專利名稱：人異體間質干細胞(攜帶治療基因)的大規模培養新工藝的制作方法
技術領域：
本發明屬于干細胞基因工程，基因治療和動物細胞發酵培養工程三大領域范疇。具體涉及GMP條件下人異體間質干細胞(攜帶治療基因)的大規模培養新工藝。
背景技術：
進入新的世紀，生命科學的迅猛發展和相關學科的交叉滲透，干細胞的研究與應用成為其中最令人矚目的領域之一。“干細胞研究的新發現”在美國《科學》雜志公布的1999年十大科學成果中名列榜首，2000年再度入選世界十大科學成果。在20世紀90年代后期生命科學的綜合發展，使干細胞研究和應用領域得以不斷拓寬和深入，特別是分離和體外培養各種不同來源干細胞的技術日益成熟，而且研究不斷取得突破性進展。至今，干細胞生物學研究幾乎涉及所有生命科學和生物醫藥領域。隨著基因治療這一學科的快速發展，干細胞臨床應用與基因治療方法的快速和有機結合，這必將為人類遺傳性和獲得性疾病的治療帶來新的希望。干細胞可分為許多種，根據胚胎學的發育來源不同其發育與分化潛能也不相同。本發明利用人類異體骨髓和胎盤，臍血間質干細胞作于基因治療的靶載體，采用基因導入方法，將外源目的DNA(治療基因)質粒DNA、RNA分子或病毒載體和非病毒載體重組的治療基因，轉導入間質干細胞，采用發酵罐無血清或低血清懸浮培養技術，經過大規模的放大培養，從實驗室培養跨越到工業化培養，使干細胞作為靶細胞應用到基因治療產業中成為現實。本發明是由于干細胞基因工程，基因治療，發酵工程的三門先鋒學科的緊密結合，共同推動人異體間質干細胞基因工程和基因治療學科的向產業化方向前進。
發明內容
本發明選擇人異體間質干細胞作于基因治療的靶細胞轉運載體，是由于間質干細胞的生物學特征決定。間質干細胞(MSC)是中胚層來源的具有多向分化能力的干細胞，主要存在于全身結締組織和器官間質中，在骨髓組織中含量最豐富，胎兒臍血，胎盤中也可以分離得到。間質干細胞具有向骨髓、骨細胞、軟骨細胞、肌腱細胞、肌細胞、神經細胞、脂肪細胞和造血支持間質細胞等分化的能力，與所有干細胞一樣，骨髓間質干細胞也有自我更新能力和多向分化潛能。它雖然僅占骨髓單核細胞的0.001％-0.01％，但是卻有驚人的增殖能力和具有強大的自我更新能力。間質干細胞除上述生物學特征支持它作為基因治療的靶細胞。還有以下的特點和優勢1.能在體外大批量擴增培養，傳代至40-50代或擴增109以上仍保持不分化的特性和不丟失其多向分化潛能；2.外源基因易于植入并整合到間質干細胞的基因組中穩定表達而不影響其干細胞特性；3.外源基因的表達具有組織特異體，受所定位微環境的作用；4.間質干細胞是未分化的原始細胞，不表達成熟的細胞抗原，異體注射入體內免疫源性很弱，不發生異體排斥反應；5.間質干細胞具有自我更新能力，治療基因導入間質干細胞后如果能長期表達，病人可終生受益；6.間質干細胞具有向各系分化的能力，只要少數間質干細胞轉染目的基因后，由其分化而成的細胞便可隨著血液循環分布到全身各部位，利于其攜帶的外源治療基因能更大限度地發揮治療作用，7.間質干細胞無論在骨髓內還是在循環或組織中，治療基因表達產物都能通過血液循環而達到靶器官，也能通過血腦屏障進入腦循環。除上述這些優勢和特點，再與其多向分化潛能相結合，及易受機體損傷或病患部位誘發信號召喚，到達誘發信號部位等特性，為人類多種難以治愈的疾病的基因治療帶來新希望。
本發明公開了人異體間質干細胞作為基因治療的靶細胞，其攜帶的治療基因的轉染方式可分為質粒DNA、RNA分子、病毒載體(如腺病毒AV，腺相關病毒AAV或其它病毒載體)和非病毒載體。本發明著重闡述了與AAV載體轉染的優勢。腺相關病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)是一種小的無色膜單鏈DNA缺陷型病毒，兩端由含有145個核苷酸的反向末端重復(Inverted Terminal Repeats，ITR)序列界定，內部含有3個啟動子和2個結構基因Rep和Cap，Rep編碼4種病毒復制和在19號染色體上位點特異性整合所需的蛋白，Cap則編碼3種組成病毒色殼的結構蛋白。AAV是依賴性病毒，需要其它病毒如腺病毒或單純皰癥病毒，或輔助因素提供輔助功能才能在宿主細胞中復制、包裝，產生新的病毒顆粒。在沒有輔助病毒存在時，AAV感染后其基因組將整合到細胞染色體中成為潛伏狀態，而不產生子代病毒。AAV被認為是基因治療最理想的載體。AAV宿主范圍廣，幾乎可以感染所有被測的培養細胞，80％以上的人均有抗AAV抗體血清陽性，但其感染無任何致病性。實驗研究表明，在很多組織細胞中，無論分裂還是靜息，都能成功地觀察到rAAV的轉染，整合以及隨后的表達。早期研究表明，利用原始細胞，包括骨髓和臍帶血的造血祖細胞也能獲得相似的結果，培養14-21天后，這些細胞表現出高水平的轉基因表達，表明rAAV載體適用于以造血干細胞為靶細胞的基因轉染。近年來，有多家實驗室證明，用質粒DNA或病毒載體能有效轉染間質干細胞，且能在動物實驗中觀察到有效的目的基因表達和轉錄，比常規的質粒DNA和病毒載體攜帶的基因治療方法更有效，表達率更高，分布更廣泛。
本發明中闡述的治療基因其覆蓋范圍是所有治療作用的基因。該生產工藝的產品是腫瘤的基因治療藥物和其它心血管系統疾病，神經系統疾病，內分泌疾病，自身免疫性疾病等基因治療藥物。
本發明中的大規模培養的新工藝，采用發酵罐懸浮無血清或低血清培養的工藝。工藝的創新是起用了發酵罐的大規模培養技術。隨著發酵工程技術更新，動物細胞的大規模培養工藝已有很大發展，特別是發酵罐的懸浮及大規模培養技術日益完善。對于懸浮生長的細胞培養的發酵設備經過適當的改造便可適用，經改造的發酵罐能節省空間，內部條件均一，而且能嚴格控制，細胞放大培養方式相對簡單，細胞生長的各種參數和條件都可以由計算機程控的自動瞬間監控系統顯示，細胞在培養過程中可隨時改變和補充培養介質，如氧，二氧化碳，pH值，濕度，滲透壓，氣相，葡萄糖濃度，氨濃度等，維持細胞良好的生長環境。
本發明所用的發酵罐基本上符合和滿足間質干細胞的生長培養，以下是反應器滿足和適合間質干細胞培養生長的基本條件和注意事項
1.細胞生長過程中的各種參數能自動由計算機程控連續監控顯示。
2.發酵罐具有彎曲或圓形的底部，在低旋轉速度下(100-350r/min)提高體系的混合效率。
3.用水循環的方式控制體系的溫度控制系統，避免用浸入式加熱器以防止局部產生高溫而損傷細胞。
4.發酵罐內容器的內部高度平滑，避免使用一些鋒利的突起物，減少機械對細胞的損傷。
5.罐體的高度與直徑的比例為2∶1到1.5∶1之間。
6.間質干細胞的壁比較脆薄，選擇合適的葉輪以避免攪拌時葉輪切力過大、過尖銳，對細胞產生破損。
本發明的間質干細胞的培養工藝與其它動物細胞略有不同，但培養過程中的一些注意事項與常規的動物細胞培養基本相似。接種的間質干細胞種子工作庫細胞是處于對數生長狀態，生長旺盛。在接種細胞前，罐內的培養基預先加熱到37℃，培養基的pH用二氧化碳預先平衡，細胞的接種密度要大于1.5×105。細胞培養過程中攪拌速度在100-300r/min的范圍內。如果罐內細胞無成團或貼壁，可以降低攪拌速度，攪拌速度的基本原則是保持培養細胞處于均勻的懸浮狀態即可。培養過程中，至少每天取樣一次，檢測細胞的生長情況和計數細胞密度。細胞長到要求的密度時，加入治療基因進行轉染。此時的攪拌速度要嚴格控制，加入治療基因時作輕微的攪拌，然后間隔每小時輕微攪拌數次，直到6小時或過夜(當載體是腺相關病毒時)。本發明用rAAV載體作轉染。因此，當rAAV與間質干細胞在轉染過程中，應充分讓rAAV進入細胞，使轉染率達到80％以上，及時地收集細胞，進行純化。如果用質粒DNA或RNA分子作轉染，應充分讓間質干細胞與質粒DNA或RNA分子進行轉染，在時間上可以延長，轉染率達到40％以上，就可收集細胞，進行純化。
本發明將干細胞基因工程，人類疾病的基因治療方法，動物細胞發酵工程結合成一體，使這生命科學中的三門前沿科學成為有生力量，為攻克人類遺傳性疾病和后天獲得的一些難治疾病(包括癌癥，心腦血管疾病，HIV和其它疾病等)做出貢獻。
圖面說明
圖1是生產工藝示意圖。
權利要求
1.人異體間質干細胞(攜帶治療基因的種子細胞)在GMP條件下大規模培養新工藝，其創新性包括以下幾個重要生產工藝的改進和創新發酵罐懸浮培養技術；無血清培養工藝；治療基因的轉染技術(質粒DNA、RNA分子、病毒載體和非病毒載體)；攜帶治療基因的間質干細胞的大量富集。具體生產工藝步驟如下(1).人異體間質干細胞(攜帶治療基因)種子的來源和建立取自引產胎兒的骨髓間質干細胞(選擇前應對抽取者母體做安全性要求的檢測如HIV，乙肝，丙肝，梅毒，衣支原體，遺傳病，以及詳細地采集病史，排除不健康的諸多因素，證明鍵康和安全的引產兒)或胎盤，臍血，成體骨髓間質干細胞。攜帶治療基因的種子人異體間質干細胞的建立，分兩步進行從原代細胞開始轉染治療基因，取已轉染治療基因的細胞作種子細胞進行傳代培養至5-8代左右細胞(細胞傳代培養中觀察到，第10代的細胞增殖能力最強，細胞繁殖最旺盛)，達到生產量后，收集細胞；從原代細胞開始傳代培養(不轉染治療基因)，傳代培養至5-8代左右細胞分別存入種子工作庫，備作大規模生產培養的工作種子。(2).人異體間質干細胞的放大(生產化)培養用50L的特殊專用發酵罐，將人異體間質干細胞工作細胞庫中的種子細胞復蘇、傳代，按25L的發酵培養用量，接種1.5×105/mL的接種量，接種人異體間質干細胞入罐，接種前先預熱發酵罐至37℃，用CO2校正和平衡培養基pH值。按間質干細胞的培養生長條件，采用無血清或血清的培養介質，進行間質干細胞發酵罐懸浮培養方法進行生產化擴增培養，為保持間質干細胞不分化，培養基中絕不能加入有促進間質干細胞分化潛能的細胞因子和細胞生長因子，只能加入使細胞保持在未分化狀態增殖的細胞因子和細胞生長因子。發酵罐培養過程中的各項間質干細胞培養生長條件的參數，由發酵罐的計算機程控自控檢測。培養過程中程控所顯示的培養參數變化，應立即予以補充(特別是細胞培養生長過程中對介質的要求和代謝產物清除)必須及時給予滿足，使罐內的細胞生產在最佳狀況。細胞的懸浮培養過程中，攪拌的速度約100-300r/min，不得大于350r/min，葉輪的切片應光滑，不能有鋒尖的棱角在攪拌時損傷細胞。攪拌的目的是保持細胞均勻呈懸浮狀態生長，保持罐內立面的細胞均能得到所需的代謝物(如氧，氨基酸，糖原，核酸等)和排除代謝的廢物，使細胞保持三維空間最佳生長狀態。當細胞增殖至罐內有效培養面積的80％時，進行下階段治療基因的轉染過程。(3).人間質干細胞與治療基因載體共轉染培養人間質干細胞作于載體的靶細胞在發酵罐中大量擴增培養，至罐內培養密度的80％左右，將目的基因(質粒DNA、RNA分子、病毒載體和非病毒載體)加入發酵罐中進行基因轉染，如果是轉染質粒DNA或RNA分子，技術相對簡單，(轉染時加氯化鈣其它物質以增加細胞膜的通透性，使細胞膜空隙增大，易于吸入質粒DNA到細胞內)，但轉染率不高。用病毒載體進行轉染的過程比較復雜，特別是本發明著重推薦的腺相關病毒載體(rAAV)進行轉染。值得一提的是間質干細胞在發酵罐中培養的基本條件，應盡量提供與體內生活條件相接近的培養環境，培養環境至少包括以下幾個因素所有與細胞接觸的設備，器材，溶液等，其中包括種子庫細胞培養和放大培養及生產過程，都必須保持絕對無菌，避免細胞受微生物的污染；必須要有充足的營養供應，絕對不能含有有害物質，甚至極微量有害離子；保證有適量的氧氣供應；及時清除細胞代謝產生的有害物質；有良好的適于細胞生存的外界環境，包括滲透壓，離子密度，氨基酸濃度，氧分壓，二氧化碳分壓，葡萄糖濃度，pH值，氨濃度等，以及保持合適的細胞密度。(4).人間質干細胞(攜帶治療基因)的收集間質干細胞經目的基因(質粒DNA、RNA分子、病毒載體或非病毒載體)轉染后，利用反應器(發酵罐)的濾膜排放系統將培養混合液濾放掉，排放去占發酵罐總體積約90％的培養液，留下大約5L的細胞混合液，在洗脫液的洗脫下，將細胞和洗脫液一起經過離心或過濾，收集沉淀的細胞層；等測試細胞凍存制品的安全性和細胞生物活性后，分別罐裝入西林瓶中，貼上標簽，再存入液氮中保存，分裝時的細胞(攜帶治療基因)加入適量的冰凍保護液以保證細胞在冰凍中不易破壞，保持細胞的生物活性。在銷售到臨床使用整個過程也應做到液氮低溫運送條件，使產品在臨床使用時，始終保持最佳的生物活性。
2.如權利要求所述的人異體間質干細胞是取自人體骨髓間質干細胞和胎盤，臍血間質干細胞，最佳的來源是引產兒的骨髓間質干細胞。
3.如權利要求所述的人異體間質干細胞可以是如下幾種轉染方式質粒轉染人異體間質干細胞(質粒DNA、RNA分子)；腺病毒(攜帶治療基因)載體與間質干細胞轉染；腺相關病毒(攜帶治療基因)載體與人異體間質干細胞轉染；或其它病毒和非病毒載體(攜帶治療基因)與人異體間質干細胞轉染。
4.權利要求所述人異體間質干細胞的培養工藝之一是發酵罐中的懸浮培養方法。
5.權利要求所述人異體間質干細胞的培養工藝之二是無血清培養方法。
6.權利要求所述人異體間質干細胞(攜帶治療基因)所攜帶的治療基因的治療范圍包括癌癥，艾滋病，血液系統疾病，心血管疾病，神經系統疾病，內分泌疾病，自身免疫性疾病，遺傳性疾病，以及與基因突變后產生的疾病。治療基因是人類同源基因，如質粒DNA和RNA分子或合成的寡核苷酸，簡略地說是覆蓋所有用來做基因治療的治療基因。
7.權利要求人間質干細胞(攜帶治療基因)的基因治療方法的受試者為人。
全文摘要
本發明公開了一種人異體間質干細胞被用于基因治療載體的商業化培養工藝，解決了人異體間質干細胞(攜帶治療基因)從實驗室制備到工業化生產過程中的一系列難題，特別是采用發酵罐和轉瓶的生產工藝，使產量得到大幅提升，降低了生產成本，滿足了臨床商業化的要求；其次，是采用無血清生產工藝，克服和杜絕了動物血清對產品的污染問題。本發明的生產工藝過程包括人異體間質干細胞(攜帶治療基因的種子細胞)的生產培養；治療基因的轉染和導入(質粒DNA、RNA分子、病毒載體如AV、AAV等以及非病毒載體)；細胞的收集和純化；安全性和生物活性檢測后包裝儲存。該生產工藝具有可控性和可操作性，保證了間質干細胞的生物活性，有很高的生產效益。
文檔編號C12N5/10GK1872997SQ20051002634
公開日2006年12月6日 申請日期2005年6月1日 優先權日2005年6月1日
發明者張云福, 裘建英, 董西銀 申請人:上海二醫新生基因科技有限公司