專利名稱：一種5－氟胞嘧啶核苷的合成方法
技術領域：
本發明涉及一種5-氟胞嘧啶核苷的合成方法，具體的說涉及一種5-氟胞嘧啶核苷的酶法合成方法。
背景技術：
β-D-2′，3′-雙脫氧雙脫氫-5-氟胞嘧啶核苷(D-D4FC)是第二代對人體線粒體沒有毒副作用的核苷類似物(Schinazi，R.；Ma，L.；Shi，J.；Liotta，D.；Faraj，A.；Sommadossi，J.P.Abstract 557/41174，12th worldAIDS conf，Geneva，June 28-July 3，1998.)，是一種高效的HIV和HBV選擇性抑制劑，可在體外和體內抑制HIV和HBV的復制。據報道，它能抑止對AZT，ddC，ddI，D4T和3TC有抗藥性的HIV-1型病毒，同時，對HBV也有很強的抑止作用(Hammond，J.；Schinazi，R.；Schlueter-Wirtz，S.；Mellors，J.Abstract 597，6th Conference on Retroviruses andOpportunistic Infections，Chicago，January 31-fuebuary 4，1999.)。由于在細胞系統和體內表現出良好的藥學動力學特性及低毒性，被視為抗HIV和HBV的潛在良藥。該藥已經在美國、德國和法國開始二期臨床試驗。
到目前為止，D-D4FC僅有化學合成法的報道(J Org Chem，1992，57(14)3887；J Med Chem，1999，42(5)859；Bioorg Med Chem Lett，1998，8(22)3245；J Med Chem，1999，42(5)859；Carbohydrate Res.1997，300(4)375)，這些合成路線的收率都比較低，摩爾總收率都在10％左右；化學合成的條件比較苛刻，需在低溫下操作，工業化難度比較大；在化學合成的過程中需要用不可回收的重金屬催化劑，不僅對工人的身體有毒害，而且對環境也很不友好，不符合現在倡導的綠色友好化學的主題。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種5-氟胞嘧啶核苷的合成方法，以解決現有技術中合成成本高、合成路線長、收率低、光活性低的缺點。
本發明公開了一種5-氟胞嘧啶核苷的合成方法，該方法包括如下步驟將反應式中結構式1的胸腺嘧啶核苷在含有脫氧核糖轉移酶的緩沖液中與5-氟胞嘧啶進行堿基交換反應，30-45℃反應20-30小時；反應液干燥后的殘留物用甲醇或二氯甲烷萃取，得到結構式2的含氟核苷類似物即5-氟胞嘧啶核苷；其中反應式為
其中緩沖液為KH2PO4緩沖液、檸檬酸緩沖液或水中的一種。
反應過程中加入脫氧核糖轉移酶。
優選的合成方法為將100-150mg 50mmol的胸腺嘧啶核苷在含有4ml脫氧核糖轉移酶的緩沖液中與100-150mg 50mmol的5-氟胞嘧啶進行堿基交換反應，30-45℃恒溫以100-200r/min轉速反應20-30小時；反應液干燥后的殘留物用10-30ml的甲醇或二氯甲烷萃取，得到結構式2的含氟核苷類似物即5-氟胞嘧啶核苷。
采用生物酶催化合成D-D4FC，具有如下優點(1)酶催化效率高，酶的催化效率比一般化學催化高出106～1013倍。在酶催化反應中，避免了在化學合成中的基團保護和去保護的操作，縮短了合成的步驟，提高了目標產物的收率，同時，降低了合成成本。實驗結果表明，用酶法催化合成D-D4FC的產率由化學合成法的10％左右提高到了25％左右，實驗步驟由化學合成法的七步縮短到了一步。
(2)反應選擇性好，大多數酶具有高度的專一性，能迅速專一的催化某一基因或某一特定位置的反應，合成出具有高光學活性的不對稱化合物。實驗結果表明，用酶法催化合成D-D4FC的ee值達到了99％(3)酶催化合成D-D4FC的反應溫度在常溫(37-45℃)常壓下的水溶液中進行，條件溫和，控制容易，副反應少，同時避免了化學合成法中的有機溶劑帶來的環境污染。
具體實施例方式實施例1取不飽和胸腺嘧啶核苷(D-D4T)1112mg(50mmol)，5-氟胞嘧啶(5-FC)124mg(100mmol)，KH2PO4緩沖液30mL(pH 6.35)，4ml自制的脫氧核糖轉移酶液于100ml的錐形瓶中，在恒溫水浴中以150r/min振蕩發應20-24h。反應在沸水中沸煮5min以中止反應。反應液被冷凍干燥，殘留物用10ml甲醇/二氯甲烷萃取，萃取液用TLC展開，獲得產物214.96mg，Y16.8％。
實施例2取不飽和胸腺嘧啶核苷(D-D4T)1 112mg(50mmol)，5-氟胞嘧啶(5-FC)124mg(100mmol)，KH2PO4緩沖液30mL(pH 6.35)，4ml自制的脫氧核糖轉移酶液于100ml的錐形瓶中，在恒溫水浴中以150r/min振蕩發應20-24h。反應在沸水中沸煮5min以中止反應。反應液被冷凍干燥，殘留物用30ml甲醇萃取，減壓濃縮得固體混合物。固體混合物過硅膠層析柱(20％ CH3OH/CH2Cl2，v/v)純化，得產物227.5mg，Y24.6％。
實施例3取不飽和胸腺嘧啶核苷(D-D4T)1112mg(50mmol)，5-氟胞嘧啶(5-FC)124mg(100mmol)，檸檬酸緩沖液30mL(pH 6.35)，4ml自制的脫氧核糖轉移酶液于100ml的錐形瓶中，在恒溫水浴中以150r/min振蕩發應20-24h。反應在沸水中沸煮5min以中止反應。反應液被冷凍干燥，殘留物用30ml甲醇萃取，減壓濃縮得固體混合物。固體混合物過硅膠層析柱(20％ CH3OH/CH2Cl2，v/v)純化，得產物227.0mg，Y24.1％。
反應過程中定性分析采用TLC法。以活化硅膠G板為載體，二氯甲烷—甲醇—水(8∶2∶0.25v/v)為展開劑，紫外顯色。D-D4T、D-D4FC、5-FC及胸腺嘧啶的Rf參考值分別為0.82、0.61、0.29及0.05底物和產物的分析采用HPLC法。采用色譜柱Diamonsil C18，Φ4.6×150mm；以15-35％甲醇/水為流動相進行剃度洗滌，流速0.9mL/min；在270nm處檢測。D-D4FC、5-FC、D-D4T及胸腺嘧啶的tR參考值分別為7.06min、5.20min、3.86min及2.71min。HPLC分析所用樣品均取自有機相，并根據有機相中的底物初始濃度和產物濃度計算產率。
譜圖分析數據如下1H NMR(DMSO-d6)δ8.04(d，J＝7.6Hz，1H，H-6)，7.77(bs，1H，NH)，7.64(bs，1H，NH)，6.82(bs，1H，H-1′)，6.39(d，J＝7.6Hz，1H，H-3′)，5.83(d，J＝6.0Hz，1h，H-2′)，5.11(t，J＝6.0Hz，1H，OH)，4.77(bs，1H，H-4′)，3.41-3.59(m，2H，H-5′)19F NMR(DMSO-d6)δ171.36(J＝8.0Hz)EI mass calcd for C9H11FN3O3(M+H+)228.0784，found228.0784UV(MeOH)max 280nm。
權利要求
1.一種5-氟胞嘧啶核苷的合成方法，其特征在于該方法包括如下步驟將反應式中結構式1的胸腺嘧啶核苷在含有脫氧核糖轉移酶的緩沖液中與5-氟胞嘧啶進行堿基交換反應，37-42℃反應20-30小時；反應液干燥后的殘留物用甲醇或二氯甲烷萃取，得到結構式2的含氟核苷類似物即5-氟胞嘧啶核苷；其中反應式為 其中緩沖液為KH2PO4緩沖液、檸檬酸緩沖液或水中的一種。
2.根據權利要求1所述的5-氟胞嘧啶核苷的合成方法，其特征在于反應過程中加入脫氧核糖轉移酶。
3.根據權利要求1或2所述的5-氟胞嘧啶核苷的合成方法，其特征在于該方法包括如下步驟將100-150mg 50mmol的胸腺嘧啶核苷在含有4ml脫氧核糖轉移酶的緩沖液中與100-150mg 50mmol的5-氟胞嘧啶進行堿基交換反應，30-45℃恒溫以100-200r/min轉速反應20-30小時；反應液干燥后的殘留物用10-30ml的甲醇或二氯甲烷萃取，得到5-氟胞嘧啶核苷。
全文摘要
本發明提供了一種5－氟胞嘧啶核苷的合成方法，該方法是通過將胸腺嘧啶核苷與5－氟胞嘧啶在脫氧核糖轉移酶的催化下合成5－氟胞嘧啶核苷。該方法避免了在化學合成中的基團保護和去保護的操作，縮短了合成的步驟，提高了目標產物的收率，同時降低了合成成本，避免了化學合成法中的有機溶劑帶來的環境污染。
文檔編號C12P19/32GK1763213SQ200510029428
公開日2006年4月26日 申請日期2005年9月6日 優先權日2005年9月6日
發明者朱利民, 傅紹軍 申請人:東華大學