分泌人干擾素－α2a的重組卡介苗及其構建方法

專利名稱：分泌人干擾素－α2a的重組卡介苗及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗及其構建方法，具體涉及一種包含卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽片斷和干擾素-α2a(IFN-A 2A)的重組卡介苗及其構建方法，得到的重組卡介苗rBCGIFN-α2a用于預防和治療淺表性膀胱腫瘤，屬于基因工程技術領域。
背景技術：
自從1976年Morales首次報告應用卡介苗(BCG)膀胱灌注治療表淺性膀胱腫瘤以來，BCG作為一種有效的免疫佐劑已在防治膀胱腫瘤方面取得了良好效果，目前BCG膀胱灌注已被視為膀胱腫瘤最有效的輔助治療之一。盡管BCG在預防和治療表淺性膀胱腫瘤方面具有良好的療效，但仍有許多問題需要解決。首先是進一步增強膀胱腫瘤對BCG灌注的免疫反應性。國內外文獻表明，表淺性膀胱腫瘤切除術后，即使進行規范的BCG膀胱灌注治療，仍有10％-20％的患者因缺乏免疫反應而導致腫瘤復發[茍欣等“卡介苗和白細胞介素2預防膀胱癌復發長期觀察”，醫藥導報第21卷第9期(2000)]。其次是減少其副作用。在BCG膀胱灌注后，患者常有尿頻、尿急、尿痛、血尿等膀胱炎癥狀，多數可自行緩解，但仍有少數患者會出現膀胱攣縮、BCG敗血癥等嚴重并發癥。
國外研究認為BCG的抗瘤機制與局部細胞免疫、直接細胞毒性作用、細胞因子的細胞殺傷等密切相關，其中IL-2、IFN-γ、TNF-α等多種細胞因子參與到免疫反應中并發揮重要的作用。體外研究和動物實驗表明，BCG聯合應用IFN-α可通過高效誘導IFN-γ、TNF-α等的產生，增強對膀胱腫瘤細胞的殺傷作用，明顯抑制腫瘤的生長與降低腫瘤的復發率。臨床上也有人聯合應用BCG和IFN-α治療淺表性膀胱腫瘤，以及預防膀胱腫瘤術后復發。與單純應用BCG灌注治療比較，患者對聯合治療的免疫反應性更強，療效更確切。但上述細胞因子存在半衰期短、用量大及毒性強的缺點，同時高昂的治療費用限制了其在臨床上的推廣[王緒雷等“卡介苗聯合白細胞介素2防治膀胱癌術后復發”醫藥導報第21卷第9期(2000)]。近年來國內外專家開始重視BCG轉變為疫苗載體的分子生物學研究，并取得了明顯的進展。目前，國內外已將重組BCG疫苗應用于日本血吸蟲病、結核病的動物試驗及臨床中，并取得了良好的效果[甘燕等“多糖佐劑FQ2對日本血吸蟲rBCG Sj26GST疫苗增效作用及其機理的初步探討”中國人獸共患病雜志，19.2(2003)]。但借助基因工程技術構建能夠分泌IFN-α2a的重組卡介苗，以提高膀胱腫瘤療效的研究尚未見報道。

發明內容
本發明的目的在于針對傳統卡介苗的不足，提出一種分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗rBCGIFN-α2a及其構建方法，得到的重組卡介苗rBCGIFN-α2a具有BCG和IFN-α2a的雙重效果，通過促進IFN-α2a的高效分泌來增強膀胱腫瘤患者對BCG免疫治療的反應性，能夠有效預防和治療淺表性膀胱腫瘤；利用重組卡介苗rBCGIFN-α2a在膀胱腔內的局部協同作用減少BCG和外用IFN-α2a的用量，可以克服BCG治療的毒副作用。
為實現這一目的，本發明利用基因工程技術將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號肽片斷和人IFN-α2a的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表達載體pMSIFN-α2a，然后采用電轉化技術將pMSIFN-α2a導入BCG構建重組卡介苗rBCGIFN-α2a，Ag85B信號肽是BCG自身起分泌作用的抗原，可以協助外源基因分泌至細胞外。依靠pMSIFN-α2a在BCG的復制和信號肽的分泌作用，能夠高效分泌IFN-α2a。
本發明分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗rBCG IFN-α2a的構建方法通過下述步驟實現步驟1卡介苗穿梭表達載體的構建與鑒定根據GeneBank已有的卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽和人IFN-α2a的基因序列，分別設計Ag85B信號肽和IFN-α2a的擴增引物，Ag85B信號肽的上下游酶切位點分別為BamHI和EcorI，IFN-α2a的上下游酶切位點分別為EcorI和SalI。經聚合酶鏈式反應(PCR)分別合成得到Ag85B信號肽和IFN-α2a的基因片段，先將Ag85B信號肽克隆到pMV261載體中得到pMS，再將IFN-α2a基因片段與pMS載體的信號肽連接，得到卡介苗穿梭表達載體pMSIFN-α2a。
步驟2卡介苗的培養選取卡介苗BCG為上海丹麥株(H37Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG專用液體培養基為含有10％的營養劑ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐溫80和0.2％甘油的Middlebrook7H9broth(Difco產品)。將卡介苗放在含有液體培養基的燒瓶中進行搖床培養，搖床培養100轉/分，三周后卡介苗處于對數生長期(OD600值＝0.6)，制得感受態卡介苗。本發明所用的液體培養基中還可以加入青霉素100μg/ml、放線菌酮100μg/ml預防細菌感染。
步驟3電轉化技術構建重組卡介苗rBCGIFN-α2a制備好感受態卡介苗后，在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達載體pMSIFN-α2a，置于基因脈沖儀中進行電轉化得到陽性重組子，電轉參數電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω。陽性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養基中篩選，培養兩周后得到陽性克隆rBCGIFN-α2a，然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養基搖床生長，大量培養。
電轉化構建rBCGIFN-α2a采用含有50μg/ml卡那霉素的固體培養基Middlebrook 7H10(Difco產品)進行抗性篩選，液體培養基為含有50μg/ml卡那霉素的Middlebrook 7H9 broth。固體培養基及液體培養基還可加入青霉素100μg/ml、放線菌酮100μg/ml預防細菌感染。
步驟4重組卡介苗rBCGIFN-α2a的鑒定與功能檢測進行抗酸染色初步確定rBCGIFN-α2a為抗酸桿菌，抽提rBCGIFN-α2a質粒DNA，PCR擴增得到IFN-α2a的基因片斷，Western blotting檢測到rBCGIFN-α2a培養上清中和菌體中有IFN-α2a蛋白的表達，ELISA方法檢測到rBCGIFN-α2a培養上清中有高含量的IFN-α2a。
本發明所用試劑均為市購，本發明所用電轉化方法及檢測方法為常規已知方法。
本發明構建的重組卡介苗rBCG IFN-α2a與傳統卡介苗比較，在采用相同劑量(106cfu/0.1ml)的情況下，能夠在體外明顯抑制膀胱腫瘤細胞，差別有顯著性。分別應用于8只T739小鼠膀胱腫瘤模型(來自于該品系的膀胱腫瘤細胞種植于小鼠大腿內側形成腫瘤)，采用腫瘤局部注射治療的方法，發現重組卡介苗在腫瘤消退的小鼠數目(8/8vs.2/8)、腫瘤消退時間(1Wvs.3W)、無瘤生存時間(8Wvs.2W)及對該腫瘤細胞的免疫力方面，均優于傳統卡介苗。
本發明構建的rBCG IFN-α2a能夠應用于臨床，預防和治療表淺性膀胱腫瘤，不僅可以提高傳統BCG的藥物療效，減少患者腫瘤復發的風險；而且可以減少膀胱腫瘤患者的醫療支出，既有利于患者，也有利于減輕社會醫療費用負擔，因而有良好的推廣價值和臨床應用趨向。


圖1為卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽片斷的PCR擴增電泳圖。
圖2為卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽片斷的測序圖。
圖3為人IFN-α2a的PCR擴增電泳圖。
圖4為人IFN-α2a的測序圖。
圖5為人卡介苗穿梭表達質粒pMSIFN-α2a的酶切電泳圖。
圖6為人卡介苗穿梭表達質粒pMSIFN-α2a的測序圖。
圖7為rBCGIFN-α2a的抗酸染色圖。
圖8為rBCGIFN-α2a抽提質粒DNA的PCR擴增電泳圖。
圖9為rBCGIFN-α2a的SDS-PAGE結果。
圖10為rBCGIFN-α2a的Western Blotting結果。
圖11為ELISA檢測rBCGIFN-α2a的分泌結果。
具體實施例方式
以下結合附圖和實施例對本發明的技術方案作進一步描述。
實施例1步驟1卡介苗穿梭表達載體的構建1.合成擴增引物根據GeneBank已有的卡介苗主要分泌抗原Ag85B信號肽和人IFN-α2a的基因序列，設計Ag85B信號肽和IFN-α2a的擴增引物，分別為Ag85B sense5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′
antisense5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′IFN-α2a sense5′-AGCGAATTCTGTGATCTGCCTCAAACCCA-3′antisense5′-AGCGTCGACTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC-3′pMV261載體上的測序引物5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′2.Ag85B信號肽基因裝載到pMV261載體中合成信號肽基因并將其克隆到pUCm-T載體中連接(TAKARA)體系pUCm-T載體 1μl信號肽片段(約50ng/μl) 4μlSolμtionI 5μl16℃，連接過夜。
次日將pUCm-TAg85B質粒轉化感受態細菌DH5a，步驟如下(1).取出凍存的DH5a(200μl/Tube)，冰中溶解；(2).取5μl連接液加入菌液中，輕輕混勻，冰浴30min；(3).42℃熱休克1min 30sec，冰浴2min；(4).加入500μl LB液體培養基，于37℃搖床培養，100rpm×45min；(5).取200μl涂布至含有氨芐抗性的培養板上(100μg/ml)；(6).37℃倒置培養過夜，至菌落長出；(7).挑取單克隆至3ml含有氨芐抗性的LB培養基中，于37℃搖床培養，250rpm培養過夜。
抽提pUCm-TAg85B質粒DNA挑選沒有突變的菌落，抽提質粒。按照質粒抽提試劑盒實驗步驟如下(1).將培養過夜的2ml菌液移至2ml離心管中，最高速離心30sec，棄盡上清；(2).在細菌沉淀中加入250μl Solutionl液，振蕩至徹底懸浮；(3).加入250μl Solution 2溶液，立即溫和地上下翻轉離心管5-10次以混勻，使菌體充分裂解直至形成透亮的溶液，此步驟應在5min內完成；(4).加入400μl 4℃預冷的Solution 3溶液，立即溫和并充分地翻轉離心管5-10次以混勻，室溫靜置2min，最高速離心10min；(5).將上清倒入新的離心管中，再次最高速離心10min；
(6).小心吸取上清轉移到DNA吸附柱中(吸附柱置于廢液收集管中)，離心1min，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中；(7).在吸附柱中加入500μl W1液，離心30sec，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中；(8).在吸附柱中加入700μl W2液，離心30sec，棄濾液，并將吸附柱置于同一收集管中，重復一次；(9).最高速離心1min；(10).將吸附柱移入新的干凈的1.5ml離心管中，在DNA吸附膜中央加入60μl預熱到60℃的去離子水，室溫靜置1min，最高速離心1min，得到的即為質粒DNA溶液。
PCR擴增及電泳以抽提質粒DNA為模板，用合成的信號肽兩端引物進行PCR擴增。
反應體系去離子水40.5μlbuffer 5μldNTPs 1μlPrimer sig-F1μlPrimer sig-R1μlTemplate1μlTaq酶 0.5μl反應條件94℃3min94℃30sec54℃1min72℃30sec30cycles72℃10min結果圖1示2-5為PCR擴增條帶，與分子質量標記比較顯示約120bp，與理論上所得的擴增片段大小相同。
對抽提的pUCm-TAg85B質粒DNA進行測序鑒定測序結果見圖2，通過NCBI網站BLAST對照，堿基序列與Ag85B信號肽基因完全一致。表明PCR擴增得到的Ag85B信號肽基因完全正確。
將信號肽基因克隆到pMV261載體中(1).分別酶切信號肽基因所在的T載體和pMV261載體酶切體系去離子水 2μl 去離子水 7μlbuffer 2μl buffer 2μlpUCm-TAg85B15μl pMV261 10μlEcoR I 0.5μlEcoR I 0.5μlBamHI 0.5μlBamHI0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳。
(2).回收信號肽片段和切后的pMV261載體(申友凝膠回收試劑盒)，步驟如下①.在紫外燈切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體并切碎，計算凝膠重量；②.加入三個凝膠體積的DE-A溶液，混勻后于75℃加熱，期間混和幾次，直至凝膠塊完全溶化(約5min)；③.加入1/2個DE-A體積的DE-B溶液，混和均勻；④.吸取上述步驟中的混和液，轉移到DNA制備管(置于2ml離心管)中，離心3600rpm×1min，棄濾液；⑤.將制備管置回離心管，加500μl W1溶液，離心3600rpm×30sec，棄濾液；⑥.將制備管置回離心管，加700μl W2溶液，離心3600rpm×30sec，棄濾液；以同樣的方法再用W2溶液洗滌一次；⑦.將制備管置回離心管中，最高速離心1min，凈棄W2溶液；⑧.將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在DNA制備膜正中央加25μl預熱到60℃的水，室溫靜置1min，最高速離心1min，得到DNA溶液。
(3).連接信號肽和pMV261連接體系連接buffer 1μlpMV261載體 3μl信號肽片段 5.5μl
連接酶0.5μl16℃連接過夜，得到含有信號肽基因的質粒pMS。
(4).轉化(化轉，步驟同前，菌液的抗性為卡那霉素)3.目的基因IFN-α2a電泳鑒定和DNA測序以抽提的質粒DNA為模板，用合成的IFN-α2a基因的兩端引物進行PCR擴增。
反應體系去離子水40.5μlbuffer 5μldNTPs 1μlPrimer F1μlPrimer R1μlTemplate1μlTaq酶 0.5μl反應條件94℃3min94℃30sec54℃1min72℃30sec35cycles72℃10min1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實。結果圖3示IL為PCR擴增條帶，與分子質量標記比較顯示約495bp，與理論上所得的擴增片段大小相同。
DNA測序驗證目的基因IFN-α2a將IFN-α2a的PCR產物連接到pUCm-T載體中(步驟同信號肽克隆到pUCm-T載體)，得到質粒pUCm-TIFN-α2a，轉化感受態細菌DH5a，分別抽提質粒DNA后，進行DNA測序，結果如圖4，通過NCBI網站BLAST對照，堿基序列與IFN-α2a基因完全一致。表明PCR擴增得到的目的基因片段完全正確。
目的基因IFN-α2a全長cDNA裝載入穿梭質粒pMS中回收目的基因IFN-α2a片斷酶切pMS和pUCm-TIFN-α2a
酶切體系water2μlbuffer 2μlpUCm-TIFN-α2a 10μlEcoR I 0.5μlSal I0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實片斷大小分別為4602bp和495bp。回收pMS載體、IFN-α2a片段。
連接反應分別將pMS載體和IFN-α2a片段行體外連接，得到穿梭表達質粒pMSIFN-α2a連接體系連接buffer 1μlpMS載體 2μl外源基因片段6.5μl連接酶 0.5μl酶切驗證穿梭表達質粒酶切體系water 2μlbuffer 2μl穿梭表達質粒 15μlEcoR I 0.5μlSal I 0.5μl37℃作用2hr，1％瓊脂糖凝膠電泳，DNA Marker證實。結果見圖5示IL為pMSIFN-α2a以EcoR I、SalI雙酶切結果為4.6kb、495bp兩條條帶，同預期結果。
測序驗證構建的穿梭表達質粒用pMV261載體上的測序引物對抽提的穿梭表達質粒pMSIFN-α2a進行測序驗證。測序結果見圖6，通過NCBI網站BLAST對照，堿基序列與IFN-α2a基因+Ag85B信號肽基因完全一致。
步驟2卡介苗的培養選取卡介苗BCG為上海丹麥株(H37Rv56209)，由上海生物制品所提供。BCG專用液體培養基為含有10％的營養劑ADC(albumin-extrose-catalase)、0.5％吐溫80和0.2％甘油的Middlebrook7H9 broth(Difco產品)。將卡介苗放在含有液體培養基的燒瓶中進行搖床培養，搖床培養100轉/分，三周后卡介苗處于對數生長期(OD600值＝0.6)，按照下列步驟制備感受態卡介苗◆BCG在Middlebrook 7H9培養基37℃搖床培養(轉速為100-120rpm)◆待培養液OD600值約0.6時將BCG菌液加入離心管中，冰浴2hr；◆將BCG菌液加入離心管中，在冰盒中預冷2hr；◆4℃離心8000g/min×15min，丟棄上清；用原始體積的1/10、預冷的濃度為10％甘油重懸菌體；◆重復上述操作共五次；◆棄上清，加入原始體積1/50的10％甘油重懸菌體即得到感受態細菌，放置室溫下備用。
本發明所用的液體培養基中還可以加入青霉素100μg/ml、放線菌酮100μg/ml預防細菌感染。
步驟3 電轉化技術構建重組卡介苗rBCGIFN-α2a◆在一離心管中混勻400μl感受態BCG(1×108cfu)和2μl穿梭表達質粒(0.4μg)；◆冰浴10min后，轉入預冷的0.2CM的電擊轉化杯中再冰浴10min，置于基因脈沖儀中進行電轉化，電轉參數Voltage2500V，Capacitance25μF，Resistance1000Ω；◆質粒pMSIFN-α2a、pMV261及單純BCG的作用時間分別為22.6、25、26毫秒；◆電轉完成后，迅速加入1000μl培養基(MADC2Tw)，37℃下培養3hr；◆取100-200μl菌液涂抹于含有50μg/ml卡那霉素的固體培養基中，先正面朝上培養，3hr后翻轉平皿，繼續培養直至發現克隆；
◆兩周后挑選陽性克隆，在含2-3ml液體培養基的試管里搖床生長。
▲注此處感受態BCG在轉化時各做一陽性對照pBCG(BCG中只含有空白質粒pMV261)及陰性對照(BCG)。
步驟4重組卡介苗rBCGIFN-α2a的鑒定與功能檢測1.rBCGIFN-α2a的Z-N法抗酸染色(初步鑒定)。
結果見圖7染色后光學顯微鏡鏡檢(目鏡10×，油鏡100×)。在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色。
2.rBCGIFN-α2a DNA水平鑒定(PCR擴增、電泳鑒定)rBCGIFN-α2a質粒DNA的提取◆rBCG質粒DNA的提取將在三角燒瓶內培養四周的rBCG分瓶至15ml試管中，再在試管里搖床培養2周后使OD600約為1，收獲前加入甘氨酸至20mg/ml以干擾胞壁的合成，繼續培養一定時間后收集菌體；◆菌體用生理鹽水洗兩次后懸浮在裂解液(2mg/ml溶菌酶，0.3mol/L蔗糖，25mmol/L Tris-Cl(pH＝8.0)，25mmol/L EDTA(pH＝8.0)，0.2mg/ml溴甲酚綠)中溫浴24-48hr后，加入堿性SDS(20mg/mlSDS，3mol/LNaOH)；◆37℃水浴12-48hr直至液體清亮，加入3mol/L的NaAc(pH＝4.8)；◆40℃水浴12hr，離心收集上清；◆往溶解的菌體里加入600μl預冷的Nuclei Lysis Solution，輕微振蕩10sec；◆加入3μlRNase Solution混合均勻。37℃放置15-30min；◆加入200μlProtein Precipitation Solution混合均勻，置于冰上5min；◆離心13000rpm×4min；◆將上清轉入含有600μl的異丙醇里，上下混合均勻，離心13000rpm×1min；◆棄上清，用70％乙醇洗滌一次，離心13000rpm×1min；◆小心吸棄上清，室溫干燥；◆加入TE溶解DNA。
PCR擴增反應及電泳鑒定PCR擴增反應的條件、方法同步驟1。電泳鑒定結果圖81-8為PCR擴增條帶，與分子質量標記比較顯示約495bp，與理論上所得的擴增片段大小相同。
3.rBCGIFN-α2a蛋白水平鑒定在液體培養基中培養至OD600值約為1時，先誘導兩種rBCG分泌表達細胞因子(45℃，30min)，4000g/min×10min，離心2次，收獲菌體及上清后，菌體先用超聲裂解法破碎，再加入裂解液(2％SDS，0.1M DT，0.01％溴甲酚綠，0.06M Tris-Cl，10％甘油)煮沸5min提取蛋白。分別將樣品用1×PBS洗滌三遍，去除培養液中的白蛋白。收集第一遍洗滌液和最終的沉淀進行western blot鑒定。SDS-PAGE分離rBCGIFN-α2a總蛋白將洗滌液和2×SDS上樣緩沖液按1∶1混合(10μl+10μl)，沸水中變性10min后直接上樣。
制備凝膠板按下列條件配制12％的分離膠和5％的濃縮膠12％分離膠(6ml)5％濃縮膠(3ml)30％丙烯酰胺溶液2.4ml 0.5ml1.5mmol/L Tris-HClPH8.81.55ml/0.5mmol/L Tris-HClPH6.8/ 0.38ml去離子水1.93ml2.1ml10％SDS 60μl 30μl10％APS 60μl 30μlTEMED 2.4μl3μl電泳濃縮膠用8V/cm，分離膠用15V/cm，恒壓電泳2hr，待溴酚藍到達底部時結束。染色觀察。結果見圖9示泳道1顯示為IFN-α2a蛋白的條帶(相對分子質量約19KD)，泳道2顯示為IL-2蛋白的條帶(約15.5KD)，泳道3，4在相應位置未見蛋白條帶。
Western blotting檢測IFN-α2a蛋白表達◆常規蛋白電泳分離樣品；◆PVDF膜用甲醇浸濕，去離子水沖洗，再轉移到Transferring buffer中平衡20min，電泳膠置Transferring buffer中平衡20min，裁4張與膠同樣大小的Whatman 3mm濾紙，置Transferring buffer中平衡；◆按下列順序裝好blot負極—2層濾紙—電泳膠—PVDF膜—2層濾紙—正極，在這一步，要注意PAGE膠上的預染Marker是否清楚，為了避免在轉膜之后膜上的Marker不清楚，可以在這一步，當膠和膜疊在一起時，對應膠上的Marker，用圓珠筆在膜的相應位置做上記號；◆5％脫脂牛奶/PBST 20ml，水平搖床，室溫封閉1hr；也可以先室溫封閉若干時間，4℃過夜；◆用PBST稀釋一抗，5％BSA，稀釋倍數1000倍，將膜封在塑料袋中，不留氣泡，用膠帶固定在可垂直旋轉的小搖床上，偏轉角度70-80度，水平搖床，室溫1hr；先用PBST短暫地洗2次，再用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗15min；◆用PBST稀釋二抗，5000倍或10000倍稀釋5％BSA，水平搖床，室溫1hr；先用PBST短暫地洗2次，再用＞4ml/cm2(膜面積)的PBST，室溫洗15min；◆將檢測試劑(ECL plus)從4℃取出，在打開前平衡至室溫，檢測試劑的A液與B液以40∶1的比例混合，檢測試劑的用量為0.1ml/cm2；◆膜置于吸水紙上干燥，蛋白面朝上，檢測試劑加在膜上，覆蓋整個膜表面，室溫2min；◆用鑷子夾起PVDF膜，使膜的下邊角搭在紙巾上，吸干多余的檢測試劑；◆PVDF膜用保鮮膜封起，暗室曝光，時間10sec。
結果見圖10示，1-2分別為rBCGIFN-α2a中的菌體和培養上清，均可見19KD的IFN-α2a蛋白表達；3-4為pBCG的菌體和培養上清，未見蛋白表達；5-6為BCG的菌體和培養上清，未見蛋白表達。
3.rBCGIFN-α2a自分泌IFN-α2a的測定兩種rBCG在試管中搖床培養10天，OD600值約為0.5時，裝入離心管中，離心2000rpm×10min，仔細吸取上清。按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟檢測培養上清中IFN-α2a的水平。以標準品濃度作橫坐標，測得的標準品OD620值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點繪制標準曲線；通過待測標本的OD620值在標準曲線上查出濃度。結果見圖11示與rBCGIL-2相比，只在rBCGIFN-α2a培養上清中檢測到高表達的IFN-α2a為324.57pg/ml；而pBCG和BCG的培養上清中均未檢測到IFN-α2a的表達。
權利要求
1.一種分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗的構建方法，其特征在于包括如下步驟1)卡介苗穿梭表達載體的構建分別設計Ag85B和IFN-α2a的擴增引物，Ag85B信號肽的上下游酶切位點分別為BamHI和EcorI，IFN-α2a的上下游酶切位點分別為EcorI和SalI，經聚合酶鏈式反應分別合成Ag85B信號肽和IFN-α2a基因片段，將Ag85B信號肽克隆到pMV261載體中，得到pMS，再將IFN-α2a基因片斷與pMS載體的信號肽連接，得到穿梭表達載體pMSIFN-α2a；2)卡介苗的培養選取卡介苗為上海丹麥株，將卡介苗放在含有液體培養基的燒瓶中進行搖床培養，液體培養基含有10％的營養劑ADC、0.5％吐溫80和0.2％甘油，搖床培養100轉/分，三周后卡介苗處于對數生長期，OD600值＝0.6，制得感受態卡介苗；3)電轉化技術構建重組卡介苗rBCGIFN-α2a在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達載體pMSIFN-α2a，置于基因脈沖儀中進行電轉化得到陽性重組子，電轉參數電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω，陽性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養基中篩選，培養兩周后得到陽性克隆rBCGIFN-α2a，然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養基搖床生長，大量培養；4)重組卡介苗rBCGIFN-α2a的鑒定與功能檢測進行抗酸染色初步確定rBCGIFN-α2a為抗酸桿菌，抽提rBCGIFN-α2a質粒DNA后，PCR擴增得到IFN-α2a的基因片斷，Western Blot檢測到rBCGIFN-α2a培養上清中和菌體中有IFN-α2a蛋白的表達，ELISA方法檢測到rBCGIFN-α2a培養上清中有高含量的IFN-α2a。
2.根據權利要求1的分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗的構建方法，其特征在于所述的Ag85B和IFN-α2a的擴增引物分別為Ag85B sense5′-GGATCCATGACAGACGTGAG-3′antisense5′-CTGCCGTGCCGATCATCAAT-3′IFN-α2a sense5′-AGCGAATTCTGTGATCTGCCTCAAACCCA-3′antisense5′-AGCGTCGACTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGC-3′。
3.根據權利要求1的分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗的構建方法，其特征在于所述的pMV261載體上的測序引物為5′-GACAACTTGAGCCGTCCGTC-3′。
4.根據權利要求1的分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗的構建方法，其特征在于所述液體培養基和固體培養基中均含有100μ/ml青霉素和100μg/ml放線菌酮。
5.一種采用權利要求1或2的方法構建的分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗，其特征在于重組卡介苗包含Ag85B信號肽和IFN-α2a基因片段。
6.一種權利要求5的分泌人干擾素-α2a的重組卡介苗的應用，其特征在于用于人膀胱腫瘤的預防和治療。
全文摘要
本發明涉及一種分泌人干擾素－α 2a的重組卡介苗及其構建方法，利用基因工程技術將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號肽片斷和人IFN－α 2a的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表達載體pMSIFN－α 2a，然后采用電穿孔技術將pMSIFN－α 2a導入BCG構建重組卡介苗rBCGIFN－α 2a，依靠pMSIFN－α 2a在BCG的復制和信號肽的分泌作用，能夠高效分泌IFN－α 2a。本發明得到的重組卡介苗rBCGIFN－α 2a具有BCG和IFN－α 2a的雙重效果，能夠有效預防和治療淺表性膀胱腫瘤；利用重組卡介苗rBCGIFN－α 2a在膀胱腔內的局部協同作用減少BCG和外用IFN－α 2a的用量，可以克服BCG治療的毒副作用。
文檔編號C12N15/09GK1710071SQ20051002577
公開日2005年12月21日 申請日期2005年5月12日 優先權日2005年5月12日
發明者劉海濤, 夏術階, 孫曉文 申請人:上海交通大學