專利名稱：內源基因超量表達技術提高黃芪甲苷含量的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥技術領域。具體涉及一種內源基因超量表達技術提高黃芪甲苷含量的方法。
背景技術：
黃芪(Astragalus membranacius或A.mongholicus)是我國重要的中藥材品種之一，具有補益固表、利尿排毒、生肌斂瘡、利水消腫作用，是許多中藥復方、成藥和保健品的主要成分。隨著人們日益增長的保健觀念的強化，黃芪的需求量將會逐年增加；但目前黃芪的野生資源逐年減少，栽培品種品質下降且面臨農藥污染及重金屬殘留等問題的困擾，給臨床和成藥加工、出口帶來一定的困難。因而應用現代生物技術提高黃芪的產量，改善其品質，探索工業化生產的可行途徑對黃芪的生產具有重要的意義。黃芪甲苷是中國藥典規定的含測指標，如果能尋找到高黃芪甲苷含量的人工黃芪產品，將具有良好的開發和應用前景。
八十年代以來，以全蛋白肽譜、同工酶譜、氨基酸序列分析、酶免疫測定以及核酸分析技術為主要內容的分子生物學技術，特別是基因工程技術已成功地應用于中藥生產、品質鑒定改良中，為中藥生產注入了新的活力。以發根農桿菌(Agrobacterium rhizogenesis)誘導生成的毛狀根具有生長迅速，不需要添加外源激素，擁有親本植株的代謝途徑，遺傳穩定，易于擴大培養等優點，如果再能增加其有效成分含量，將有利于實現工業化生產。由于發根農桿菌Ri質粒載體系統的優越性，近年來有關這方面的研究報道很多，但多集中在單個基因的導入上，如Hughes的研究發現，將控制綠熒光蛋白(GFP)的一種糖皮質激素的誘導子轉入長春花(Catharanthus roseus)毛狀根中，該誘導子與毛狀根中糖皮質激素(地塞米松)的含量呈明顯的劑量相關。Hashimoto等用發根農桿菌作載體，將天仙子羥化酶導入富含茛菪堿的顛茄(Scopolia japonica)中，轉化的毛狀根中東茛菪堿含量比野生型(不含天仙子羥化酶基因)毛狀根高5倍。但多基因的導入報道很少，且主要是有關農作物抗病蟲害，在這些報道中是直接將外源基因導入農作物，轉基因農作物再在大田中進行生長，故所得到的轉基因植株仍需較長的生長周期。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于把毛狀根技術與基因工程相結合，獲得生長周期短、黃芪甲苷含量高的轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根。
本發明提供了內源基因超量表達技術提高黃芪甲苷含量的方法。
本發明從黃芪中克隆出的與多糖代謝相關的兩個關鍵酶基因——ugp基因(GenBank登錄號AF281081)和gbss基因(GenBank登錄號AF097922)，將該雙基因經體外修飾，增加強化表達的調控元件(CaMV 35s強啟動子和Nos-ter強終止子序列)，構建成功表達中間載體pBI-UG，通過電穿孔法將表達中間載體pBI-UG轉入發根農桿菌LBA-9402，誘導藥用植物黃芪，獲得黃芪毛狀根。
本發明對通過上述方法獲得的黃芪毛狀根進行了rolC特征引物PCR篩選、卡那霉素抗性篩選、轉多糖合成雙基因特征引物雙重嵌套PCR篩選、Southern blot分析、RT-PCR、基因表達蛋白的檢測等一系列的鑒定，證明獲得的是轉多糖合成雙基因的黃芪毛狀根。HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的含量，發現轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根中黃芪甲苷的含量比未轉基因黃芪毛狀根高近6倍，比商品藥材膜莢黃芪高11倍。對轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根進行了遺傳穩定性和合成代謝產物穩定性的檢測，結果顯示轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根具有遺傳穩定性和合成代謝產物穩定性的性質。
轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根可以大幅度提高黃芪甲苷的含量，其中株系11與22的黃芪甲苷含量分別為22.24mg/g和22.13mg/g，是野生型未轉基因黃芪毛狀根(黃芪甲苷含量為3.30mg/g)的6.7倍，是山西產膜莢黃芪(黃芪甲苷含量為1.77mg/g)的12.5倍。由于不同產地藥材的黃芪甲苷含量有所不同，參考中國藥典[1]的規定黃芪甲苷不得少于0.4mg/g，以及上海市中藥標準化中心收集測定的不同來源商品黃芪中黃芪甲苷的含量0.5mg/g～1.9mg/g，可以推斷轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根具有良好的合成黃芪甲苷的能力。
黃芪甲苷是中國藥典規定的含測指標[1]，具有良好的心腦血管藥理活性。張召才等[8]發現，黃芪甲苷可以提高心肌炎小鼠生存率，減少膠原合成和心肌細胞凋亡，安全有效；其抗凋亡效應對延緩或逆轉病毒性心肌炎心肌纖維化起重要作用。羅玉敏等(中國臨床神經科學，2000，8(4)280-281)的研究證明黃芪甲苷可以降低血腦屏障的通透性，是一種腦組織保護劑。李明亞等(廣東藥學院學報，1997，13(4)219-221)的研究表明黃芪甲苷對KCl和CaCl2所致的離體兔主動脈環收縮和對離體豚鼠右心房自發性節律有抑制作用。吳大正等(中國中藥雜志，2001，26(12)850-853)的研究表明由組胺引起的腦微血管通透性增加能夠被黃芪甲苷抑制。這些均顯示了黃芪甲苷具有很好的市場應用前景，本發明得到的轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根中黃芪甲苷含量是商品黃芪藥材的12.5倍，可以作為黃芪甲苷的提取原材料，具有良好的開發前景。
圖1.質粒pBI-UG PCR鑒定2含多糖合成雙基因的發根農桿菌LBA9402-UG三輪PCR鑒定圖3rolC特征引物PCR鑒定圖4卡那霉素抗性篩選圖5ugp、gbss兩對特征引物雙重嵌套PCR鑒定圖6轉雙基因黃芪毛狀根Southern鑒定圖7轉雙基因黃芪毛狀根RT-PCR鑒定圖8含多糖合成雙基因黃芪毛狀根黃芪甲苷含量測定圖9HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的含量圖9.1黃芪甲苷結構圖；圖9.2黃芪甲苷標準品HPLC圖；圖9.3樣品(轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根)黃芪甲苷測定HPLC圖；圖10轉雙基因黃芪毛狀根遺傳穩定性檢測
具體實施例方式實施例11)總RNA提取(一步法)反應試劑的配制變性液(26mM檸檬酸鈉pH 4.0，0.5％十二烷基肌氨酸鈉，0.125M 2-巰基乙醇，4M異硫氰酸胍)；NaAc(2M，pH 4.7)；酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)；70％乙醇。所有的試劑皆用0.1％DEPC水處理過的無RNase水配制，玻璃容器皆去RNase。
操作程序取適量新鮮植物組織置于陶瓷研缽中，加入液氮快速研磨至細粉末，轉移至含有650μl變性液的1.5ml離心管中混勻；加入65μl 2M NaAc(pH 4.0)，反復顛倒混勻；再加入650μl酚∶氯仿∶異戊醇，混勻，冰浴15min；4℃，12000rpm，離心20min；上清轉移至一新的1.5ml離心管中，加等體積異丙醇，混勻后-20℃置30min；4℃，12000rpm，離心10min沉淀RNA；棄上清液，將RNA溶于0.5ml變性液中，65℃加熱盡快溶解；加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇，混合溶液重新抽提1次，即重復前步驟；離心后，棄上清液，加75％預冷乙醇1ml，漂洗沉淀，離心同上，棄上清；空氣干燥后，加20μl去離子水溶解RNA，分光光度法和凝膠電泳檢測濃度和純度，余下部分-20℃保存備用。
2)逆轉錄cDNAOligo(dT)(37.5μM)2μl，總RNA 10μg，ddH2O 10.5μl，70℃反應10min，立即置冰上，5×RT buffer 4μl，RNasin(40U/μl)0.5μl，10mM dNTPs 1μl，M-MLV逆轉錄酶(200U/μl)1μl，42℃反應1.5h，70℃反應10min滅活逆轉錄酶。
3)引物設計根據已經發表的UGPase和GBSS的cDNA序列設計了如下的引物ugp P25’-tcgagccttacaggtcctttgg-3’，PxbaI5’-tttctaatggccaccgctactgc-3’gbss P205’-cctctagatgttgctcttactgctctctc-3’，P215’-ccgagctctgtggctcaaaatccttctg-3’構建雙基因載體時擴增引物對如下Psf5’-cagaagtactattccagtatgacg-3’，Psr5’-tttcatgatctagtaacatagtgacac-3’4)PCR擴增cDNA 1μl，Primer 1(5μM)2μl，Primer 2(5μM)2μl，10×Buffer 2μl，MgCl2(25mM)1.6μl，dNTPs(10mM)0.5μl，Taq(3U/μl)0.3μl，ddH2O94℃變性5min→94℃變性0.5min→60℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→30個循環→72℃延伸7min。
5)連接pGEM-T載體T4DNA緩沖液(10×)1μl，pGEM easy載體(50ng/μl)1μl，PCR純化產物適量，T4 DNA連接酶(3U/μl)1μl，ddH2O，將反應液混勻后4℃放置。
6)感受態細菌的制備從-70℃低溫冰箱取出菌種DH5α，接種于LB平板，37℃培養過夜進行活化。從活化平皿上挑取單菌落，接入5ml不含抗生素的LB液體培養基中，37℃振搖培養過夜(250rpm)。次日按1％(V/V)比例轉入新鮮的LB液體培養基中，37℃振搖培養至OD600＝0.3(0.3～0.6也可)。在無菌條件下，將50～100ml培養液轉入兩個預冷的無菌離心管(Falcon 2070管)中，冰上靜置10min。4℃，4000rpm離心10min，棄去上清液。倒置流盡培養液。加10ml預冷的0.1M CaCl2溶液，重懸浮細菌，冰浴30min。4℃，4000rpm離心10min，棄去上清液。加2ml預冷的0.1M CaCl2溶液，重懸浮細菌，即為感受態細胞。
7)轉化與克隆篩選在制得的感受態細胞中加4μl載體連接質粒DNA，冰浴30min后，于42℃熱激1.5min，冰上冷卻1～2min；加入SOC培養基800μl，于37℃，180rpm搖床培養1hr；取培養物100μl鋪LB平板(加相應的篩選抗生素)，再加IPTG，X-Gal各5μl，37℃恒溫培養箱過夜培養，根據藍白斑篩選陽性克隆。
8)分別以引物對gbss特征引物P20-P21、ugp特征引物PxbaI-P2擴增gbss、ugpTemplate 1μl，Primer 1(5μM)2μl，Primer 2(5μM)2μl，10×Buffer 2μl，MgCl2(25mM)1.6μl，dNTP(10mM)0.5μl，Taq(3U/μl)0.3μl，ddH2O94℃變性5min→94℃變性0.5min→45℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→3個循環→94℃變性0.5min→55℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→27個循環→72℃延伸7min。
測序。
9)雙酶切(XbaI-SacI)10×雙酶切緩沖液10μl，XbaI(10U/μl)3μl，SacI(10U/μl)3μl，DNA 10μg，ddH2O37℃水浴1hr，取出75℃滅活內切酶，取5μl電泳鑒定，其余部分酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)純化后，加1/10體積的3M NaAc，2體積的乙醇沉淀DNA，靜置10min后，12000rpm，4℃，離心10min，沉淀用70％乙醇洗滌兩次后晾干約10min，加適量的無菌水溶解，進行與載體的連接或者-20℃保存待用。
10)質粒pBI 121的提取、雙酶切反應試劑的配制LB液體培養基；溶液1(50mM葡萄糖Glucose，25mM Tris-HCl，10mMEDTA，pH 8.0)；溶液2(0.2M NaOH，1％SDS)；溶液3(5M KAc 60ml，HAc 11.5ml，H2O 28.5ml)；酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液；RNA酶(20μg/ml)；無水乙醇；70％乙醇。
操作程序取2ml含抗生素的LB液體培養基，加入15ml的通氣良好的試管中，然后從轉化平板上挑一單菌落，37℃，300rpm，培養過夜；取1.5ml培養物，4℃，12000rpm，離心0.5min，倒去上清液，沉淀盡可能干燥；加100μl溶液1重新懸浮細菌，劇烈震蕩；加200μl溶液2，蓋緊蓋子，快速顛倒混勻，置冰上；加150μl冰預冷的溶液3，蓋緊蓋子，顛倒混勻，置冰上3～5min；12000rpm，4℃，離心5min，上清轉移；加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液，振蕩混勻，4℃，12000rpm，離心2min，轉移上清液；在上清中加2倍體積EtOH，室溫放置2分鐘；12000rpm，4℃，離心5min；棄上清，沉淀晾干；再加1ml 70％乙醇洗滌沉淀，4℃，12000rpm，離心5min，沉淀空氣干燥10min；加50μl含胰RNA酶的ddH2O溶解DNA，儲存于-20℃待用。
雙酶切同9)。
11)質粒與插入片段的連接10×連接緩沖液1μl，步驟9)雙酶切純化后DNA，載體pBI 121插入片段和載體的摩爾比例約為2∶1，T4 DNA連接酶(5U/μl)1μl，ddH2O，16℃水浴過夜。
12)轉化在制得的感受態細胞中加4μl質粒連接產物，冰浴30min后，于42℃熱激1.5min，冰上冷卻1～2min；加入SOC培養基800μl，于37℃，180rpm搖床培養1hr；取培養物100μl鋪LB平板(加相應的篩選抗生素)，37℃恒溫培養箱過夜培養，PCR方法篩選陽性克隆。
13)分別以gbss、ugp特征引物PCR擴增篩選陽性克隆，方法同7)。
14)分別提取質粒pBI-GBSS、pBI-UGP，連接獲得pBI-UG。其中對pBI-GBSS進行ScaI酶切，回收酶切片段。用引物對Psf-Psr，以質粒pBI-UGP為模板，進行PCR擴增。10×反應緩沖液2μl，MgCl2(25mM)1.6μl，dNTPs(10mM)0.5μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，Psf(5μM)2μl，Psr(5μM)2μl，Template(質粒pBI-UGP)0.5μl，ddH2O。PCR循環條件同7)。
PCR產物進行切膠回收，再用ScaI進行酶切，回收酶切產物后與載體pBI-GBSS連接。篩選陽性克隆，獲得pBI-UG。
構建成功雙基因表達載體pBI-UG，分別添加了CaMV 35s強啟動子和Nos-ter強終止子序列，雙重PCR鑒定結果見圖1。
圖中1pBI-UG ugp特征引物PCR結果；21kb DNA Marker；3pBI121 ugp特征引物PCR結果；4pBI121 gbss特征引物PCR結果；5pBI-UG gbss特征引物PCR結果15)電穿孔法轉化發根農桿菌接種發根農桿菌LBA9402在含有100μg/ml利福平的YMB固體培養基上，28℃培養至單菌落長出。挑單菌落接種于加100μg/ml利福平的YMB液體培養基，28℃，250rpm，培養約40hr。按1％的接種比例將農桿菌接種于YMB液體培養基中，28℃，250rpm培養至OD600為0.5。置冰上5min后，5000rpm，4℃離心10min。1mM HEPES(pH7.0)洗滌農桿菌沉淀2～3次，每次洗滌后分別5000rpm，4℃離心10min，10％甘油懸浮沉淀。取懸浮的細菌1ml，加轉化質粒200ng左右，輕微混勻后，置冰上1min。取40μl上步的菌液置于2mm的電穿孔杯中，加2500V電壓，25uF電容，電穿孔10mS后，將菌液轉移至0.5ml YMB液體培養基中，25℃培養2～3hr后鋪于含50μg/ml卡那霉素的YMB平板，25℃培養3～4天后即見到單菌落。挑單菌落進行PCR鑒定(方法同7)，陽性菌落接種于含有100μg/ml利福平，50μg/ml卡那霉素的YMB液體培養基，28℃，250rpm，培養過夜，再對菌液進行PCR鑒定(方法同1.2.10)，確定陽性菌LBA9402-UG。
圖中11kb DNA marker；2GBSS cDNA ORF，約1.8kb；3UGPase cDNA ORF，約1.4kb；4.rolC片斷，約570bp16)轉多糖合成雙基因發根農桿菌侵染黃芪無菌苗接種發根農桿菌LBA9402-UG在含有100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB固體培養基上，28℃培養至單菌落長出。挑單菌落接種于加100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB液體培養基，28℃，250rpm，培養約40hr。按1％的接種比例將農桿菌接種于YMB液體培養基中，28℃，250rpm培養過夜。加適量乙酰丁香酮至終濃度50μM，再培養一天。無菌條件下，切取黃芪無菌苗的莖和葉片，在切口處接種懸浮培養過夜的轉多糖合成雙基因的發根農桿菌LBA9402-UG菌液(OD600＝0.5)，然后轉移至MSOH固體培養基，25℃、黑暗條件下培養2天。無菌水洗滌外植體4～5次后，轉移至含500mg/L Claforan的固體MSOH培養基，25℃、黑暗條件下培養誘導產生毛狀根。
17)毛狀根rolC特征引物PCR篩選毛狀根DNA的提取CTAB法提取步驟16誘導出的黃芪毛狀根總DNA。取500～600mg新鮮材料，液氮研細至細粉末狀，然后迅速將其轉入1.5ml離心管中；加入600μl 2％CTAB提取液(60℃預熱)，混勻，于60℃水浴放置1hr，中間溫和混勻幾次；12000rpm離心10min，取上清液，加等體積的水飽和酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，4℃12000rpm離心10min，如此重復2次，至兩液間無白色沉淀；取上清液，加等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻，4℃12000rpm離心10min；取上清液加1/10 NaAc和等體積異丙醇，混勻，-20℃放置1hr；4℃5000rpm離心10min，棄上清液，沉淀用70％乙醇漂洗2次；沉淀在空氣中自然干燥后，溶于30μlTE中。
PCR反應rolC基因的引物5′-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3′5′-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3′，預期片斷長度577bp。
Template 1μl，Primer 1(5μM)2μl，Primer 2(5μM)2μl，10×Buffer 2μl，MgCl2(25 mM)1.6μl，dNTP(10mM)0.5μl，Taq(3U/μl)0.3μl，ddH2O。94℃變性5min→94℃變性0.5min→45℃退火0.5min→72℃延伸0.75min→30個循環→72℃延伸10min。
圖中1陽性對照(LBA9402-UG)；2黃芪無菌苗；3轉ugp黃芪毛狀根；4轉gbss黃芪毛狀根；5轉雙基因黃芪毛狀根；6質粒pBI-UG；7100bp DNA Marker18)黃芪毛狀根的抗性篩選將通過步驟17得到的黃芪毛狀根在含75mg/L卡那霉素的MSOH固體培養基中培養，篩選具有卡那霉素抗性的陽性株系。
圖中左側為具有卡那霉素抗性的陽性黃芪毛狀根株系，可以在加卡那霉素的培養基上生長；右側為不具有卡那霉素抗性的陰性黃芪毛狀根株系，不能在加卡那霉素的培養基上生長19)轉多糖合成雙基因特征引物雙重嵌套PCR篩選將步驟18篩選出的陽性株系按步驟17的方法提取總DNA；引物對分別為ugp特征引物PxbaI-P2和gbss特征引物P20-P21進行PCR反應。
圖中1、8陽性對照(LBA9402-UG)；2、9黃芪無菌苗；3、10未轉基因黃芪毛狀根；4、11轉雙基因黃芪毛狀根；5、12轉gbss黃芪毛狀根；6、13轉ugp黃芪毛狀根；7、141kb DNA Marker1--6ugp特征引物PCR結果，目的條帶約1.4kb；8--13gbss特征引物PCR結果，目的條帶約1.8kb20)轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根的Southern blot分析
CTAB法提取陽性株系DNA，取15μg植物DNA用SacI與XbaI(5～10倍過量)酶切過夜后，0.8％瓊脂糖凝膠70V電壓電泳，轉膜及固定，分子雜交與信號檢測。
圖中1、7轉ugp黃芪毛狀根；2、8；轉雙基因黃芪毛狀根；3、9轉gbss黃芪毛狀根；4、10黃芪無菌苗；5、11未轉基因黃芪毛狀根；6、12陽性對照(LBA9402-UG)1--6gbss特征探針Southern雜交結果；7--12ugp特征探針Southern雜交結果21)轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根的RT-PCR植物總RNA提取按步驟l進行，逆轉錄合成cDNA第一鏈按步驟2進行，總RNA加樣量為3μg，PCR反應同步驟5。
圖中①未轉基因黃芪毛狀根；②轉gbss黃芪毛狀根；③轉ugp黃芪毛狀根；④轉雙基因黃芪毛狀根；⑤陽性對照(LBA9402-UG)；⑥黃芪無菌苗22)基因表達蛋白的檢測參考Elling-Kula[6]采用的UDPG脫氫酶偶連法進行UGPase的提取及活性測定，參考Fujita等的方法[7]進行GBSS的提取及GBSS酶活性測定。結果顯示，57.6％的轉雙基因株系UGPase活性大于或等于未轉基因株系，45.5％的轉雙基因株系GBSS活性大于或等于未轉基因株系；其中33.3％的株系在這兩個指標上均有所增加。該結果說明，部分轉雙基因株系中，雙基因已在翻譯水平上增強表達，提高了目標產物(UGPase和GBSS)的活性。
經步驟17～步驟22的鑒定與檢測，可以確定獲得轉多糖合成雙基因(ugp基因和gbss基因)的黃芪毛狀根。
23)HPLC-ELSD法測定黃芪甲苷的含量樣品的提取與制備樣品粉碎，過80目篩，每種樣品稱取3份，每份0.300g，加80％甲醇10ml，浸泡過夜后，80℃超聲提取3次，每次30min，抽濾，合并濾液。蒸干濾液，殘渣趁熱加ddH2O 5ml溶解，轉移至分液漏斗中，5ml水飽和正丁醇萃取3次，合并正丁醇液，0.15％NaOH洗滌1次，收集正丁醇液，蒸干正丁醇，殘渣用甲醇溶解定容至2ml，搖勻后0.45μm微孔濾膜過濾，即得供試液。
色譜條件色譜柱Inertsil ODS-3(4.6*250mm，5μm)；流動相∶乙腈-水(35∶65)；流速1.0ml/min；柱溫室溫；ELSD參數蒸發溫度100℃，霧化溫度80℃，出口溫度60℃；載氣流速1.2ml/min。
標準曲線的繪制精密稱取黃芪甲苷對照品2.31mg，用甲醇溶解并定容至2ml，0.45μm微孔濾膜過濾。依次吸取濾液1、2、5、10、15、20μl分別按上述色譜條件分析，測定峰面積。以對照品含量(μg)的對數值為橫坐標(X)，對照品峰面積(A)的對數值為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。并得回歸方程、相關系數及線性范圍為Y＝1.5856X+0.5769，r＝0.9995，1.155～23.100μg。
精密度實驗精密吸取黃芪甲苷對照品溶液10μl，重復5次進樣測定，結果黃芪甲苷RSD＝1.114％(n＝5)。
穩定性實驗同一樣品分別在0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24h進樣，計算含量，測定日內穩定性，結果RSD＝0.79％。
重復性實驗同種樣品稱取5份，每份0.300g，按3.2.3項下方法提取測定黃芪甲苷含量，計算得黃芪甲苷的平均含量17.352mg/g，RSD為2.30％。
回收率實驗精密稱取5份已知黃芪甲苷含量未轉基因黃芪毛狀根樣品，每份0.300g，分別精密加入黃芪甲苷標準品，同法提取測定黃芪甲苷含量，測得平均回收率為96.72％，RSD＝2.04％。
樣品的測定稱取山西產商品膜莢黃芪藥材、未轉基因黃芪毛狀根、轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根粉末，每種3份，每份0.300g，同法制備供試液，按相同色譜條件測定供試液中黃芪甲苷的含量，外標法計算峰面積。
測定結果結果顯示轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根黃芪甲苷含量普遍很高，如株系11與22的黃芪甲苷含量分別為22.24mg/g和22.13mg/g，明顯高于非轉基因黃芪毛狀根(黃芪甲苷含量為3.30mg/g)和山西產膜莢黃芪藥材(黃芪甲苷含量為1.77mg/g)。
圖9.1黃芪甲苷結構圖；圖9.2黃芪甲苷標準品HPLC圖；圖9.3樣品(轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根)黃芪甲苷測定HPLC圖；圖中ASI為黃芪甲苷(Astragaloside IV)的縮寫24)遺傳穩定性和合成代謝產物的穩定性的檢測分別取轉化后穩定生長15天(即轉化當代)、繼代培養一年的轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根提取DNA進行ugp與gbss特征引物PCR；結果顯示轉入的雙基因在一年后仍然穩定存在于轉基因株系基因組中，表明轉基因株系具有遺傳穩定性。分別取轉化當代與繼代培養一年的轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根提取測定黃芪甲苷；結果說明轉化當代與繼代一年后的轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根中的黃芪甲苷含量無明顯差異，該結果顯示，轉多糖合成雙基因黃芪毛狀根具有遺傳穩定的合成黃芪甲苷的能力。
圖中1、9一年生轉雙基因黃芪毛狀根；2、10未轉基因黃芪毛狀根；3、11轉化當代轉雙基因黃芪毛狀根；4、12黃芪無菌苗；5、8陽性對照(LBA9402-UG)；6、71kb DNA Marker。
權利要求
1.一種內源基因超量表達技術提高黃芪甲苷含量的方法，其特征在于包括下列步驟1)總核糖核酸提取反應試劑的配制變性液26mM檸檬酸鈉pH4.0，0.5％十二烷基肌氨酸鈉，0.125M 2-巰基乙醇，4M異硫氰酸胍；NaAc2M，pH4.7；酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1；70％乙醇；所有的試劑皆用0.1％焦碳酸二乙酯水處理過的無核糖核酸酶水配制，玻璃容器皆去核糖核酸酶；操作程序取適量新鮮植物組織置于陶瓷研缽中，加入液氮快速研磨至細粉末，轉移至含有650μl變性液的1.5ml離心管中混勻；加入65μl 2M NaAc pH4.0，反復顛倒混勻；再加入650μl酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1，混勻，冰浴15min；4℃，12000rpm，離心20min；上清轉移至一新的1.5ml離心管中，加等體積異丙醇，混勻后-20℃置30min；4℃，12000rpm，離心10min沉淀核糖核酸；棄上清液，將核糖核酸溶于0.5ml變性液中，65℃加熱盡快溶解；加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇，混合溶液重新抽提1次，即重復前步驟；離心后，棄上清液，加75％預冷乙醇1ml，漂洗沉淀，離心同上，棄上清；空氣干燥后，加20μl無菌雙蒸去離子水溶解核糖核酸，分光光度法和凝膠電泳檢測濃度和純度，余下部分-20℃保存備用；2)逆轉錄互補脫氧核糖核酸寡聚脫氧胸苷酸37.5μM 2μl，總核糖核酸10μg，無菌雙蒸去離子水10.5μl，70℃反應10min，立即置冰上，5×逆轉錄緩沖液4μl，核糖核酸酶抑制劑40U/μl 0.5μl，10mM脫氧核酸核苷三磷酸1μl，逆轉錄酶200U/μl 1μl，42℃反應1.5h，70℃反應10min滅活逆轉錄酶；3)引物設計根據尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因和腺苷二磷酸葡萄糖苷轉移酶基因的互補脫氧核糖核酸序列設計引物P25’-tcgagccttacaggtcctttgg-3’，PxbaI5’-tttctaatggccaccgctactgc-3’P205’-cctctagatgttgctcttactgctctctc-3’，P215’-ccgagctctgtggctcaaaatccttctg-3’構建雙基因載體時擴增引物為Psf5’-cagaagtactattccagtatgacg-3’，Psr5’-tttcatgatctagtaacatagtgacac-3’4)聚合酶鏈式反應擴增互補脫氧核糖核酸1μl，引物15μM 2μl，引物25μM 2μl，10×緩沖液2μl，MgCl225mM1.6μl，脫氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脫氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，無菌雙蒸去離子水94℃變性5min→94℃變性0.5min→60℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→30個循環→72℃延伸7min；5)連接pGEM-T載體T4脫氧核酸緩沖液10×1μl，pGEM easy載體50ng/μl 1μl，聚合酶鏈式反應純化產物適量，T4脫氧核酸連接酶3U/μl 1μl，無菌雙蒸去離子水，將反應液混勻后4℃放置；6)感受態細菌的制備從-70℃低溫冰箱取出菌種DH5α，接種于LB平板，37℃培養過夜進行活化，從活化平皿上挑取單菌落，接入5ml不含抗生素的LB液體培養基中，37℃振搖培養過夜250rpm，次日按1％V/V比例轉入新鮮的LB液體培養基中，37℃振搖培養至OD600＝0.3～0.6也可，在無菌條件下，將50～100ml培養液轉入兩個預冷的無菌離心管中，冰上靜置10min。4℃，4000rpm離心10min，棄去上清液。倒置流盡培養液。加10ml預冷的0.1M CaCl2溶液，重懸浮細菌，冰浴30min，4℃，4000rpm離心10min，棄去上清液，加2ml預冷的0.1M CaCl2溶液，重懸浮細菌，即為感受態細胞，7)轉化與克隆篩選在制得的感受態細胞中加4μl載體連接質粒脫氧核酸，冰浴30min后，于42℃熱激1.5min，冰上冷卻1～2min；加入SOC培養基800μl，于37℃，180rpm搖床培養1hr；取培養物100μl鋪LB平板加相應的篩選抗生素，再加異丙基硫代-β-D-半乳糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷各5μl，37℃恒溫培養箱過夜培養，根據藍白斑篩選陽性克隆；8)分別以引物對腺苷二磷酸葡萄糖苷轉移酶基因特征引物P20-P21、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因特征引物PxbaI-P2擴增腺苷二磷酸葡萄糖苷轉移酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因模板1μl，引物15μM 2μl，引物5μM 2μl，10×緩沖液2μl，MgCl225mM 1.6μl，脫氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脫氧核糖核酸聚合酶3U/μl 0.3μl，無菌雙蒸去離子水94℃變性5min→94℃變性0.5min→45℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→3個循環→94℃變性0.5min→55℃退火0.5min→72℃延伸1.0min→27個循環→72℃延伸7min，測序；9)雙酶切10×雙酶切緩沖液10μl，限制性核酸內切酶XbaI 10U/μl 3μl，限制性核酸內切酶SacI 10U/μl 3μl，脫氧核糖核酸10μg，無菌雙蒸去離子水37℃水浴1hr，取出75℃滅活內切酶，取5μl電泳鑒定，其余部分酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1純化后，加1/10體積的3M NaAc，2體積的乙醇沉淀脫氧核糖核酸，靜置10min后，12000rpm，4℃，離心10min，沉淀用70％乙醇洗滌兩次后晾干約10min，加適量的無菌水溶解，進行與載體的連接或者-20℃保存待用；10)質粒pBI121的提取、雙酶切反應試劑的配制LB液體培養基；溶液150mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM乙二胺四乙酸，pH8.0；溶液20.2M NaOH，1％十二烷基硫酸鈉；溶液35M KAc 60ml，HAc 11.5ml，無菌雙蒸去離子水28.5ml；酚∶氯仿∶異戊醇25∶24∶1混合液；核糖核酸酶20μg/ml；無水乙醇；70％乙醇；操作程序取2ml含抗生素的LB液體培養基，加入15ml的通氣良好的試管中，然后從轉化平板上挑一單菌落，37℃，300rpm，培養過夜；取1.5ml培養物，4℃，12000rpm，離心0.5min，倒去上清液，沉淀盡可能干燥；加100μl溶液1重新懸浮細菌，劇烈震蕩；加200μl溶液2，蓋緊蓋子，快速顛倒混勻，置冰上；加150μl冰預冷的溶液3，蓋緊蓋子，顛倒混勻，置冰上3～5min；12000rpm，4℃，離心5min，上清轉移；加等體積的酚∶氯仿∶異戊醇混合液，振蕩混勻，4℃，12000rpm，離心2min，轉移上清液；在上清中加2倍體積乙醇，室溫放置2分鐘；12000rpm，4℃，離心5min；棄上清，沉淀晾干；再加1ml 70％乙醇洗滌沉淀，4℃，12000rpm，離心5min，沉淀空氣干燥10min；加50μl含核糖核酸酶的無菌雙蒸去離子水溶解脫氧核糖核酸，儲存于-20℃待用；再按步驟9)方法雙酶切；11)質粒與插入片段的連接10×連接緩沖液1μl，步驟9)雙酶切純化后脫氧核糖核酸，載體pBI121插入片段和載體的摩爾比例約為2∶1，T4脫氧核糖核酸連接酶5U/μl 1μl，無菌雙蒸去離子水，16℃水浴過夜；12)轉化在制得的感受態細胞中加4μl質粒連接產物，冰浴30min后，于42℃熱激1.5min，冰上冷卻1～2min；加入SOC培養基800μl，于37℃，180rpm搖床培養1hr；取培養物100μl鋪LB平板加相應的篩選抗生素，37℃恒溫培養箱過夜培養，PCR方法篩選陽性克隆；13)分別以腺苷二磷酸葡萄糖苷轉移酶基因特征引物和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因特征引物聚合酶鏈式反應擴增篩選陽性克隆，按步驟7)方法進行；14)分別提取質粒pBI-GBSS、pBI-UGP，連接獲得pBI-UG。其中對pBI-GBSS進行限制性核酸內切酶ScaI酶切，回收酶切片段。用引物對Psf-Psr，以質粒pBI-UGP為模板，進行聚合酶鏈式反應擴增，10×反應緩沖液2μl，MgCl225mM 1.6μl，脫氧核酸核苷三磷酸10mM 0.5μl，脫氧核糖核酸聚合酶5U/μl 0.2μl，引物1 Psf 5μM 2μl，引物2 Psr 5μM 2μl，質粒pBI-UGP0.5μl，無菌雙蒸去離子水，聚合酶鏈式反應循環條件與步驟7)相同。聚合酶鏈式反應產物進行切膠回收，再用限制性核酸內切酶ScaI進行酶切，回收酶切產物后與載體pBI-GBSS連接，篩選陽性克隆，獲得pBI-UG；構建成功雙基因表達載體pBI-UG，分別添加了CaMV 35s強啟動子和Nos-ter強終止子序列；15)電穿孔法轉化發根農桿菌接種發根農桿菌LBA9402在含有100μg/ml利福平的YMB固體培養基上，28℃培養至單菌落長出，挑單菌落接種于加100μg/ml利福平的YMB液體培養基，28℃，250rpm，培養約40hr，按1％的接種比例將農桿菌接種于YMB液體培養基中，28℃，250rpm培養至OD600為0.5。置冰上5min后，5000rpm，4℃離心10min，1mM N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸、pH7.0洗滌農桿菌沉淀2～3次，每次洗滌后分別5000rpm，4℃離心10min，10％甘油懸浮沉淀，取懸浮的細菌1ml，加轉化質粒200ng左右，輕微混勻后，置冰上1min。取40μl上步的菌液置于2mm的電穿孔杯中，加2500V電壓，25uF電容，電穿孔10mS后，將菌液轉移至0.5ml YMB液體培養基中，25℃培養2～3hr后鋪于含50μg/ml卡那霉素的YMB平板，25℃培養3～4天后即見到單菌落，挑單菌落進行聚合酶鏈式反應鑒定按步驟7)方法進行，陽性菌落接種于含有100μg/ml利福平，50μg/ml卡那霉素的YMB液體培養基，28℃，250rpm，培養過夜，再對菌液進行聚合酶鏈式反應鑒定，確定陽性菌LBA9402-UG。16)轉多糖合成雙基因發根農桿菌侵染黃芪無菌苗接種發根農桿菌LBA9402-UG在含有100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB固體培養基上，28℃培養至單菌落長出，挑單菌落接種于加100μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的YMB液體培養基，28℃，250rpm，培養約40hr，按1％的接種比例將農桿菌接種于YMB液體培養基中，28℃，250rpm培養過夜，加適量乙酰丁香酮至終濃度50μM，再培養一天，無菌條件下，切取黃芪無菌苗的莖和葉片，在切口處接種懸浮培養過夜的轉多糖合成雙基因的發根農桿菌LBA9402-UG菌液OD600＝0.5，然后轉移至MSOH固體培養基，25℃、黑暗條件下培養2天，無菌水洗滌外植體4～5次后，轉移至含500mg/L凱福隆的固體MSOH培養基，25℃、黑暗條件下培養誘導產生毛狀根。
全文摘要
本發明公開了一種內源基因超量表達技術提高黃芪甲苷含量的方法。本發明將多糖代謝途徑的兩個代謝反應偶連的關鍵酶基因ugp基因(尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因)和gbss基因(腺苷二磷酸葡萄糖苷轉移酶基因)，經體外修飾，增加強化表達的調控元件，構建成功中間載體，通過電穿孔法將表達中間載體pBI－UG轉入發根農桿菌LBA－9402，獲得轉多糖合成雙基因的黃芪毛狀根。其中黃芪甲苷的含量比未轉基因的黃芪毛狀根高6倍。
文檔編號C12N15/09GK1699566SQ20051002602
公開日2005年11月23日 申請日期2005年5月20日 優先權日2005年5月20日
發明者杜旻, 胡之璧, 劉滌, 周吉燕, 王子艷, 倪躍元 申請人:上海中醫藥大學