專利名稱：哺乳細胞串聯親和純化載體及其純化蛋白復合物的方法
技術領域：
本發明屬于蛋白分離純化領域，具體的說，本發明提供了一種哺乳(動物)細胞(mammalian cell)串聯親和純化載體，其制備方法及其純化蛋白復合物的方法。應用該串聯親和純化載體系統可高效分離蛋白質復合物，研究蛋白質間的物理相互作用。
背景技術：
隨著許多生物全基因組測序的完成，生命科學已進入基因組、蛋白質組等主要研究內容的后基因組時代，新學科蛋白質組學也應運而生。蛋白質-蛋白質間的相互作用分析是蛋白質組學、分析化學、生物化學等多學科交叉的新近熱點研究內容。現在大規模基因組測序產生的海量數據急需系統蛋白質組學來闡明基因編碼的、執行細胞功能的蛋白質作用網絡。各種生命活動是不同功能蛋白質在時空上有序表達和協同作用的結果。細胞中決大多數的酶和調控過程是通過蛋白質復合物或多蛋白質網絡協同作用實現的，細胞信息傳遞和免疫反應等都是蛋白質相互識別和相互作用的結果。分析建立分子間相互作用形成的調節網絡是后基因組時代分子生物學的主要任務之一，蛋白質間的相互作用也蛋白質組學研究的重要內容之一。
近年發展起酵母雙雜交系統(yeast two-hybrid system)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)等許多技術來研究蛋白-蛋白間的相互作用。尤其以Fields等1989年建立的酵母雙雜交系統普遍用來檢測蛋白質間的相互作用，但其操作步驟繁多，及存在較高的假陽性和假陰性結果是酵母雙雜交分析中常面臨的問題。而且，酵母雙雜交系統都用釀酒酵母作為宿主細胞，由于酵母中缺乏適當的修飾酶，因此生物體中那些依靠翻譯后修飾的相互作用在酵母中就不能檢測到。
由Rigaut等1999年首先在酵母中建立的串聯親合純化(Tandem affinitypurification，TAP)方法來分離蛋白質復合物，結合基質輔助激光解吸離子飛行時間/質譜(MALDI-TOF/MS)、電噴霧(ESI)等生物質譜技術來研究蛋白質復合物及蛋白質間的相互作用。TAP技術即構建含有葡萄球菌蛋白A、鈣調素結合肽(calmodulin binding peptide，CBP)和TEV酶切位點(Tobacco Etch Virus，TEV)的TAP標簽(TAP tag)載體，將感興趣的靶蛋白基因與TAP tag載體重組，導入酵母細胞中進行融合表達，表達的融合蛋白通過IgG和鈣調素(Calmodulin)親合柱、在生理狀態下兩次特異親和洗脫而得到較純的蛋白質復合物。蛋白質復合物再通過串聯質譜(Tandem MS，MS/MS)進行蛋白質的鑒定。TAP方法能在生理條件下簡單快速分離含量低的蛋白質復合物；TAP結合MS技術，可以繪制蛋白質-蛋白質之間特異性的物理性相互作用圖而減少假陽性結果。TAP-MS技術較之免疫沉淀-質譜(IP-MS)方法，TAP-MS功能更強大，因IP-MS方法在MS譜圖分析中存在較強的背景而影響蛋白質的鑒定。因此，TAP結合質譜技術現逐漸成為蛋白質組學研究中大規模快速分離鑒定蛋白質復合物的有效手段之一。
串聯親合純化(TAP)最早是用于酵母細胞中分離蛋白復合物，研究生理條件下蛋白-蛋白相互作用。TAP技術通過嵌入一段蛋白標簽(TAP tag)，在目的蛋白的一端(N端或C端)或中部結合蛋白標簽，這樣就在不破壞目的蛋白調控序列的基礎上，使得被標記的目的蛋白的表達量能夠與其在細胞中自然表達水平相當，避免了由于過量表達導致非自然條件下的蛋白質相互作用。經過特異性的兩步親和純化，在生理條件下與目標蛋白發生真實相互作用的蛋白質便可一起被洗脫下來，得到的蛋白復合體就可用質譜鑒定。TAP研究蛋白相互作用的方法集成了經典的親和純化和免疫共沉淀這兩種方法的優點，既通過親和純化可以得到高純度低拷貝數的蛋白質復合體，也利用了免疫共沉淀中運用特異性的標記蛋白與親和柱之間的相互作用，可快速地得到生理條件下與目標蛋白存在真實相互作用的蛋白質。TAP技術是研究蛋白質相互作用的方法學上的巨大突破。
運用TAP技術研究蛋白質相互作用的內容包括鑒定新的蛋白復合物和鑒定已知蛋白復合體中的新組分。TAP技術研究蛋白復合物的好處在于，對那些功能未知的蛋白質或某蛋白新功能的詮釋都可通過與復合物中功能已知的蛋白質的相互作用來推定預測。TAP技術較其他研究蛋白相互作用的方法的優勢在于它可以鑒定出空間上非直接物理相互作用的蛋白分子，而這種情況在蛋白質復合體中又很常見的。因此，運用TAP技術，不僅可以鑒定出傳統研究蛋白質相互作用的技術能夠檢測的組分，而且還能夠找出傳統方法不能鑒定出的新組分。Yoon等運用TAP技術發現了酵母APC復合體中有13個組分，而傳統的遺傳和生化方法只鑒定出了11種組分。運用TAP技術發現新的蛋白質復合體也是TAP應用的重要方面。Bouveret運用TAP方法發現了一種新的Sm類蛋白復合體，該復合體參與mRNA的降解過程。
與傳統研究蛋白相互作用的技術相比，TAP技術研究的是生理條件下細胞中幾種或多種蛋白與蛋白之間的相互作用，假陽性和假陰性結果少；鑒定出的蛋白質相互作用能真實反映細胞中蛋白質分子之間的聯系，實驗結果更加接近真實情況。而且，由于TAP技術與質譜技術的聯用，以及質譜技術的自動化，使得大規模分析蛋白質相互作用成為可能，適合于蛋白質組水平的大規模研究。TAP-MS技術已成功用于酵母和大腸桿菌的蛋白質復合物相互作用網絡分析。很多蛋白質功能是通過蛋白質復合體或蛋白質復合體間的相互作用共同實現的。TAP技術能夠提供大量蛋白質復合體的信息，隨著大量蛋白復合體的數據增加，大規模、全細胞地分析蛋白質之間的相互作用可以揭示細胞內蛋白質復合體之間的相互作用網絡圖。蛋白質之間的相互作用網絡為準確深入了解蛋白功能、揭示細胞生命活動中正常或病變行為的物質基礎，為針對關鍵的蛋白分子設計診斷或治療藥靶提供重要信息。
雖然TAP技術已成功運用于酵母細胞蛋白質相互作用的大規模研究中，但在高等真核細胞中的發展較慢、應用受到限制。這是因為高等真核細胞的基因組比酵母這樣的低等真核細胞更復雜，細胞抽提物中蛋白混合物的高度復雜性，加之蛋白的翻譯后修飾等原因，難于鑒定哺乳細胞中的蛋白復合物及其特征。經典的生化純化方法常常是根據某一目的蛋白的生物物理性質來進行的，由于每一種蛋白的理化特征不一樣，因此各種蛋白的分離純化方法需要研究人員經驗的積累。由于最初Rigaut所構建的含有TAP標簽(TAP tag)的pBS1761、pBS1479等質粒載體適合從酵母中分離蛋白復合物，而對于高等真核細胞和哺乳動物細胞，難于直接使用這些TAP標簽載體有效純化目的蛋白復合物。因此，現在研究者們紛紛發展一些適于在高等哺乳細胞中分離蛋白復合體的TAP載體及蛋白分離系統。
發明內容
本發明的一個目的是提供一種哺乳動物細胞串聯親和純化載體。
本發明的另一個目的是提供一種哺乳動物細胞串聯親和純化載體的制備方法。
本發明的再一個目的是提供一種串聯親和純化載體的應用，即應用上述的串聯親和純化載體純化蛋白復合物的方法。
本發明的一個目的是提供一種哺乳動物細胞串聯親和純化載體。
本發明的串聯親和純化載體的多克隆位點上游含有Flag標簽和鈣調素結合肽序列，并且在Flag標簽和鈣調素結合肽序列之間有煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEV，Invitrogen #12575-015)酶切位點。
該載體多克隆位點上游的Flag標簽由2個相同的8肽組成。
本發明的串聯親和純化載體上還有若干篩選標記，如編碼氨芐青霉素和嘌呤霉素乙酰轉移酶的篩選標記，以方便在大腸桿菌和細胞中篩選轉入TAP載體的陽性克隆。
本發明的串聯親和純化載體的多克隆位點還含有若干個限制性內切酶位點，以便插入目的基因。例如含有BamH I、BstX I、EcoRV及Xho I等酶切位點。
在本發明的一個實施例中，構建了一個命名為p2FCBP的串聯親和純化載體，其具體構成如圖1所示。p2FCBP載體上有BamH I、BstX I、EcoRV及Xho I等多克隆位點供外源基因方便插入，且在多克隆位點上游插入2個相同的8肽組成的Flag標簽(DFlag，即DYKDDDDK)和1個鈣調素結合肽(CBP)序列，在Flag標簽和CBP序列之間有1個TEV蛋白酶酶切位點。載體上還各有一個編碼氨芐青霉素(Amp)和嘌呤霉素乙酰轉移酶(puromycin N-acetyl transferase)的篩選標記，以方便在大腸桿菌和細胞中篩選含有p2FCBP標簽的陽性克隆。
本發明的另一個目的是提供一種上述串聯親和純化載體的制備方法。
該制備方法主要包括(1)載體MSCVpac的酶切制備(2)TAP標簽序列的制備。具體而言，本發明的串聯親和純化載體可按如下方法制備該串聯親和純化載體是在逆轉錄病毒載體MSCVpac的基礎上改建發展而成。即將由2×Flag與TEV酶酶切序列及CBP序列組成的TAP標簽序列加上HindIII和BamH I限制性內切酶的接頭序列，與用限制性內切酶HindIII和BamH I雙酶切的載體MSCVpac連接而成。
本發明的再一個目的是提供一種應用上述的串聯親和純化載體純化蛋白復合物的方法。
本發明的TAP載體用于分離純化高等哺乳細胞中的蛋白復合物，將更為高效和簡便，純化過程包括如下步驟(1)將克隆的目的基因與權利要求1所述的串聯親和純化載體進行重組，獲得重組質粒并穩定表達融合蛋白，制備細胞抽提物；(2)用FLAG單抗純化細胞抽提物；(3)用煙草蝕紋病毒蛋白酶處理(2)的產物；(4)用鈣調素多肽純化(3)的產物。
具體蛋白的分離純化可按下述方法操作。將與p2FCBP載體重組的質粒導入靶細胞中進行穩定表達融合蛋白，制備細胞抽提物。將細胞抽提液加入30-50μl用pH3.5 glycine-HCl平衡過的Anti-FLAG M2 beads(Anti-FLAG M2 AgaroseAffinity Gel，Sigma #A2220)中，混勻，4℃搖動2-3h，1500×g離心5min，去上清，用TBS(50mM Tris-HCl pH7.4，150mM NaCl)洗2-3次。TEV酶酶解緩沖液(50mM Tris-HCl pH8.0，0.5mM EDTA，150mM NaCl，0.1％NP-40，0.1 mM DTT)洗一次，加入含2-4μl 10U/μl TEV酶(Invitrogen #12575-015)室溫搖動2~3h，4℃、1500×g離心5min，保留上清。上清轉移到已用CBB緩沖液(10mM Tris-HClpH8.0，150mM NaCl，1mM MgOAc，1mM Imidazole，2mM CaCl2，10mMβ-ME)平衡過的鈣調素(CM)beads(Calmodulin Affinity Resin，Stratagene #214303)中，4℃搖動過夜，1500×g離心5min，去上清，用CBB緩沖液洗2-3次，加入40~60μl 2×蛋白上樣緩沖液(100mM Tris-HCl pH6.8，2％SDS，20％(V/V)glycerol，0.002％brophenol blue，1.43Mβ-ME)、煮沸3-5min，1500×g離心5min，保留上清。將上清進行12％SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白條帶切割酶解，提取肽段，進行質譜鑒定。
本發明的p2FCBP載體中用僅有16個氨基酸殘基的兩個Flag(2×Flag)標簽序列取代了最初TAP載體上有137個氨基酸殘基組成的Protein A標簽序列，使得標簽分子量大大減小，有利于外源目的基因與TAP載體有效融合表達，減小標簽對融合蛋白的功能或穩定性的影響。而且，2×Flag能與抗Flag的單克隆抗體發生高親和力結合。因此，在第一次分離純化蛋白過程中，由于帶有TAP標簽的靶蛋白含有Flag序列而與Anti-Flag M2特異性結合，那些與靶蛋白有相互作用與其結合形成的蛋白復合物就吸附在Anti-Flag M2 beads上，而其余雜蛋白就被洗脫除去。同理，經過第二次純化后，未與靶蛋白結合或者不含有鈣調素結合肽的蛋白就被洗脫。這樣，經過兩次純化，最終得到非常純的含有目的蛋白的復合物。因此，本發明的TAP載體用于分離純化高等哺乳細胞中的蛋白復合物，與現有的各種TAP載體相比，更為高效和簡便。
圖1為p2FCBP載體構建示意圖。其中，1為兩個Flag標簽序列，2為鈣調素結合肽(CBP)序列，3為TEV酶酶切位點，4為多克隆位點，5為內部核糖體進入位點(IRES)，6為嘌呤霉素乙酰轉移酶(puromycin N-acetyl transferase)位點，7為信號序列，8為5’端長末端重復序列(5’LTR)，9為3’端長末端重復序列(3’LTR)，10為編碼氨芐青霉素序列(Amp)，11為NdeI酶切位點，12為XmnI酶切位點。
具體實施例方式
實施例1 串聯親和純化載體p2FCBP的構建該串聯親和純化載體是在逆轉錄病毒載體MSCVpac的基礎上改建發展而成。即將由2×Flag與TEV酶酶切序列及CBP序列組成的TAP標簽序列加上HindIII和BamH I限制性內切酶的接頭序列，與用限制性內切酶HindIII和BamH I雙酶切的載體MSCVpac連接而成。
制得串聯親和純化載體如圖1所示，命名為p2FCBP。p2FCBP載體上有BamHI、BstX I、EcoRV及Xho I等多克隆位點供外源基因方便插入，且在多克隆位點上游插入2個相同的8肽組成的Flag標簽(DFlag)和1個鈣調素結合肽(CBP)序列，在Flag標簽和CBP序列之間有1個TEV酶酶切位點。載體上還各有一個編碼氨芐青霉素(Amp)和嘌呤霉素乙酰轉移酶(puromycin N-acetyl transferase)的篩選標記，以方便在大腸桿菌和細胞中篩選含有p2FCBP標簽的陽性克隆。
實施例2 將p2FCBP載體應用于鑒定靶蛋白14-3-3ε在QGY7703細胞中的相互作用蛋白(1)細胞培養和收集QGY7703培養在含10％胎牛血清(FCS)的培養液1640中，37℃、5％CO2，每2-3天傳代。細胞生長到80-100％時，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA的消化液處理幾分鐘使細胞脫壁，加入預冷PBS懸浮，離心洗去培養液，再用PBS重復一次。
(2)RT-PCR將收集的106QGY7703細胞抽提總RNA，用50μl無RNA酶的ddH2O溶解。PCR擴增14-3-3ε的正義引物(5’-TATGGATCCGATGATCGAGAGGATCTGGTGTAC-3’)；反義引物為(5’-ATTCTCGAGTCACTGATTTTCGTCTTCCACGTC-3’)。RT-PCR條件是2μl總RNA作為模板，20μmol/L引物各1μl，10mmol/L dNTP 5μl，25mmol/L MgCl210μl，10×PCR buffer 5μl，40U/μl RNase抑制劑1μl，5U/μlAMV RTase XL 1μl，5U/μl AMV Taq聚合酶1μl，總體積50μl。50℃反轉錄30min，94℃、2min滅活反轉錄酶后，94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，共進行30次循環，擴增出一條約750bp的目的帶。純化回收的PCR產物直接測序結果表明，所擴增條帶序列完全正確。
(3)重組質粒的構建將目的PCR產物回收，用BamH I和Xho I雙酶切后，與經BamH I和Xho I雙酶切的TAP tag載體連接，轉化感受態E.coli DH5α，篩選獲得重組質粒，重組質粒經BamH I和Xho I雙酶切后，能切下約750bp的目的帶。將此質粒命名為p2FCBP-14-3-3ε，測序結果也表明重組完全正確。
(4) 穩定轉染細胞的篩選將重組質粒p2FCBP-14-3-3ε用GeneJammer(Stratagene #073003)轉染試劑轉染QGY7703。將在6孔板中對數生長期的QGY7703細胞原培養液棄去，換成900μl含10％FCS的培養液1640。按每孔用量計6μl GeneJammer轉染試劑加入到無血清的培養液1640中，室溫孵育10min，加入2μg質粒(總體積為100μl)室溫孵育10min，加入到培養孔里，37℃、5％CO2培養5-7h后，每孔加入1ml含10％FCS的培養液1640，繼續培養2天。將每孔細胞傳到10cm培養皿中，1-2天后，加入0.5μg/ml puromycin培養，每3天換液一次并添加0.5μg/ml嘌呤霉素(puromycin)，1-2周后獲得穩定轉染細胞。
(5)融合蛋白Western blot收集2×107穩定轉染細胞，加入2ml含20μl蛋白酶抑制劑的裂解液ProteaseInhibitor Cocktail(Sigma #P8340)，冰浴上超聲破碎3min，4℃、12000×g離心25min，保留上清。為了驗證轉染細胞是否有效表達含TAP tag的融合蛋白，將細胞抽提液進行12％SDS-PAGE后，電轉移到PVDF膜上，用FLAG Western檢測試劑盒(Stratagene #200470)針對TAP tag上的FLAG標簽進行Western blot檢測，陽性結果表明表達的融合蛋白含有FLAG標簽。
(6)蛋白復合物的TAP法分離將5ml細胞抽提液加入40μl平衡過的Anti-FLAG M2 beads中，混勻，4℃搖動3h，1500×g離心5min，去上清，用1ml TBS洗2-3次。500μl TEV酶酶解緩沖液洗一次，加入含4μl 10U/μl TEV酶，室溫搖動3h，4℃、1500×g離心5min，保留上清。上清轉移到已平衡過的鈣調素(CM)beads中，4℃搖動過夜，1500×g離心5min，去上清，用1ml CBB緩沖液洗2-3次，加入60μl 2×蛋白上樣緩沖液、煮沸3min，1500×g離心5min，保留上清。將提取蛋白進行12％SDS-PAGE電泳及進行靶蛋白14-3-3ε的Western blot驗證。蛋白混合物經過這兩次特異親和分離后，獲得了較純的蛋白復合物。用抗14-3-3ε的抗體(Santa Cruz SC-1020)對蛋白復合物PVDF轉膜后免疫印跡證實，純化的蛋白復合物中具有靶蛋白14-3-3ε。
(7) 蛋白的質譜鑒定將SDS-PAGE電泳條帶切割，用測序級trypsin進行酶解，提取肽段，進行MALDI-TOF/MS-MS質譜鑒定，用Mascot對SwissProt數據庫進行搜索。通過MS-MS鑒定了14-3-3ε復合物中的組分有14-3-3β和角蛋白CK 1。
實施例3 將p2FCBP載體應用于鑒定靶蛋白14-3-3ε在MHCC97H細胞中的相互作用蛋白步驟同實施例2，只是將插入14-3-3εcDNA的p2FCBP重組載體轉入MHCC97H細胞進行融合蛋白表達。最終的蛋白質譜鑒定顯示，14-3-3ε復合物中的組分有14-3-3β和角蛋白CK 1。
權利要求
1.一種哺乳細胞串聯親和純化載體，其特征在于，在該載體多克隆位點上游含有Flag標簽和鈣調素結合肽序列，并且在Flag標簽和鈣調素結合肽序列之間有煙草蝕紋病毒蛋白酶酶切位點。
2.一種如權利要求1所述的串聯親和純化載體，其特征在于，在該載體多克隆位點上游的Flag標簽由兩個相同的八肽組成。
3.一種如權利要求1所述的串聯親和純化載體，其特征在于，在該載體上有編碼氨芐青霉素的篩選標記。
4.一種如權利要求1所述的串聯親和純化載體，其特征在于，在該載體上有編碼嘌呤霉素乙酰轉移酶的篩選標記。
5.一種哺乳動物串聯親和純化載體的制備方法，其特征在于，先用限制性內切酶HindIII和BamH I分別雙酶切逆轉錄病毒載體和由Flag標簽、鈣調素結合肽序列及Flag標簽與鈣調素結合肽序列之間的煙草蝕紋病毒蛋白酶酶切位點組成的TAP標簽序列，然后將酶切過的逆轉錄病毒載體與TAP標簽序列連接。
6.一種應用權利要求1所述的串聯親和純化載體純化蛋白復合物的方法，其特征在于，將權利要求1所述的載體用于蛋白分離純化，純化過程包括如下步驟(1)將克隆的目的基因與權利要求1所述的串聯親和純化載體進行重組，獲得重組質粒并穩定表達融合蛋白，制備細胞抽提物；(2)用Flag單抗純化細胞抽提物；(3)用煙草蝕紋病毒蛋白酶處理(2)的產物；(4)用鈣調素多肽純化(3)的產物。
全文摘要
本發明屬于蛋白分離純化領域。本發明提供了一種用于哺乳細胞的串聯親和純化載體，其制備方法及其純化蛋白復合物的方法。串聯親合純化(TAP)用于分離蛋白復合物，研究生理條件下蛋白－蛋白相互作用。本發明的串聯親合純化載體適于研究高等哺乳細胞中蛋白質相互作用，用兩個Flag標簽序列取代了最初TAP載體上蛋白A標簽序列，使得標簽分子量大大減小，有利于外源目的基因與TAP載體有效融合表達，減小標簽對融合蛋白的功能或穩定性的影響；同時雙重Flag標簽序列有利于與抗Flag的單克隆抗體發生高親和力結合。因此，本發明的TAP載體用于分離純化高等哺乳細胞中的蛋白復合物，將更為高效和簡便。
文檔編號C12N15/85GK1673378SQ20051002461
公開日2005年9月28日 申請日期2005年3月24日 優先權日2005年3月24日
發明者梁淑芳, 王天翼, 陳先, 楊芃原, 陸豪杰 申請人:復旦大學