分泌人白介素－2的重組卡介苗及其構建方法

專利名稱：分泌人白介素－2的重組卡介苗及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種分泌人白介素-2的重組卡介苗及其構建方法，具體涉及一種包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽片段和白介素-2(IL-2)的重組卡介苗及其構建方法，得到的重組卡介苗rBCGIL-2用于預防和治療淺表性膀胱腫瘤及結核病，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
自從1976年Morales首次報告應用卡介苗(BCG)膀胱灌注治療表淺性膀胱腫瘤以來，BCG作為一種有效的免疫佐劑已在防治膀胱腫瘤方面取得了良好效果，目前BCG膀胱灌注已被視為膀胱腫瘤最有效的輔助治療之一。盡管BCG在預防和治療表淺性膀胱腫瘤方面具有良好的療效，但仍有許多問題需要解決。首先是進一步增強膀胱腫瘤對BCG灌注的免疫反應性。國內外文獻表明，表淺性膀胱腫瘤切除術后，即使進行規范的BCG膀胱灌注治療，仍有10％-20％的患者缺乏免疫反應而導致腫瘤復發[茍欣等“卡介苗和白細胞介素-2預防膀胱癌復發長期觀察”，醫藥導報第21卷第9期(2000)]。其次是減少其副作用。在BCG膀胱灌注后，患者常有尿頻、尿急、尿痛、血尿等膀胱炎癥狀，多數可自行緩解，但仍有少數患者會出現膀胱攣縮、BCG敗血癥等嚴重并發癥。再者細胞因子如IFN-γ、IL-2聯合BCG灌注治療雖效果良好，但存在半衰期短、用量大及毒性強的缺點，同時高昂的治療費用限制了其在臨床上的推廣[王緒雷等“卡介苗聯合白細胞介素-2防治膀胱癌術后復發”醫藥導報第21卷第9期(2000)]。
國外研究認為BCG的抗瘤機制與局部細胞免疫、直接細胞毒性作用、細胞因子的細胞殺傷等密切相關，其中IL-2、IFN-γ、TNF-α等多種細胞因子參與到免疫反應中并發揮重要的作用。近年來國內外專家開始重視BCG轉變為疫苗載體的分子生物學研究，并取得了明顯的進展。目前，國內外已將重組BCG疫苗應用于日本血吸蟲病、結核病的動物試驗及臨床中，并取得了良好的效果[甘燕等“多糖佐劑FQ2對日本血吸蟲rBCG Sj26GST疫苗增效作用及其機理的初步探討”中國人獸共患病雜志，19.2(2003)]。國外也成功構建分泌鼠白介素-2的重組BCG，并對膀胱腫瘤動物模型的免疫刺激作用及對腫瘤細胞的殺傷作用進行研究[Yamada等“分泌小鼠白細胞介素-2的重組卡介苗增強單核細胞介導的膀胱腫瘤的殺傷作用”J Urol，164(2)526(2000)]，發現重組卡介苗具有明顯抗腫瘤活性及高效表達IL-2的作用，同時可以減少卡介苗的用量及毒副作用。國內曾星等構建表達和分泌人IL-2的重組卡介苗，動物實驗發現重組卡介苗能夠通過提高荷瘤小鼠巨噬細胞釋放NO抑制腫瘤生長[“重組卡介苗及豬苓多糖對荷瘤小鼠巨噬細胞NO釋放量的影響”細胞與分子生物學雜志，18(3)292(2003)]。但上述重組卡介苗存在著IL-2分泌量低的問題。

發明內容
本發明的目的在于針對現有技術的不足，提出一種分泌人白介素-2的重組卡介苗rBCGIL-2及其構建方法，得到的rBCGIL-2具有BCG和IL-2的雙重效果，通過促進IL-2的高效分泌來增強膀胱腫瘤患者對BCG免疫治療的反應性，能夠有效預防和治療淺表性膀胱腫瘤；利用rBCGIL-2在膀胱腔內的局部協同作用減少BCG和外用IL-2的用量，可以克服BCG治療的毒副作用。
為實現這一目的，本發明利用基因工程技術將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號肽片段和人IL-2的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表達載體pMSIL-2，然后采用電轉化技術將pMSIL-2導入BCG構建重組卡介苗rBCGIL-2，Ag85B信號肽是BCG自身起分泌作用的抗原，可以協助外源基因分泌至細胞外。依靠pMSIL-2在BCG的復制和信號肽的分泌作用，能夠高效分泌IL-2。
本發明分泌人白介素-2的重組卡介苗rBCG IL-2的構建方法通過下述步驟實現步驟1卡介苗穿梭表達載體的構建根據GeneBank已有的卡介苗BCG主要分泌抗原Ag85B信號肽和IL-2的基因序列，分別設計Ag85B信號肽和IL-2的擴增引物，Ag85B信號肽的上下游酶切位點分別為BamHI和EcorI，IL-2的上下游酶切位點分別為EcorI和SalI。經聚合酶鏈式反應(PCR)分別合成得到Ag85B信號肽和IL-2的基因片段。先將Ag85B信號肽克隆到pMV261載體中，得到pMS，再將IL-2基因片段與pMS載體的信號肽連接，得到卡介苗穿梭表達載體pMSIL-2。
步驟2卡介苗的培養選取卡介苗BCG為上海丹麥株(H37Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG專用液體培養基為含有10％的營養劑ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐溫80和0.2％甘油的Middlebrook7H9broth(Difco產品)。將卡介苗放在含有液體培養基的燒瓶中進行搖床培養，搖床培養100轉/分，三周后卡介苗處于對數生長期(OD600值＝0.6)，制得感受態卡介苗。
本發明所用的液體培養基中還可以加入青霉素100μg/ml、放線菌酮100μg/ml預防細菌感染。
步驟3電轉化技術構建重組卡介苗rBCGIL-2制備好感受態卡介苗后，在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達載體pMSIL-2，置于基因脈沖儀中進行電轉化得到陽性重組子，電轉參數電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω。陽性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養基中篩選，培養兩周后得到陽性克隆rBCGIL-2，然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養基搖床生長，大量培養。
電轉化構建rBCGIL-2采用含有50μg/ml卡那霉素的固體培養基Middlebrook 7H10(Difco產品)進行抗性篩選，液體培養基為含有50μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9broth。固體培養基及液體培養基還可加入青霉素100μg/ml、放線菌酮100μg/ml預防細菌感染。
步驟4重組卡介苗rBCGIL-2的鑒定與功能檢測進行抗酸染色初步確定rBCGIL-2為抗酸桿菌，抽提rBCGIL-2質粒DNA后，PCR擴增得到IL-2的基因片段，Western blotting檢測到rBCGIL-2培養上清中和菌體中有IL-2蛋白的表達，ELISA方法檢測到rBCGIL-2培養上清中有高含量的IL-2。
本發明所用試劑均為市購，本發明所用電轉化方法及檢測方法為常規已知方法。
本發明構建的重組卡介苗rBCGIL-2具有BCG和IL-2的雙重效果，與傳統卡介苗比較，在采用相同劑量(106cfu/0.1ml)的情況下，能夠在體外明顯抑制膀胱腫瘤細胞，差別有顯著性。分別應用于8只T739小鼠膀胱腫瘤模型(來自于該品系的膀胱腫瘤細胞種植于小鼠大腿內側形成腫瘤)，采用腫瘤局部注射治療的方法，發現重組卡介苗在腫瘤消退的小鼠數目(8/8vs.2/8)、腫瘤消退時間(1Wvs.3W)、無瘤生存時間(8W vs.2W)及對該腫瘤細胞的免疫力方面，均優于傳統卡介苗。
本發明構建的rBCGIL-2能夠有效預防和治療淺表性膀胱腫瘤及結核病；利用重組卡介苗rBCGIL-2在膀胱腔內的局部協同作用可減少BCG和外用IL-2的用量，可以克服BCG治療的毒副作用，不僅可以提高傳統BCG的藥物療效，減少患者腫瘤復發的風險，而且可以減少膀胱腫瘤患者的醫療支出，既有利于患者，也有利于減輕社會醫療費用負擔，因而有良好的推廣價值和臨床應用趨向。


圖1為卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽片段的PCR擴增電泳圖。
圖2為卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽片段的測序圖。
圖3為人IL-2的PCR擴增電泳圖。
圖4為人IL-2的測序圖。
圖5為人卡介苗穿梭表達載體pMSIL-2的酶切電泳圖。
圖6為人卡介苗穿梭表達載體pMSIL-2的測序圖。
圖7為rBCGIL-2的抗酸染色圖。
圖8為rBCGIL-2抽提質粒DNA的PCR擴增電泳圖。
圖9為rBCGIL-2的SDS-PAGE結果。
圖10為rBCGIL-2的Western Blotting結果。
圖11為ELISA檢測rBCGIL-2的分泌結果。
具體實施例方式
以下結合附圖和實施例對本發明的技術方案作進一步描述。
實施例1步驟1卡介苗穿梭表達載體的構建1.合成擴增引物根據GeneBank已有的卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽和人IL-2的基因序列，設計Ag85B信號肽和IL-2的擴增引物，分別為Ag85B sense5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′antisense5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′IL-2 sense5′-AGCGAATTCATGGCACCTACTTCAAGTTC-3′antisense5′-AGCGTCGACTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGC-3′pMV261載體上的測序引物5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′2.Ag85B信號肽基因裝載到pMV261載體中合成信號肽基因并將其克隆到pUCm-T載體中連接(TAKARA)體系pUCm-T載體 1μl信號肽片段(約50ng/μl) 4μlSolμtion I5μl16℃，連接過夜。
次日將pUCm-TAg85B質粒轉化感受態細菌DH5a，步驟如下(1).取出凍存的DH5a(200μl/Tube)，冰中溶解；(2).取5μl連接液加入菌液中，輕輕混勻，冰浴30min；(3).42℃熱休克1min 30sec，冰浴2min；(4).加入500μl LB液體培養基，于37℃搖床培養，100rpm×45min；(5).取200μl涂布至含有氨芐抗性的培養板上(100μg/ml)；(6).37℃倒置培養過夜，至菌落長出；(7).挑取單克隆至3ml含有氨芐抗性的LB培養基中，于37℃搖床培養，250rpm培養過夜。
抽提pUCm-TAg85B質粒DNA挑選沒有突變的菌落，抽提質粒。按照質粒抽提試劑盒實驗步驟如下(1).將培養過夜的2ml菌液移至2ml離心管中，最高速離心30sec，棄盡上清；(2).在細菌沉淀中加入250μl Solution 1液，振蕩至徹底懸浮；(3).加入250μl Solution 2溶液，立即溫和地上下翻轉離心管5-10次以混勻，使菌體充分裂解直至形成透亮的溶液，此步驟應在5min內完成；(4).加入400μl 4℃預冷的Solution 3溶液，立即溫和并充分地翻轉離心管5-10次以混勻，室溫靜置2min，最高速離心10min；(5).將上清倒入新的離心管中，再次最高速離心10min；(6).小心吸取上清轉移到DNA吸附柱中(吸附柱置于廢液收集管中)，離心1min，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中；(7).在吸附柱中加入500μl W1液，離心30sec，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中；(8).在吸附柱中加入700μl W2液，離心30sec，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中，重復一次；(9).最高速離心1min；(10).將吸附柱移入新的干凈的1.5ml離心管中，在DNA吸附膜中央加入60μl預熱到60℃的去離子水，室溫靜置1min，最高速離心1min，得到的即為質粒DNA溶液。
PCR擴增及電泳以抽提質粒DNA為模板，用合成的信號肽兩端引物進行PCR擴增。
反應體系去離子水 40.5μlbuffer 5μldNTPs 1μlPrimer sig-F 1μlPrimer sig-R 1μlTemplate 1μl
Taq酶0.5μl反應條件 94℃ 3min94℃ 30sec54℃ 1min72℃ 30sec30cycles72℃ 10min結果如圖1所示2-5為PCR擴增條帶，與分子質量標記比較顯示約120bp，與理論上所得的擴增片段大小相同。
對抽提的pUCm-TAg85B質粒DNA進行測序鑒定測序結果見圖2，通過NCBI網站BLAST對照，堿基序列與Ag85B信號肽基因完全一致。表明PCR擴增得到的Ag85B信號肽基因完全正確。
將信號肽基因克隆到pMV261載體中(1).分別酶切信號肽基因所在的T載體和pMV261載體酶切體系去離子水 2μl 去離子水 7μlbuffer 2μl buffer 2μlpUCm-TAg85B15μl pMV26 110μlEcoRI 0.5μlEcoRI 0.5μlBamHI 0.5μlBamHI 0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳。
(2).回收信號肽片段和切后的pMV261載體(申友凝膠回收試劑盒)，步驟如下①.在紫外燈切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體并切碎，計算凝膠重量；②.加入三個凝膠體積的DE-A溶液，混勻后于75℃加熱，期間混和幾次，直至凝膠塊完全溶化(約5min)；③.加入1/2個DE-A體積的DE-B溶液，混和均勻；④.吸取上述步驟中的混和液，轉移到DNA制備管(置于2ml離心管)中，離心3600rpm×1min，棄濾液；⑤.將制備管置回離心管，加500μl W1溶液，離心3600rpm×30sec，棄濾液；⑥.將制備管置回離心管，加700μl W2溶液，離心3600rpm×30sec，棄濾液；以同樣的方法再用W2溶液洗滌一次；⑦.將制備管置回離心管中，最高速離心1min，凈棄W2溶液；⑧.將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25μl預熱到60℃的水，室溫靜置1min，最高速離心1min，得到DNA溶液。
(3).連接信號肽和pMV261連接體系連接buffer1μlpMV261載體3μl信號肽片段5.5μl連接酶0.5μl16℃連接過夜，得到含有信號肽基因的質粒pMS。
(4).轉化(化轉，步驟同前，菌液的抗性為卡那霉素)3.目的基因IL-2電泳鑒定和DNA測序以抽提的質粒DNA為模板，用合成的IL-2基因的兩端引物進行PCR擴增。
反應體系去離子水 40.5μlbuffer 5μldNTPs1μlPrimer F 1μlPrimer R 1μlTemplate 1μlTaq酶0.5μl反應條件94℃ 3min94℃ 30sec54℃ 1min72℃ 30sec 35cvcles
72℃ 10min1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實。結果圖3示IL為PCR擴增條帶，與分子質量標記比較顯示約399bp，與理論上所得的擴增片段大小相同。
DNA測序驗證目的基因IL-2將IL-2的PCR產物連接到pUCm-T載體中(步驟同信號肽克隆到pUCm-T載體)，得到質粒pUCm-TIL-2，轉化感受態細菌DH5a，分別抽提質粒DNA后，進行DNA測序，測序結果如圖4，通過NCBI網站BLAST對照，堿基序列與IL-2基因完全一致。表明PCR擴增得到的目的基因片段完全正確。
目的基因IL-2全長cDNA裝載入穿梭質粒pMS中回收目的基因IL-2片段酶切pMS和pUCm-TIL-2酶切體系water 2μlbuffer2μlpUCm-TIL-210μlEcoR I0.5μlSal I 0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實片段大小分別為4602bp和399bp。回收pMS載體、IL-2片段。
連接反應分別將pMS載體和IL-2片段行體外連接，得到穿梭表達載體pMSIL-2連接體系連接buffer 1μlpMS載體 2μl外源基因片段6.5μl連接酶 0.5μl酶切驗證穿梭表達載體酶切體系water 2μlbuffer2μl穿梭表達載體 15μlEcoR I0.5μlSal I 0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實。結果見圖5示IL為pMSIL-2以EcoR I、SalI雙酶切結果為4.6kb、399bp兩條條帶，同預期結果。
測序驗證構建的穿梭表達載體用pMV261載體上的測序引物對抽提的穿梭表達載體pMSIL-2進行測序驗證。
測序結果見圖6，通過NCBI網站BLAST對照，堿基序列與IL-2基因+Ag85B信號肽基因完全一致。
步驟2卡介苗的培養選取卡介苗BCG為上海丹麥株(H37Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG專用液體培養基為含有10％的營養劑ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐溫80和0.2％甘油的Middlebrook7H9 broth(Difco產品)。將卡介苗放在含有液體培養基的燒瓶中進行搖床培養，搖床培養100轉/分，三周后卡介苗處于對數生長期(OD600值＝0.6)，按照下列步驟制備感受態卡介苗◆BCG在Middlebrook 7H9培養基37℃搖床培養(轉速為100-120rpm)◆待培養液OD600值約0.6時將BCG菌液加入離心管中，冰浴2hr；◆將BCG菌液加入離心管中，在冰盒中預冷2hr；◆4℃離心8000g/min×15min，丟棄上清；用原始體積的1/10、預冷的濃度為10％甘油重懸菌體；◆重復上述操作共五次；◆棄上清，加入原始體積1/50的10％甘油重懸菌體即得到感受態細菌，放置室溫下備用。
本發明所用的液體培養基中還可以加入青霉素100μg/ml、放線菌酮100μg/ml預防細菌感染。
步驟3電轉化技術構建重組卡介苗rBCGIL-2◆在一離心管中混勻400μl感受態BCG(1×108cfu)和2μl穿梭表達載體pMSIL-2(0.4μg)；◆冰浴10min后，轉入預冷的0.2CM的電擊轉化杯中再冰浴10min，置于基因脈沖儀中進行電轉化，電轉參數電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω；◆質粒pMSIL-2、pMV261及單純BCG的作用時間分別為23.8、25、26毫秒；◆電轉完成后，迅速加入1000μl液體培養基，37℃下培養3hr；◆取100-200μl菌液涂抹于含有50μg/ml卡那霉素的固體培養基中篩選，先正面朝上培養，3hr后翻轉平皿，繼續培養；◆兩周后得到陽性克隆rBCGIL-2，然后接種在含2-3ml液體培養基的試管里搖床生長，大量培養。
▲注此處感受態BCG在轉化時各做一陽性對照pBCG(BCG中只含有空白質粒pMV261)及陰性對照(BCG)。
電轉化構建rBCGIL-2采用含有50μg/ml卡那霉素的固體培養基Middlebrook 7H10(Difco產品)進行抗性篩選，液體培養基為含有50μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9 broth。固體培養基及液體培養基還可加入青霉素100μg/ml、放線菌酮100μg/ml預防細菌感染。
步驟4重組卡介苗rBCGIL-2的鑒定與功能檢測1.rBCGIL-2的Z-N法抗酸染色(初步鑒定)結果見圖7染色后光學顯微鏡鏡檢(目鏡10×，油鏡100×)。在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色。
2.rBCGIL-2DNA水平鑒定(PCR擴增、電泳鑒定)rBCGIL-2質粒DNA的提取◆rBCG質粒DNA的提取將在三角燒瓶內培養四周的rBCG分瓶至15ml試管中，再在試管里搖床培養2周后使OD600約為1，收獲前加入甘氨酸至20mg/ml以干擾胞壁的合成，繼續培養一定時間后收集菌體；◆菌體用生理鹽水洗兩次后懸浮在裂解液(2mg/ml溶菌酶，0.3mol/L蔗糖，25mmol/L Tris-Cl(pH＝8.0)，25mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.2mg/ml溴甲酚綠)中溫浴24-48hr后，加入堿性SDS(20mg/mlSDS，3mol/LNaOH)；◆37℃水浴12-48hr直至液體清亮，加入3mol/L的NaAc(pH＝4.8)；◆40℃水浴12hr，離心收集上清；◆往溶解的菌體里加入600μl預冷的Nuclei Lysis Solution，輕微振蕩10sec；◆加入3μlRNase Solution混合均勻。37℃放置15-30min；◆加入200μlProtein Precipitation Solution混合均勻，置于冰上5min；◆離心13000rpm×4min；◆將上清轉入含有600μl的異丙醇里，上下混合均勻，離心13000rpm×1min；◆棄上清，用70％乙醇洗滌一次，離心13000rpm×1min；◆小心吸棄上清，室溫干燥；◆加入TE溶解DNA。
PCR擴增反應及電泳鑒定PCR擴增反應的條件、方法同步驟1。電泳鑒定結果圖8示1-5為PCR擴增條帶，與分子質量標記比較顯示約399bp，與理論上所得的擴增片段大小相同。
3.rBCGIL-2蛋白水平鑒定在液體培養基中培養至OD600值約為1時，先誘導rBCG分泌表達細胞因子(45℃，30min)，4000g/min×10min，離心2次，收獲菌體及上清后，菌體先用超聲裂解法破碎，再加入裂解液(2％SDS，0.1M DT，0.01％溴甲酚綠，0.06MTris-Cl，10％甘油)煮沸5min提取蛋白。分別將樣品用1×PBS洗滌三遍，以去除培養液中的白蛋白。收集第一遍洗滌液和最終的沉淀進行western blot鑒定。
SDS-PAGE分離rBCGIL-2總蛋白將洗滌液和2×SDS上樣緩沖液按1∶1混合(10μl+10μl)，沸水中變性10min后直接上樣。
制備凝膠板按下列條件配制12％的分離膠和5％的濃縮膠
12％分離膠(6ml) 5％濃縮膠(3ml)30％丙烯酰胺溶液 2.4ml 0.5ml1.5mmol/L Tris-HClpH8.8 1.55ml /0.5mmol/L Tris-HClpH6.8 / 0.38ml去離子水 1.93ml 2.1ml10％SDS 60μl 30μl10％APS 60μl 30μlTEMED 2.4μl 3μl電泳濃縮膠用8V/cm，分離膠用15V/cm，恒壓電泳2hr，待溴酚藍到達底部時結束。染色觀察。
結果見圖9示泳道1顯示為IFN-α2a蛋白的條帶(相對分子質量約19KD)，泳道2顯示為IL-2蛋白的條帶(約15.5KD)，泳道3，4在相應位置未見蛋白條帶。
Western blotting檢測IL-2的蛋白表達◆常規蛋白電泳分離樣品；◆PVDF膜用甲醇浸濕，去離子水沖洗，再轉移到Transferring buffer中平衡20min，電泳膠置Transferring buffer中平衡20min，裁4張與膠同樣大小的Whatman 3mm濾紙，置Transferring buffer中平衡；◆按下列順序裝好blot負極—2層濾紙—電泳膠—PVDF膜—2層濾紙—正極；◆5％脫脂牛奶/PBST 20ml，水平搖床，室溫封閉1hr；也可以先室溫封閉若干時間，4℃過夜；◆用PBST稀釋一抗，5％BSA，稀釋倍數1000倍，將膜封在塑料袋中，不留氣泡，用膠帶固定在可垂直旋轉的小搖床上，偏轉角度70-80度，水平搖床，室溫1hr；先用PBST短暫地洗2次，再用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗15min；◆用PBST稀釋二抗，5000倍或10000倍稀釋5％BSA，水平搖床，室溫1hr；先用PBST短暫地洗2次，再用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗15min；◆將檢測試劑(ECL plus)從4℃取出，在打開前平衡至室溫，檢測試劑的A液與B液以40∶1的比例混合，檢測試劑的用量為0.1ml/cm2；◆膜置于吸水紙上干燥，蛋白面朝上，檢測試劑加在膜上，覆蓋整個膜表面，室溫2min；◆用鑷子夾起PVDF膜，使膜的下邊角搭在紙巾上，吸干多余的檢測試劑；◆PVDF膜用保鮮膜封起，暗室曝光，時間10sec。
結果圖10示1-2分別為rBCGIL-2中的菌體和培養上清，均可見15.5KD的IL-2蛋白表達；3-4為pBCG的菌體和培養上清，未見蛋白表達；5-6為BCG的菌體和培養上清，未見蛋白表達。
3.rBCGIL-2自分泌IL-2的測定rBCG IL-2在試管中搖床培養10天，OD600值約為0.5時，裝入離心管中，離心2000rpm×10min，仔細吸取上清。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟檢測培養上清中IL-2的水平。以標準品濃度作橫坐標，測得的標準品OD620值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點繪制標準曲線；通過待測標本的OD620值在標準曲線上查出濃度。結果見圖11，與rBCGIFN-α2a相比，只在r BCG IL-2培養上清中檢測到高表達的IL-2為865.68pg/ml；而pBCG和BCG的培養上清中均未檢測到IL-2的表達。
權利要求
1.一種分泌人白介素-2的重組卡介苗的構建方法，其特征在于包括如下步驟1)卡介苗穿梭表達載體的構建根據已有的卡介苗分泌抗原Ag85B信號肽和IL-2的基因序列，分別設計Ag85B信號肽和IL-2的擴增引物，Ag85B信號肽的上下游酶切位點分別為BamHI和EcorI，IL-2的上下游酶切位點分別為EcorI和SalI，經聚合酶鏈式反應分別合成得到Ag85B信號肽和IL-2的基因片段，將Ag85B信號肽克隆到pMV261載體中，得到pMS，再將IL-2基因片段與pMS載體的信號肽連接，得到卡介苗穿梭表達載體pMSIL-2；2)卡介苗的培養選取卡介苗為上海丹麥株，將卡介苗放在含有液體培養基的燒瓶中進行搖床培養，液體培養基含有10％的營養劑ADC、0.5％吐溫80和0.2％甘油，搖床培養100轉/分，三周后卡介苗處于對數生長期，OD600值＝0.6，制得感受態卡介苗；3)電轉化技術構建重組卡介苗rBCGIL-2在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達載體pMSIL-2，置于基因脈沖儀中進行電轉化得到陽性重組子，電轉參數電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω，陽性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養基中篩選，培養兩周后得到陽性克隆rBCGIL-2，然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養基搖床生長，大量培養；4)重組卡介苗rBCGIL-2的鑒定與功能檢測進行抗酸染色初步確定rBCGIL-2為抗酸桿菌，抽提rBCGIL-2質粒DNA后，PCR擴增得到IL-2的基因片段，Western blotting檢測到rBCGIL-2培養上清中和菌體中有IL-2蛋白的表達，ELISA方法檢測到rBCGIL-2培養上清中有高含量的IL-2。
2.根據權利要求1的分泌人白介素-2的重組卡介苗的構建方法，其特征在于所述的Ag85B和IL-2的擴增引物分別為Ag85B sense5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′antisense5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′IL-2sense35′-AGCGAATTCATGGCACCTACTTCAAGTTC-3′antisense5′-AGCGTCGACTCAAGTTAGTGTTGAGATGATGC-3′。
3.根據權利要求1的分泌人白介素-2的重組卡介苗的構建方法，其特征在于所述的pMV261載體上的測序引物為5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′。
4.根據權利要求1的分泌人白介素-2的重組卡介苗的構建方法，其特征在于所述液體培養基和固體培養基中均含有100μ/ml青霉素和100μg/ml放線菌酮。
5.一種采用權利要求1或2的方法構建的分泌人白介素-2的重組卡介苗，其特征在于重組卡介苗包含Ag85B信號肽和IL-2基因片段。
6.一種權利要求5的分泌人白介素-2的重組卡介苗的應用，其特征在于用于人的膀胱腫瘤及結核病的預防和治療。
全文摘要
本發明涉及一種分泌人白介素－2的重組卡介苗rBCGIL－2及其構建方法，利用基因工程技術將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號肽片段和人IL－2的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表達載體pMSIL－2，然后采用電轉化技術將pMSIL－2導入BCG構建重組卡介苗rBCGIL－2，依靠pMSIL－2在BCG的復制和信號肽的分泌作用，能夠高效分泌IL－2。本發明得到的重組卡介苗rBCGIL－2具有BCG和IL－2的雙重效果，能夠有效預防和治療淺表性膀胱腫瘤及結核病；利用重組卡介苗rBCGIL－2在膀胱腔內的局部協同作用減少BCG和外用IL－2的用量，可以克服BCG治療的毒副作用。
文檔編號C12N15/09GK1710072SQ20051002577
公開日2005年12月21日 申請日期2005年5月12日 優先權日2005年5月12日
發明者夏術階, 劉海濤, 孫曉文, 凡杰, 張沂南 申請人:上海交通大學