。
4.根據權利要求3所述的提取和純化胰蛋白酶的方法，其特征在于，激活的上清用鹽酸調節pH至3.0-4.0，上陽離子交換柱，采用SP-SepharoseTMFast Flow作離子交換介質，平衡緩沖液為100-200mmol/L檸檬酸緩沖液(pH3.0-4.0)，洗脫緩沖液為100-200mmol/L檸檬酸緩沖液(pH3.0-4.0)、NaCl線性梯度0-1M/(5-10倍柱體積)，操作流速為8-15cm/hr。
5.根據權利要求4所述的提取和純化胰蛋白酶的方法，其特征在于，平衡緩沖液為200mmol/L檸檬酸緩沖液(pH3.0-4.0)，洗脫緩沖液為200mmol/L檸檬酸緩沖液(pH3.0-4.0)、NaCl線性梯度0-1M/(5-10倍柱體積)，操作流速為9.5-12.5cm/hr。
6.根據權利要求1所述的提取和純化胰蛋白酶的方法，其特征在于，采用Benzamindine Sepharose 4FF H-sub作親和介質，平衡緩沖液50mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，pH7.4；洗脫緩沖液10mmolHCl，0.5mol/LNaCl；操作流速40-100cm/hr。
7.根據權利要求6所述的提取和純化胰蛋白酶的方法，其特征在于操作流速55-90.5cm/hr。
8.根據權利要求5所述的提取和純化胰蛋白酶的方法，其特征在于，采用Benzamindine Sepharose 4FF H-sub作親和介質，平衡緩沖液50mmol/LTris-HCl，0.5mol/LNaCl，pH7.4；洗脫緩沖液10mmol/LHCl，0.5mol/LNaCl；操作流速55-90.5cm/hr。
9.根據權利要求8所述的提取和純化胰蛋白酶的方法，其特征在于，親和層析的含有胰蛋白酶的洗脫液用截留分子量5000-10000Da的超濾膜超濾濃縮，濃縮液中加入3-5％(重量體積比，g/100ml)甘露醇，冷凍干燥獲得胰蛋白酶干粉。
10.根據權利要求1所述的提取和純化胰蛋白酶的方法在從動物胰臟提取和純化胰蛋白酶的過程中的應用。
全文摘要
本發明從胰渣中提取及純化胰蛋白酶的方法涉及酶學、及其分離或純化方法技術領域。公開了一種從胰渣中提取和純化胰蛋白酶的方法，以解決現有技術中存在的胰酶激活程序復雜、純化過程中有機溶劑污染環境的技術缺陷。本發明提取和純化胰蛋白酶的方法包括用無機酸從胰渣中抽提胰蛋白酶；抽提液調整pH至6.0－8.0，用Ca
文檔編號C12N9/76GK1948473SQ20051003039
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月11日 優先權日2005年10月11日
發明者吳世斌, 曹韞旭, 王偉剛, 宋惠蓉, 楊樺 申請人:江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司, 上海復星醫藥(集團)股份有限公司