專利名稱：一種重組人胰島素原的生產方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域。更具體地，本發明提供一種新型N-端前導序列的人胰島素原分子(INS)，及一種利用該分子生產人胰島素原的方法，以及有關的表達載體與工程細胞的構建、人胰島素原的表達和純化工藝。
背景技術：
胰島素是胰臟分泌的一種能降低血糖的蛋白質類激素。胰島素在正常生理狀態下的分泌時相為餐后追加分泌和基礎分泌。
胰島素由胰島B細胞分泌。胰島B細胞先合成一個大分子的前胰島素原，然后加工成86肽的胰島素原，再經水解而成為胰島素。
成熟胰島素由A、B兩條多肽鏈構成，共含有51個氨基酸，分子量約6000道爾頓，較小的A鏈由21個氨基酸組成，較大的B鏈由30個氨基酸組成，兩鏈間由兩個二硫鍵相連接，破壞二硫鍵即能使胰島素的生物學作用喪失。人體內胰島素的血清半衰期約5min。
正常人胰島素由肝、腎降解，主要降解酶是肝谷胱甘肽胰島素脫氫酶，該酶通過將胰島素降解為單一的A鏈和B鏈而失活。
胰島素是治療I型糖尿病的常用特效藥物，有很大的市場需求，以前主要是從豬、牛胰臟中提取，近年來以大腸桿菌(E.coli)生產為主的重組人胰島素已占領了大部分市場份額。
1921年，Banting和Best成功地從動物胰腺中提取出胰島素，開創了人類胰島素治療的歷史。70年代末，以豬胰島素為原料，采用氨基酸置換技術得到人胰島素。1982年，采用基因重組技術生產的人胰島素正式上市。90年代至今，重組人胰島素類似物成功研發上市(對人胰島素的氨基酸序列進行修飾)，包括超短效和長效人胰島素類似物。重組人胰島素(Recombinant Human Insulin)——是應用基因重組技術生產的生物工程藥物，具有與人內源性胰島素相同的結構和生物學活性。
胰島素原及其類似物基因已在很多表達系統如大腸桿菌，枯草桿菌，酵母和哺乳動物細胞中都得到了表達，有的表達量還比較高，但是存在各種問題，比如大腸桿菌，表達量還可以，但是表達產物往往形成包涵體，這雖然有利于產物的高效表達與穩定，但這些產物需經過變復性以恢復其天然結構及活性的加工，增加了后處理的復雜性，并且到最后有活性的產物得率低。
本發明綜合現在胰島素表達生產遇到的問題，結合現代基因重組技術的最新研究，提供了一種新型N-端前導序列的人胰島素原分子，并提供了一種利用該胰島素原分子，采用新型畢赤酵母表達體系生產人胰島素原的方法，即將酵母α因子前導肽序列與本發明提供的新型人胰島素原分子融合，導入一種酵母組成型表達載體，再轉入畢赤酵母，實現重組人胰島素原的高效分泌表達，可以大大簡化純化工藝，并通過優化發酵工藝，獲得快速、簡便、穩定、活性高的一種人胰島素原的生產方法。
發明內容
本發明的目的就是提供一種新型N-端前導序列的人胰島素原分子(INS)。
本發明的另一目的就是提供一種利用該新型人胰島素原分子高效簡便的生產人胰島素原的方法。
本發明的另一目的就是提供用于該方法的表達載體及工程細胞。
在本發明的第一方面，就是提供了一種新型N-端前導序列的人胰島素原分子，其特征在于，所述的新型N-端前導序列的人胰島素原分子核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述新型N-端前導序列的人胰島素原分子核苷酸序列編碼區與SEQID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
在另一優選例中，所述的新型N-端前導序列的人胰島素原分子核苷酸序列含有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發明的第二方面，提供了一種表達載體，其特征在于，所述的表達載體含有權利要求2所述的融合蛋白序列。
在另一優選例中，所述的表達載體是pGAPZA/α-INS。
在本發明的第三方面，提供了一種工程細胞，其特征在于，它整合有權利要求4所述的表達載體。
在另一優選例中，所述的工程細胞是畢赤酵母。
在本發明的第四方面，提供了一種生產重組人胰島素原的方法，該方法包括步驟a)在適合的表達條件下，培養如權利要求6所述的宿主細胞，從而分泌表達出重組人胰島素原；b)分離純化分泌的重組人胰島素原。
圖1是融合基因α-INS的構建示意圖。
圖2是重組質粒pGAPZA/α-INS構建示意圖。
具體實施例方式
本發明人通過深入而廣泛的研究，提供了一種新型N-端前導序列的人胰島素原分子，通過在胞外構建了含有釀酒酵母α-因子前導肽序列的新型N-端前導序列的人胰島素原分子融合蛋白基因，構建入含有GAP啟動子的酵母表達載體，再轉入畢赤酵母，使其在畢赤酵母細胞內中組成型高效分泌表達。在此基礎上完成了本發明。
根據人胰島素的天然成熟肽序列，考慮到后處理工藝，提出了一種新型N-端前導序列的人胰島素原分子，其B鏈和A鏈之間以不會影響胰島素天然結構的Ala-Ala-Asp連接，并在其N端引入一個6XHisTag標簽和一個蛋白酶酶切位點，即形成F-B-Ala-Ala-Asp-A分子，其中F為HHHHHHDDDDK，其全序列見SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，其核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，與SEQID NO1所示的核苷酸序列有95％以上的同源性。
全基因合成新型N-端前導序列的人胰島素原分子的基因序列，將該基因克隆到pUC19中測序驗證后，用分子生物學方法，然后體外構建融合蛋白α-INS的融合序列，然后克隆入表達載體pGAPZA。轉化、整合入P.pastoris宿主細胞染色體，通過施加不同濃度抗性，篩選抗性最強克隆，進而篩選出高表達工程細胞。搖瓶試驗表明，生長48小時后，表達水平20mg/L以上。
在獲得工程細胞后，便可在適合的條件下培養工程細胞。在本發明中，工程菌表達的重組人胰島素原發酵條件沒有特別限制。可以采用本領域常規的發酵條件。例如，合適的培養基包括(但不限于)以下組成(i)氮源含有機氮源和無機氮源，其中有機氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，總濃度0.1-3％；無機氮源如氨水或NH4Cl、(NH4)2SO4等銨鹽，濃度0-1.5％。
(ii)無機鹽包括磷酸鹽、枸鹽酸鹽、Mg2+鹽等。較佳地，磷酸鹽緩沖體系濃度20-200mM，pH5-8；Mg2+鹽0-5mM。
(iii)在培養基中添加維生素B1作為補充維生素，濃度1～1000PPM。
(iv)根據M9培養基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。
(v)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是單一碳源，也可以是混合碳源。較佳地，碳源選自下組甘油濃度為0.1-3％；乳糖濃度為0.1-3％；葡萄糖濃度為0.1-1.5％。
為大規模獲得重組人胰島素原，需要在發酵罐中進行優化培養。本發明研究了中試發酵工藝，優化后的表達水平達到200mg/L。
在發酵表達重組人胰島素原后，對表達的rINS進行分離。
通常，發酵樣品先以離心、過濾等方式獲得發酵液上清，去除菌體。發酵液上清可通過鹽析、超濾等方法進行初步純化后再進行層析純化，也可直接進行層析純化。
適用于本發明的層析技術包括金屬螯合層析，陽離子交換層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析等。
經過2-3步純化，可得到rINS純品，純化得率40％以上，純度95％以上，純品得率約80mg/L發酵上清液。
純化后rINS的量用放免活性測定用相關試劑盒測定，以豬胰島素為標準品。
在本發明的一個實例中，提供了α-INS融合蛋白基因的獲得及表達質粒的構建。
在本發明的另一個實例中，通過篩選獲得了高表達重組人胰島素原的菌株，提高了重組人胰島素原的表達量。
在本發明的另一個實例中，通過不同啟動子之間的比較，選擇合適的表達載體表達重組人胰島素原。
在本發明的另一個實例中，經過發酵工藝的優化，進一步提高了重組人胰島素原的表達量。
在本發明的另一個實例中，經過純化工藝優化，可得到純品80mg/L。
中試研究表明，產品制造工藝穩定，操作簡單，周期短，成本低，每升發酵液可獲得重組人胰島素原純品80mg。適合產業化生產。
本發明的優點在于(1)一種新型N-端前導序列的人胰島素原分子(INS)，并在該序列前導入了釀酒酵母α-因子前導肽序列，該融合蛋白基因非常適合在畢赤酵母中分泌表達，具有高表達、高穩定的特點。
(2)表達工藝簡單，表達載體含有不需要甲醇誘導的啟動子，能組成型的高效表達人胰島素原，在發酵過程中無需更換培養基或添加誘導劑，簡化了操作工藝，比甲醇作為誘導劑的表達菌具有更高的安全性，有利于規模化生產。
(3)通過控制關鍵的發酵工藝條件，使表達水平進一步提高。
(4)純化工藝簡便，回收率高。由于是分泌蛋白，而且帶有HisTag標簽，大大簡化了純化工序，使純化回收率大大提高，使大規模低成本生產重組人胰島素原成為可能。
(5)采用畢赤酵母為工程細胞，很好地保持了重組人胰島素的活性。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1融合基因的獲得及表達質粒的構建全基因合成新型N-端前導序列的人胰島素原分子(INS)的基因序列，將該基因克隆到pUC19中測序驗證后，用分子生物學方法，然后體外構建融合蛋白α-INS的融合序列(見圖1)，以含有rINS編碼序列的質粒pUC19/rINS為模板，通過PCR擴增得到可與釀酒酵母α-因子前導肽序列以正確的框架進行融合的INS基因。同時，以含有釀酒酵母α-因子前導肽編碼序列的質粒pPIC9K(購自Invitrogen公司)為模板，PCR擴增得到α-因子前導肽序列。把純化后的上述兩種PCR產物分別用限制酶XhoI進行消化，對兩種酶切產物進行連接。以連接產物為模板進行PCR擴增，得到可用于分泌表達的融合基因α-INS。
重組質粒構建線路如圖2所示，將人工合成的α-INS基因用EcoRI進行酶切處理后，瓊脂糖凝膠電泳回收約0.5kb片段；同時將質粒pGAPZA(購自Invitrogen公司)用EcoRI進行酶切，回收大片段。將兩個片段用T4DNA連接酶進行連接，連接產物轉化進入大腸桿菌DH5α(購自Promega公司)。小量制備質粒，通過酶切鑒定含α-INS的陽性克隆。pGAPZA接入外源基因后可以將其多拷貝整合到宿主菌的染色體上進行高效表達，同時本身攜帶有一個Zeocin抗性基因，可以用于轉化子的篩選。載體pGAPZA多克隆位點前有組成性表達的GAP啟動子，不需誘導劑即可在宿主菌GS115中高效表達外源基因。
實施例2高表達重組人胰島素原工程菌株的篩選將構建好的重組質粒pGAPZA/α-INS大量制備，線性化，電穿孔轉化宿主細胞P.pastoris GS115，涂布含有不同濃度抗生素Zeocin的YPDS平板篩選高抗的陽性克隆，并進行小搖表達實驗篩選得到重組人胰島素原高表達的工程酵母菌株(含α-INS)。
實施例3選擇合適的表達載體在構建重組質粒pGAPZA/α-INS時，我們同時構建了重組質粒pPIC9K/rINS，通過與實施例2相似的過程，我們獲得了重組人胰島素原高表達的工程酵母菌株(含rINS)。將這兩個工程酵母菌株在表達環境、表達時間等一致的前提下的表達量做了一個比較，發現含α-INS工程酵母菌株中人胰島素原的表達量明顯高于含rINS的工程酵母菌株。根據結果，我們選擇GAP作為表達腸激酶的首選啟動子。
實施例4添加不同蛋白保護劑對表達水平的影響取單克隆，接種到BMGY一級種子液中，培養17-20hr；按1∶10的比例二級接種于250ml BMGY的1L三角燒瓶中，培養4~8hr左右，上罐發酵，pH5.0、溫度20℃、D0＞35％，待溶氧上升后流加50％甘油內含10％CA，或10％Peptone或10％Tryptone的培養液，36hr后取樣。樣品檢測SDS-PAGE和蛋白含量以確定誘導階段的最佳蛋白保護劑。
實施例5重組人胰島素原純化將發酵菌體破碎，離心取上清，將樣品置于4℃準備層析分離。
層析介質Ni-chelating Sepharose
層析洗滌緩沖液緩沖液A20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.4緩沖液B20mM Tris-HCl，0.15M NaCl，pH7.4洗脫液含500mM Imidazole，5mM巰基乙醇的緩沖液B將樣品依次用緩沖液A和緩沖液B洗滌，最后用洗脫液洗脫目的蛋白。
洗脫液用腸激酶處理，然后進行層析。
層析2(分子篩層析)層析介質Sephadex G75緩沖液20mM PB(pH7.0)上樣層析1收集的樣品組分。
經過以上純化工藝，最后可得蛋白純品80mg/L發酵上清液。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海新生源醫藥研究有限公司<120>一種重組人胰島素原的生產方法<160>4<210>1<211>195<212>DNA<213>人工序列<221>misc_feature<222>(1)…(195)<223>新型N-端前導序列的人胰島素原分子(INS)<400>1catcatcatc atcatcatga cgatgacgat aagtttgtga accaacacct gtgcggctca 60cacctggtgg aagctctcta cctagtgtgc ggggaacgag gcttcttcta cacacccaag120accgctgctg atggcattgt ggaacaatgc tgtaccagca tctgctccct ctaccagctg180gagaactact gcaac 195<210>2<211>65<212>PRT<213>智人<400>2His His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Phe Val Asn1 5 10Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu15 20 25Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Ala30 35 40
Ala Asp Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser45 50 55Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn60 65<210>3<211>255<212>DNA<213>人工序列<22l>misc_feature<222>(1)…(255)<223>酵母的α信號肽序列<400>3atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt120tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat180aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta240tctctcgaga aaaga 255<210>4<211>85<212>PRT<213>智人<400>4Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala1 5 10Ser Ser Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp15 20 25
Glu Thr Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser30 35 40Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser45 50 55Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile60 65 70Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val Ser Leu Glu Lys75 80Arg8權利要求
1.一種新型N-端前導序列的人胰島素原分子(INS)的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列編碼SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列編碼區與SEQ ID NO1所示核苷酸序列有95％以上相同性。
2.一種融合蛋白序列，其特征在于，它含有權利要求1所述的核苷酸序列，并且在該核苷酸序列前插有如SEQ ID NO3所示核苷酸序列(SEQ ID NO3序列編碼SEQ ID NO4所示的氨基酸序列)。
3.一種表達載體，其特征在于，它含有權利要求2所述的融合蛋白序列。
4.如權利要求3所述的表達載體，其特征在于，它含有GAP啟動子。
5.一種工程細胞，其特征在于，它整合有權利要求4所述的表達載體。
6.如權利要求5所述的工程細胞，其特征在于，它是畢赤酵母。
7.一種人胰島素原的生產方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)在適合的表達條件下，培養如權利要求6所述的工程細胞，從而分泌表達出人胰島素原蛋白；(b)分離純化出表達的人胰島素原蛋白。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(a)所示的表達條件為誘導時間為12-120小時，較佳的為24-100小時；誘導pH為3-9，較佳的為5-7。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(b)所示的表達條件為(1).發酵液通過簡單離心或超濾獲得含有目的蛋白的上清液；(2).通過簡單的金屬螯合層析、疏水層析等簡單步驟，即可獲得純度在95％以上的純品。
全文摘要
本發明提供了一種新型N－端前導序列的人胰島素原分子(INS)，以及一種應用該胰島素原分子高效生產人胰島素原的生產方法，以及有關的表達載體與工程細胞構建、表達和純化的工藝。將酵母α因子前導肽序列與本發明提供的新型人胰島素原分子融合，導入一種酵母組成型表達載體，再轉入畢赤酵母中實現組成型分泌表達，同時通過發酵與純化工藝優化，提高了表達量和純化得率，具有表達高、穩定性好、活性高、生產工藝簡便的優點。本發明可高效、簡便、低成本地獲得人胰島素原純品。
文檔編號C12P21/02GK1873006SQ200510026290
公開日2006年12月6日 申請日期2005年5月30日 優先權日2005年5月30日
發明者孫九如, 任軍, 黃陽濱, 杜碧金, 祈暉 申請人:上海新生源醫藥研究有限公司