專利名稱：口腔粘膜細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于個人家庭健康保健和/或醫藥用口腔粘膜脫落細胞采集與保存的試劑盒技術領域。
背景技術：
在我國，口腔癌的發病率約占全部惡性腫瘤的3％，而在印度、菲律賓、巴西和斯里蘭卡等發展中國家發病率較高，可占全部惡性腫瘤的25％。近年來，口腔癌發病率和病死率在我國及美國、日本、法國和德國等國家均呈上升趨勢，因此，口腔癌的化學預防研究具有重要意義。口腔粘膜白斑是WHO認定的口腔癌前病變，其癌變率為7％～15％，非均質型白斑可達15％～40％。因此，阻斷口腔粘膜白斑的發展和惡變是預防口腔癌的重要措施。白斑癌變可經歷幾年到幾十年，問題是如何確定這些病損的轉歸，因此，許多學者開始致力于口腔白斑癌變標志物的研究。口腔粘膜脫落細胞微核是近年來國外研究較多的標志物。研究表明，口腔白斑患者病損區脫落粘膜細胞微核細胞率增高，由于脫落粘膜細胞取材方便，對機體無損傷性，所以在以口腔白斑為研究對象進行的口腔癌干預試驗研究中已被廣泛用于反映DNA損傷的中間生物學終點。
不僅如此，對于臨床其它疾病和生物分子檢測，同樣由于脫落粘膜細胞取材方便，對機體無損傷性，體細胞的取樣也可使用脫落粘膜細胞。
現行的口腔粘膜脫落細胞的取樣，一般用竹制刮板或普通棉簽刮取口腔粘膜細胞，然后送到實驗室進行檢測。這對于專業人員，如醫生、專門的研究人員來說沒多大問題，但是對于普通人或樣本不能及時處理的情況來講，就存在很多弊端。首先，普通的竹制刮板或棉簽刮取效果不佳，需要反復多次才能采集到足夠檢測用的脫落細胞，而且，是否刮取到足夠的量，無法目測辨別，也沒有其他定性識別采樣量的辦法，只有等到實驗室檢驗結果出來才能了解先前的口腔粘膜脫落細胞取樣量是否滿足實驗室要求的量，從而無法保證普通人自行采樣的有效性。其次，現有的使用方法有將粘有口腔粘膜細胞的竹制刮板或普通棉簽放在塑料袋里進行保存，再送至醫院進行檢驗。一般來說，送樣過程需要一段時間。現有的使用方法也有在醫院里進行采樣，但即使在醫院里采樣者進行了采樣，醫院的檢驗人員也不一定能及時把此樣品進行核酸檢測或是進行樣品保存處理，這樣，棉簽和細胞樣本就很容易腐敗變質，使得樣品中的DNA被酶解，導致核酸結構不完整，無法達到試驗要求。再者，對于實驗室檢驗而言，實驗室檢驗人員希望不同的采樣者相對集中地送樣，以便相對集中地進行樣品的核酸檢測。但是由于不同采樣者，通常是普通人，送樣時間不同，就使得樣品不能相對集中，為了不耽擱樣品處理時間，即保證樣品不腐敗變質，實驗室檢驗人員不得不針對少量樣品做一次檢測。這樣就浪費了實驗室檢測的效率，增大了批量檢測的成本。另外，現有的方法都是就醫者去醫院排隊，醫護人員依次發放刮取棒進行采樣，如果就醫者較多送樣比較集中的時候，醫院實驗室門口就很喧囂雜亂，醫院要進行管理很可能需要進行場所擴建或另外安排現場管理人員，提高了醫院的成本；另一面，對于就醫者來說，長時間的排隊非常不方便，雜亂的現場也使就醫者不舒服。
發明內容
本發明的目的就是克服以上不足，提供一種口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒。
本發明所述的口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒，由外包裝盒、外包裝盒內的口腔粘膜脫落細胞采集管、核酸預提取并穩定保存管和口腔粘膜脫落細胞采集棒組成，其中口腔粘膜脫落細胞采集管裝有透明等滲溶液，核酸預提取并穩定保存管裝有核酸提取液。
其中所說的口腔粘膜脫落細胞采集棒可以是各種材質和形狀，只要方便刮取口腔細胞并消毒無菌即可，如普通的棉簽、竹制刮板等。為了提高刮取效率，可以是帶齒的、帶網格紋的、或凹凸點的采集棒，目的是為了增加口腔粘膜細胞刮取的摩擦力。材料可以是木質、竹制、金屬、橡膠或塑料等多種類型。
透明等滲溶液的作用是將采集棒上的細胞洗下來，并根據等滲溶液的透明狀況判斷刮取的細胞是否夠量。為了使細胞在等滲溶液內仍能保持滲透壓平衡，不致招到破壞，這里所用的等滲溶液可以是生理鹽水、復方乳酸氯化鈉溶液、5％的葡萄糖溶液、林格氏液、PH緩沖液等。采集棒上的細胞洗過后，如果等滲溶液變得渾濁，則可判斷刮取的細胞足量；如果等滲溶液任然清澈，則繼續用采集棒刮取，在等滲溶液內清洗，直至等滲溶液變渾濁。這樣就免去了細胞樣本到達實驗室檢測階段才知道不夠用而重新取樣的麻煩。為了便于觀測，裝等滲溶液的容器要求透明，玻璃或塑料制品均可，但都需要消毒無菌。透明等滲溶液本身也進行過符合醫藥條件的消毒處理。
核酸提取穩定液的作用是初步提取核酸，使細胞裂解，釋放出核酸，同時又要使核酸制品結構完整，不降解。為了滿足這個條件，核酸提取液必須使細胞內特定酶和其它的雜蛋白迅速變質、失活，如核酸酶、內切酶、外切酶等；同時還需滿足對核酸不具有氧化、降解作用等。因此符合條件的核酸提取液可以是1)4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸鈉；2)6M鹽酸胍，20mM Tris-HCl(pH7.0)，0.5％十二烷基肌氨酸鈉；3)6M異硫氰酸胍，20mM Tris-HCl(pH7.0)；4)6M NaI，10mM Tris-HCl(pH7.0)。
將核酸提取液倒入洗脫液內即可制得核酸預提取穩定液，并可穩定保存。這種核酸預提取穩定液可在0℃以下長期保存，也可在0℃以上50℃以下保存14天以上，便于常溫條件下遞送和運輸。這種核酸預提取穩定液在送達實驗室后，可進一步純化獲得高純度、高質量的基因組DNA，可適用于PCR擴增檢測，基因克隆、突變檢測，SNP分析及臨床檢測操作等。
本發明的有益效果1、本發明所述的口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒，刮取口腔粘膜脫落細胞非常方便，由于使用特定的帶有齒狀或網格狀的刮取棒，刮取效率高，效果好；而且，對于普通人就可目測定性判斷采集的細胞是否足量用作檢測，滿足了實驗室DNA檢測對于樣品量的要求，避免了重新取樣。
2、由于樣品得到及時處理，制成核酸預提取穩定液，可在常溫保存兩周左右DNA無損傷，滿足試驗要求，方便運輸和儲存，也為試驗人員進行批量檢測提供了技術條件。
3、所有操作不需要專業知識，對于普通老百姓來說在家里就可完成，可隨時進行取樣；對于醫院來說，可接收病人在家里自行采集的細胞樣本進行集中處理，節約了人力和場所；對于整個檢測過程而言，本發明的采樣不需要在醫院實驗室完成，樣品的核酸預提取并穩定保存在進入實驗室之前就已經完成，從而改變了檢測的流程，提高了檢測的效率，醫患雙方都非常方便，因此，具有很好的市場推廣價值。
圖1為本發明所述的口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒結構示意圖。
圖2為本發明所述的口腔粘膜脫落細胞表明具有凹凸點結構的采集棒。
圖3為PCR擴增的電泳結果。
具體實施例方式
如圖1所示，在外包裝盒1內放置有兩個透明的可密封的容器，一個是口腔粘膜脫落細胞采集管2，另一個是核酸預提取并穩定保存管3，外包裝盒1內還放置有口腔粘膜脫落細胞采集棒4。口腔粘膜脫落細胞采集管2內裝有等滲溶液，核酸預提取并穩定保存管3內裝有核酸提取液。
使用時，用采集棒4刮取口腔粘膜脫落細胞，然后放入口腔粘膜脫落細胞采集管2內洗脫，直到口腔粘膜脫落細胞采集管2內的等滲溶液變混濁，將核酸預提取并穩定保存管3內的核酸提取液倒入口腔粘膜脫落細胞采集管2內并混勻，制得核酸預提取穩定液，密封。這樣試劑盒就可以送至實驗室檢測用。
下面以幾個具體的試驗例來說明本發明所述的口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒的使用和應用效果。
實驗例1～4讓受試者在家里使用本發明所述的口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒，受試者分別是10個兒童，20個成年男女和10位老人。受試者是兒童組的為試驗例1，20個成年男女組分別為試驗例2和3，老人組的采集細胞樣本為試驗例4。具體的試驗樣品和條件參數見表一。
將得到的四組核酸預提取穩定液送至實驗室，可以用96孔板的方式純化基因組DNA，如用Axygen公司脫落細胞96-DNA純化試劑盒按操作指南提取純化DNA，具體方法是1.4000rpm低速離心30秒，將核酸預提取穩定液管蓋上溶液離心到管中。
2.將管轉移至65℃水浴中，加熱10分鐘，再Vortex 30秒。置冰水浴中溫育5分鐘。
3.在每管中加入4℃預冷的300μLBuffer M-B，擰緊螺旋蓋管，用力搖勻，或Vortex混合均勻。
4.4℃、12000×g離心5分鐘。
5.將96孔過濾板置于2.2ml深孔板上。吸取700μl上清并轉移至96孔過濾板中，蓋上塑料蓋，3000rpm離心3分鐘。(注意如微量過濾器中仍然殘留液體，提到離心力再離一次。)6.棄96孔過濾板。在2.2ml深孔板的濾液中加200μl含0.5％冰乙酸的異丙醇。
7.將96-DNA制備板置于廢液盒上。用8道或12道移液器吸注2.2ml深孔板中的液體兩次，使溶液充分混合。將混合液轉移到在96-DNA制備板中，將96-DNA制備板置于2.2ml深孔板上，蓋上塑料蓋，3000rpm離心3分鐘。
8.將96-DNA制備板連同2.2ml深孔板一起取出。取下塑料蓋，在96-DNA制備板的每孔中加500μlBuffer W1A，蓋上塑料蓋，3000rpm離心3分鐘。
9.棄2.2ml深孔板，將96-DNA制備板轉移到新的2.2ml深孔板上。取下塑料蓋，在96-DNA制備板的每孔中加800μl Buffer W2，蓋上塑料蓋，1500×g離心1分鐘。
10.棄2.2ml深孔板中的溶液。將96-DNA制備板置回到2.2ml深孔板上。取下塑料蓋，加800μl Buffer W2，蓋上塑料蓋，6000rpm離心10分鐘。
11.仔細將DNA制備板轉移到96-V形底板上，在膜中央加60μl水或洗脫液，室溫靜置1分鐘。6000rpm離心5分鐘收集DNA。
12.用硅膠片封上各孔。取樣時只要用槍頭硅膠片中央的十字處扎破即可。
也可以用單管的方式純化基因組DNA，如用Axygen公司脫落細胞DNA純化試劑盒按操作指南提取純化DNA，具體方法是1.4000rpm低速離心30秒，將管蓋上溶液離心到管中。
2.將管轉移至65℃水浴中，加熱15分鐘，再Vortex 30秒。置冰水浴中溫育5分鐘。
3.在每管中加入4℃預冷的300μl Buffer M-B，擰緊螺旋蓋管，用力搖勻，或Vortex混合均勻。
4.4℃、12000×g離心5分鐘。
5.將微量過濾器置于2ml微量離心管中。吸取700μl上清并轉移至微量過濾器中，6000×g離心1分鐘。
注意如微量過濾器中仍然殘留液體，提到離心力再離一次。
6.棄微量過濾器。在2ml微量離心管的濾液中加200μl含0.5％冰乙酸的異丙醇，混合均勻。
7.將步驟6中的混合液轉移到在DNA制備管中，將DNA制備管置于2ml微量離心管中，6000×g離心1分鐘。
8.棄2ml微量離心管中的溶液，將DNA制備管置回2ml微量離心管中。加500μl BufferW1，6000×g離心1分鐘。
9.棄2ml微量離心管中的溶液，將DNA制備管置回2ml微量離心管中。加700μl BufferW2，6000×g離心1分鐘。
10.棄2ml微量離心管中的溶液，將DNA制備管置回2ml微量離心管中。加400μlBuffer W2，12000×g離心1分鐘。
11.仔細將DNA制備管轉移到新的1.5ml微量離心管中(勿使2ml微量離心管中溶液濺到DNA制備管上)，在膜中央加60μl水或洗脫液，室溫靜置1分鐘。12000×g離心1分鐘收集DNA。
除Axygen公司的產品可用于上述基因組DNA純化外，Qiagen公司的產品及其它公司的類似產品，以及實驗室常規的堿法小量制備DNA方法都能從本發明的核酸預提取穩定液中純化出高質量的基因組DNA。
表一
四組核酸預提取穩定液的受試條件見表二。
表二
所提取出來的基因組DNA紫外分光光度計測定見表三。
表三
PCR檢測對樣品進行PCR檢測一.PCR反應體系20μl體系10×buffer 2uldNTP(2.5mM) 1.6ul3’primer(10uM) 0.8ul5’primer(10uM) 0.8ulrTaq(5u/ul，TAKARA) 0.2ulDNA模板 1ul加Mili-Q水至 20ul二.PCR反應條件1.PCR引物GAPDHGAPDH-F5’-ggg AAg gTg AAg gTC ggA gTC-3’GAPDH-R5’-CTg ATg ATC TTg Agg CTg TTg-3’PCR條件94℃1min
72℃ 5min4℃ forever電泳結果見圖3，表示四組核酸預提取穩定液的PCR擴增出現了4條清晰的條帶，結果為陽性。四組核酸預提取穩定液均達到DNA檢測的試驗要求，檢測結果見表四。
表四
對比例另找10個成年男女用普通棉簽刮取口腔粘膜脫落細胞，其中5個棉簽在未作處理后的3～5天腐敗變質，所攜帶的粘膜細胞全部受損無法滿足試驗檢測要求。另外五個及時做處理進行PCR擴增試驗，平均可滿足十幾次的擴增。
由表三可見，利用本發明所述的口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒，所得到的核酸預提取和穩定液可滿足1000次以上PCR擴增(根據稀釋的倍數推算)。這種DNA制品主要是人的基因組DNA，可以滿足對遺傳基因檢測的需要(如Snp檢測)，以反映個體對疾病易感性、藥物耐受性等要求，且使用方便。
權利要求
1.一種口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒，由外包裝盒、外包裝盒內的口腔粘膜脫落細胞采集管、核酸預提取并穩定保存管和口腔粘膜脫落細胞采集棒組成，其中口腔粘膜脫落細胞采集管內裝有透明等滲溶液，核酸預提取并穩定保存管內裝有核酸提取液。
2.如權利要求1所述的口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒，其特征在于，所說的透明等滲溶液是指生理鹽水、復方乳酸氯化鈉溶液、5％的葡萄糖溶液、林格氏液或PH緩沖液。
3.如權利要求1所述的口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒，其特征在于，所說的核酸提取液是1)4M異硫氰酸胍、25mM檸檬酸鈉(pH7.0)和0.5％十二烷基肌氨酸鈉；2)6M鹽酸胍、20mM Tris-HCl(pH7.0)和0.5％十二烷基肌氨酸鈉；3)6M異硫氰酸胍和20mM Tris-HCl(pH7.0)或4)6M NaI和10mM Tris-HCl(pH7.0)。
4.如權利要求1所述的口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒，其特征在于，口腔粘膜脫落細胞采集管和核酸預提取并穩定保存管是指可密封的透明、無菌的玻璃或塑料容器。
5.如權利要求1所述的口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒，其特征在于，所說的口腔粘膜脫落細胞采集棒是指木質、竹制、金屬、橡膠或塑料等材質制備的帶齒、網格紋或凹凸點的采集棒。
全文摘要
本發明屬于個人家庭健康保健和/或醫藥用口腔粘膜脫落細胞采集與保存的試劑盒技術領域。本發明所述的口腔粘膜脫落細胞自行采集與核酸預提取并穩定保存的試劑盒，由外包裝盒、外包裝盒內的口腔粘膜脫落細胞采集管、核酸預提取并穩定保存管和口腔粘膜脫落細胞采集棒組成，其中口腔粘膜脫落細胞采集管裝有透明等滲溶液，核酸預提取并穩定保存管裝有核酸提取液。本發明所述的試劑盒，對于普通人就可目測定性判斷采集的細胞是否足量用作檢測，避免了重新取樣，并且可在家里完成，對醫患雙方都非常方便，具有很好的市場推廣價值。
文檔編號C12Q1/68GK1943517SQ20051003031
公開日2007年4月11日 申請日期2005年10月8日 優先權日2005年10月8日
發明者應康 申請人:上海聯眾基因科技研究院, 應康