專利名稱：基于環介導的等溫擴增技術的血液病毒核酸篩查方法
技術領域：
本發明屬于臨床醫學領域，涉及一種血液篩查方法，更具體地，本發明涉及一種基于環介導的等溫擴增技術(LAMP)原理而開發的血液病毒核酸篩查方法。
背景技術：
現有的血篩方法主要是酶聯免疫檢測(ELISA)，但由于窗口期的存在，常常導致漏檢。已知HCV抗體檢測的窗口期平均為70天，HIV抗體檢測的窗口期平均為22天，而HBsAg則為56天，酶免檢測的窗口期漏檢幾乎不可避免，是當前影響血液安全性進一步提高的瓶頸。最近剛剛完成的上海地區血液安全性評價的研究結果表明，上海地區的血液安全性已經接近發達國家水平，酶免漏檢率遠遠低于10萬分之一，在嚴格的質量管理保障下，新發生的輸血后肝炎幾乎都是由窗口期漏檢所引起。因此必須在血液篩查體系中引入新的篩查方法，大幅度地縮短檢測窗口期，才能進一步提高血液安全性。
歐美國家的經驗表明，核酸檢測(Nucleic Acid Testing，NAT)應用于血液篩查能有效縮短HCV抗體檢測窗口期72％，縮短HIV-1抗體檢測窗口期50％。日本也報道使用HBV DNA的NAT血液篩查方法能進一步減少HBsAg的漏檢。NAT引入血液篩查，能大大縮短病毒檢測的窗口期，提高血液安全性。1999年3月，Chiron公司的TMA技術和Roche公司的AmpliScreen技術在美國FDA的新藥審核程序下應用于血液篩查；1999年7月，歐洲醫療產品規范委員會(CPMP)也規定所有的血漿制品的原料、中試產品和最終產品都應進行HCV PCR檢測；2001年10月，日本和法國將NAT技術運用于血液篩查；2002年3月和2002年10月在新藥審核程序下試用了2年后，美國FDA正式批準Chiron公司的TMA技術和Roche公司的AmpliScreen技術運用于血液篩查。我國衛生行政部門也規定，2003年1月1日以后，所有血漿制品的原料漿在投產前，必須進行NAT檢測。上海市血液中心在2001～2002年間，對Chiron公司的TMA技術在上海血液篩查中應用的可行性進行了評估，證明NAT技術在我國應用具有可行性，并能最大限度地提高我國的血液安全。
環介導的等溫擴增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)技術，是日本榮研化學獨自開發的替代PCR(Polymerase Chain Reaction)的價廉、迅速、簡便、準確的NAT方法，已在世界范圍內申請了技術專利。其特點是對靶基因的6個部位設定4種引物，利用鏈置換反應在恒溫下使靶基因高效擴增。LAMP技術與PCR有著相同的靈敏度，但其技術平臺卻比PCR更優越。由于其反應是多種引物共同啟動，使得反應結果比PCR更特異；由于無須逆轉錄便可直接擴增RNA，LAMP技術更適合RNA病毒的擴增檢測，比PCR節省時間；由于實行的是等溫擴增，使得反應在恒溫水浴箱便可完成，不僅節約儀器成本，而且將使NAT操作方法更簡單，適用于床邊診斷和大量樣品同時檢測。
更為重要的是，LAMP擴增反應體系要求4對引物完全匹配才能進行擴增，因此反應體系中的其他引物對反應的干擾很小，LAMP較PCR更適合進行病毒的雙聯或三聯檢測，在血液篩查中應用不僅大大節約時間，而且還能大幅度縮減檢測成本。經初步研究證明，運用LAMP檢測HBV、HCV能達到Roche Amplicor相同的檢測靈敏度。HBV、HCV和HIV三聯擴增體系也已初步建立，且其檢測靈敏度和特異性均無較大改變，說明在三聯擴增體系中，不同的引物和靶序列之間相互干擾作用比較小。LAMP技術以其簡便、經濟、快速、靈敏和特異的特點，較PCR技術更適合在血液篩查、臨床診斷中應用，開發出的LAMP血液篩查試劑具有廣闊的應用前景。
發明內容
本發明的目的是提供一種迅速、簡便、經濟的血液病毒核酸的篩查檢測方法。
本發明是這樣實現的一種應用于血液篩查的病毒核酸檢測方法，利用環介導的等溫擴增技術(LAMP)來進行，其通過使用特異性引物，利用LMAP技術平臺擴增靶基因的特定區域，在陽性和陰性質控和內對照檢測體系的輔助下，從分子水平對血液病毒進行核酸篩查或檢測。
進一步地，本發明利用LAMP技術擴增HBV、HCV、HIV和res-1的特定靶核酸序列區域，從而實現對于含HBV、HCV、HIV的血液病毒進行核酸篩查或檢測。
進一步地，在本發明所述的血液病毒核酸的篩查檢測方法中，在LAMP血液篩查過程中引入了內對照檢測系統，內對照質控品為不同于擴增病毒靶基因的res-1 DNA或RNA，并使用了時間分辨濁度法同時檢測內對照和病毒靶基因擴增產物。
進一步地，在本發明所述的血液病毒核酸的篩查檢測方法中，所述的特異性引物選自HBV引物SEQ ID NO1-SEQ ID NO50；HCV引物SEQ ID NO51-SEQ ID NO101；HIV引物SEQ ID NO102-SEQ ID NO153；Res-1引物SEQ ID NO154-SEQ ID NO179。
進一步地，在本發明所述的血液病毒核酸的篩查檢測方法中，能將HBV、HCV和HIV合并進行雙檢或三檢，即，。只需經過一次核酸提取、擴增及檢測過程，就可同時檢測樣品中的HBV、HCV和HIV，將原本需要檢測三次的血液篩查過程壓縮為一到二次檢測。
在現有的關于LAMP技術的公開文獻中，沒有將LAMP用于血液篩查的報道。本發明通過使用特異性引物，利用LMAP技術平臺擴增靶基因的特定區域，在一系列質控和內對照檢測體系的輔助下，從分子水平對包括HBV、HCV和HIV在內的血液病毒核酸進行篩查或檢測。
本發明有嚴格的鑒別篩查診斷系統，以保證檢測結果的準確性。該鑒別篩查診斷系統由陽性和陰性質控品、內對照質控品以及相關擴增和檢測體系組成。
本發明中鑒別篩查診斷系統的陽性和陰性質控品是每批實驗檢測結果是否有效的重要標志。對于每批實驗，必須人為引入一個陰性質控品的檢測，以保證反應體系不會出現假陽性結果；對于單一病毒檢測的每批實驗，必須人為引入一個待測病毒的陽性質控品的檢測，而對于多病毒同時檢測的雙聯或三聯檢測，則在每批實驗中針對每項病毒檢測都必須引入相應的陽性質控品的檢測，以保證反應體系不會出現假陰性結果。陰性質控品為經過反復檢測的HBV、HCV和HIV核酸陰性的正常人血漿。針對HBV的陽性質控品，為人工構建的包含HBV特異性待檢靶序列的質粒DNA。針對HCV和HIV的陽性質控品，為通過人工構建的包含HCV或HIV特異性待檢靶序列的質粒在體外轉錄而獲得的相應RNA。
HBV DNA陽性質控品的具體制備方法操作步驟如下a.使用PCR方法獲得編碼HBV表面抗原的一段421bp的DNA片段(Gene Bank IDAY738847.1)b.將該片段以5’BamHI酶切位點和3’PstI酶切位點克隆到pBluescriptII質粒(采購自Invitrogene公司)中，構建重組質粒c.將重組質粒轉化入DH5α菌中，37℃通氣培養過夜后提取質粒DNAd.以0D260對質粒DNA進行定量，連續稀釋至100Copies/ml并分裝-80℃保存，作為HBV DNA陽性質控品以HCV為例，RNA陽性質控品的具體制備方法操作步驟如下a.使用PCR方法獲得編碼HCV 5’UTR區的一段422bp的DNA片段(Gene Bank IDU94722.1)b.將該片段以EcoR V酶切位點克隆到pBluescriptII SK(+)質粒(采購自Invitrogene公司)中，構建重組質粒c.將重組質粒轉化入DH5α菌中，37℃通氣培養過夜后提取質粒DNAd.以OD260對質粒DNA進行定量e.使用T3或T7 RNA聚合酶在體外對質粒DNA進行轉錄f.轉錄產物經Dnase I消化后過柱純化
g.以OD260對所得RNA進行定量，連續稀釋至1000Copies/ml并分裝-80℃保存，作為HCV RNA陽性質控品本發明鑒別篩查診斷系統中內對照質控品是考核每個擴增反應是否正常進行的重要指標。本發明中的內對照質控品為不同于擴增病毒靶基因的res-1 DNA或RNA，以擴增臨界濃度加入到每個擴增反應中，能利用反應條件自身進行擴增，但不影響病毒靶基因的擴增。其擴增產物的出峰時間為60分鐘以后，遠遠滯后于病毒靶基因擴增產物；峰高小于0.3，顯著低于病毒靶基因擴增產物。如果反應結果為在60分鐘以后出現小于0.3的產物峰，則表示反應體系中只有內對照質控品進行了擴增，該標本檢測結果為陰性；如果反應結果為在60分鐘以前出現大于0.3的產物峰，則表示反應體系中待測病毒靶基因進行了擴增，該標本檢測結果為陽性；如果反應結果中，未出現任何產物峰，則表明反應體系因擴增抑制等其他原因導致反應未能正常進行，檢測失敗；如果反應結果中在60分鐘以后出現大于0.3的產物峰，則有可能為待測病毒的拷貝數極低，導致出峰時間延后，也有可能為反應發生了非特異性擴增所致，檢測反應需重復一次。內對照質控品的引入，減少了檢測結果的假陰性和假陽性的發生率，提高了檢測結果的準確性，在血液篩查的核酸檢測領域中非常重要。這就是本發明內對照檢測體系中使用時間分辨濁度法同時檢測內對照和病毒靶基因擴增產物的原理。
根據檢測DNA病毒和RNA病毒的不同，內對照質控品也分為DNA和RNA兩類，通常，構建的質粒DNA直接可作為DNA內對照質控品，而RNA內對照質控品則由構建的表達型質控體外轉錄而來。在雙聯或三聯檢測體系中只需加入一種RNA內對照質控品即可。以HCV為例，內對照質控品的具體制備方法操作步驟如下a.將2692bp的res-1 DNA片段(Gene Bank IDL09270.1)，以BamH I位點克隆入pBluescriptII SK(+)(采購自Invitrogene公司)質粒中，構建重組質粒b.將重組質粒轉化入DH5α菌中，37℃通氣培養過夜后提取質粒DNAc.以OD260對質粒DNA進行定量d.使用T3或T7 RNA聚合酶在體外對質粒DNA進行轉錄e.轉錄產物經Dnase I消化后過柱純化f.以OD260對所得RNA進行定量，連續稀釋至50Copies/ml并分裝-80℃保存，作為HCV檢測內對照質控品本發明鑒別診斷系統中的特異性擴增引物均由發明人設計，通過核酸合成儀制備。核酸合成儀可選用不同廠家、不同型號的產品，也可委托相關的基因公司合成。本發明中的特異性擴增引物是由TAKARA公司合成的。所有引物按照LAMP引物設計原則，通過日本榮研化學網站(www.eiken.co.
jp)上引物設計軟件設計。HBV、HCV、HIV病毒的核酸特異性引物序列如下(1)HBV引物，共10套
(2)HCV引物，共10套
(3)HIV引物，共10套
(4)Res-1引物，共5套
本發明鑒別診斷系統中的輔助試劑包括(1)核酸抽提試劑本試劑可用于同時提取血漿中的病毒DNA和RNA溶液1
<p>溶液2異丙醇100％溶液3乙醇 70％去離子雙蒸水TE緩沖液TirsHCl(pH8.0)10mMEDTA·2Na 10mM(2)LAMP核酸擴增試劑Master Mix.(50mM Tris/pH8.8，25mM KCl，25mM(NH4)2SO4，20mM MgSO4，0.25％Tween20，2mM Betain)Primer Mix.(0.5～1×Master Mix.；1.5～2mM dNTP，40pmol引物)Bst DNA多聚酶本發明鑒別診斷系統的檢測方法，依次按下述步驟進行(1)核酸抽提，使用下述方法可提取HBV DNA加入300μl溶液1至1.5ml的微量離心管加入100μl血清或血漿至離心管，并渦旋振蕩5秒室溫孵育(15-25℃)10分鐘后，煮沸10分鐘，冷卻到室溫加入400μl溶液2至離心管，并渦旋振蕩5秒15,000rpm離心15分鐘，小心吸去上清加入500μl溶液3至離心管，并渦旋振蕩5秒；15,000rpm離心5分鐘，小心吸去上清空氣中干燥10分鐘，加入5μl雙蒸水至離心管，完全溶解沉淀，4℃保存待用。
使用下述方法可同時提取HBV DNA，HCV RNA和HIV RNA加入300μl溶液1至1.5ml的微量離心管加入100μl血清或血漿至離心管，并渦旋振蕩5秒室溫孵育(15-25℃)10分鐘加入400μl溶液2至離心管，并渦旋振蕩5秒；15,000rpm離心15分鐘，小心吸去上清加入500μl溶液3至離心管，并渦旋振蕩5秒；15,000rpm離心5分鐘，小心吸去上清空氣中干燥10分鐘，加入5μl雙蒸水至離心管，完全溶解沉淀，4℃保存待用(2)LAMP反應1.按照下列步驟進行LAMP DNA擴增準備Reaction Mix.(10人份)Master Mix.100.0μlPrimer Mix.30.0μlBst DNA Polymerase 20.0μl(16U/管)補雙蒸水至終體積為 200.0μl將Reaction Mix.混勻，分裝到0.2ml八聯PCR小管，每管20μl八聯PCR小管中分別加入(1)步驟抽提出的模板，每管5μl，陽性對照品和陰性對照品各5μl，分別用作陽性對照、陰性對照，混合均勻八聯PCR小管放入實時濁度儀LA-200，設定反應條件60℃，60分鐘實驗結束，取出八聯PCR小管，并保存數據2.按照下列步驟進行LAMP RNA擴增a.準備Reaction Mix.(10人份)Master Mix.100.0μlPrimer Mix.30.0μlAMV反轉錄酶12.5UBst DNA多聚酶 160U補雙蒸水至終體積為 200.0μlb.將Reaction Mix.混勻，分裝到八聯PCR小管，每管20μlc.八聯PCR小管中分別加入(1)步驟抽提出的模板，每管5μl，陽性對照品和陰性對照品各5μl，分別用作陽性對照、陰性對照，混合均勻d.八聯PCR小管放入實時濁度儀LA-200，設定反應條件60℃，60分鐘e.實驗結束，取出八聯PCR小管，并保存數據
3.按照下列步驟進行LAMP HBV、HCV和HIV三聯擴增或HCV和HIV二聯擴增準備Reaction Mix.(10人份)Master Mix. 100.0μlPrimer Mix.(HBV)30.0μlPrimer Mix.(HCV)30.0μlPrimer Mix.(HIV)30.0μlAMV反轉錄酶 12.5UBst DNA多聚酶 160U補雙蒸水至終體積為 200.0μl進行三聯檢測時，所有Primer Mix都要加入到反應體系，但進行HCV和HIV二聯檢測時，不加HBV Primer Mix將Reaction Mix.混勻，分裝到八聯PCR小管，每管20μl八聯PCR小管中分別加入(1)步驟抽提出的模板，每管5μl，陽性對照品和陰性對照品各5μl，分別用作陽性對照、陰性對照，混合均勻八聯PCR小管放入實時濁度儀LA-200，設定反應條件60℃，60分鐘實驗結束，取出八聯PCR小管，并保存數據(3)結果判定本發明擴增產物的檢測采用濁度法。在Mg+的作用下，LAMP擴增而得的長鏈核酸分子能相互交聯成絮狀沉淀，且沉淀的量隨擴增產物的增加而增加。因此實驗結果的判定有如下兩種方法定性觀察在反應結束后，實驗結果可以通過肉眼觀察直接判讀(附圖1)，反應體系中未加入內對照質控品時可用此法直接判定結果。
實時檢測可以通過LA-200以及其配套LA-200 Program Ver0.18軟件，獲得實時的反應液中濁度的變化數據，并進行圖象處理，判定結果(附圖2，3)。反應體系中加入內對照質控品時，只能用此法判定結果。
圖1顯示了在未加入內對照質控品時，紫外光下肉眼直接觀察濁度。
圖2顯示了HBV單檢時，在加入內對照質控品后，通過LA-200 Program Ver0.18軟件提供的實時數據，進行圖象處理的結果。其中，兩條虛線所代表的標本為HBV DNA陽性，兩條實線所代表的標本為HBV DNA陰性。
圖3顯示了HBV、HCV和HIV三聯檢測時，通過LA-200 Program Ver0.18軟件提供的實時數據，進行圖象處理的結果。其中，標本Sl為陽性，標本S2為陽性，標本S3中所有病毒核酸均為陰性，標本S4為可疑結果，需重復檢測確認，標本S5為檢測失敗，需重新檢測。
具體實施例方式
實施例1 HBV血液篩查鑒別系統操作方法的應用實例HBV血液篩查鑒別系統(50人份)，其組成包括
具體操作方法如下(1)核酸抽提按照下列步驟進行HBV核酸抽提a.加入300μl溶液1至1.5ml的微量離心管b.加入100μl血清或血漿至離心管，并渦旋振蕩5秒c.室溫孵育(15-25℃)10分鐘后，煮沸10分鐘，冷卻到室溫d.加入400μl溶液2至離心管，并渦旋振蕩5秒；15,000rpm離心15分鐘，小心吸去上清e.加入500μl溶液3至離心管，并渦旋振蕩5秒；15,000rpm離心5分鐘，小心吸去上清f.空氣中干燥10分鐘，加入5μl雙蒸水至離心管，完全溶解沉淀，4℃保存待用(2)LAMP反應1.按照下列步驟進行HBV LAMP核酸擴增(10人份)a.準備Reaction Mix.
Master Mix.100.0μlPrimer Mix.30.0μl
雙蒸水50.0μlBst DNA Polymerase20.0μlTotal 200.0μlb.將Reaction Mix.混勻，分裝到八聯PCR小管，每管20μlc.八聯PCR小管中分別加入(1)步驟抽提出的模板，每管5μl，陽性對照品和陰性對照品各5μl，分別用作陽性對照、陰性對照，混合均勻d.八聯PCR小管放入實時濁度儀LA-200，設定反應條件60℃，60分鐘實驗結束，取出八聯PCR小管，并保存數據結果判定在未加入內對照質控品時，實驗結果可以通過肉眼觀察直接判讀，結果見附圖1；當加入內對照質控品后，也可以通過LA-200 Program Ver0.18軟件提供的實時數據，進行圖象處理，判定結果如附圖2。附圖2中，兩條紅色曲線所代表的標本為HBV DNA陽性，兩條黑色曲線所代表的標本為HBV DNA陰性。
實施例2 HBV、HCV和HIV三聯血液篩查鑒別系統操作方法一、病毒血液篩查鑒別系統(50人份)，其組成包括
具體操作方法如下(1)核酸抽提按照下列步驟進行HBV，HCV和HIV核酸抽提加入300μl溶液1至1.5ml的微量離心管加入100μl血清或血漿至離心管，并渦旋振蕩5秒室溫孵育(15-25℃)10分鐘加入400μl溶液2至離心管，并渦旋振蕩5秒；15,000rpm離心15分鐘，小心吸去上清加入500μl溶液3至離心管，并渦旋振蕩5秒；15,000rpm離心5分鐘，小心吸去上清空氣中干燥10分鐘，加入5μl雙蒸水至離心管，完全溶解沉淀，4℃保存待用(2)LAMP反應1.按照下列步驟進行HBV、HCV、HIV LAMP核酸擴增(10人份)a.準備Reaction Mix.
Master Mix.100.0μlPrimer Mix.30.0μl雙蒸水 50.0μl酶混合緩沖液 20.0μlTotal 200.0μl將Reaction Mix.混勻，分裝到八聯PCR小管，每管20μl八聯PCR小管中分別加入(1)步驟抽提出的模板，每管5μl，陽性對照品和陰性對照品各5μl，分別用作陽性對照、陰性對照，混合均勻八聯PCR小管放入實時濁度儀LA-200，設定反應條件60℃，60分鐘實驗結束，取出八聯PCR小管，并保存數據結果判定實驗結果可以通過肉眼觀察直接判讀；也可以通過LA-200 Program Ver0.18軟件提供的實時數據，進行圖象處理，判定結果見附圖3。結果標本S1為陽性，標本S2為陽性，標本S3中所有病毒核酸均為陰性，標本S4為可疑結果，需重復檢測確認，標本S5為檢測失敗，需重新檢測。內對照質控品的引入，有效地防止了類似標本S5的假陰性結果造成的漏檢。
序列表<110>上海市血液中心<120>基于環介導的等溫擴增技術的血液病毒核酸篩查方法<160>179<170>Patentln version 3.1<210>1<211>42<212>DNA<213>引物<400>1aggacaaacg ggcaacatac cttcttcatc ctgctgctat gc 42<210>2<211>42<212>DNA<213>引物<400>2tccaggaaca tcaaccacca gcaggttcct tgagcaggaa tc 42<210>3<211>20<212>DNA<213>引物<400>3gctatcgctg gatgtgtctg 20<210>4<211>20<212>DNA
<213>引物<400>4acagcaacaa gagggaaaca 20<210>5<211>24<212>DNA<213>引物<400>5ccagaagaac caacaagaag atga 24<210>6<211>42<212>DNA<213>引物<400>6aggacaaacg ggcaacatac cttcttcatc ctgctgctat gc 42<210>7<211>42<212>DNA<213>引物<400>7tccaggaaca tcaaccacca gcaggttcct tgagcaggaa tc 42<210>8<211>20<212>DNA<213>引物<400>8gctatcgctg gatgtgtctg 20
<210>9<211>20<212>DNA<213>引物<400>9acagcaacaa gagggaaaca 20<210>10<211>23<212>DNA<213>引物<400>10ggtagtccag aagaaccaac aag 23<210>11<211>42<212>DNA<213>引物<400>11gataaaacgc cgcagacaca tccccaacct cttgtcctcc aa 42<210>12<211>44<212>DNA<213>引物<400>12cctgctgcta tgcctcatct tctgacaaac gggcaacata cctt 44<210>13<211>20
<212>DNA<213>引物<400>13caaaattcgc agtccccaac 20<210>14<211>19<212>DNA<213>引物<400>14ggtggttgat gttcctgga19<210>15<211>19<212>DNA<213>引物<400>15cagcgatagc caggacaaa19<210>16<211>20<212>DNA<213>引物<400>16gttggttctt ctggactacc 20<210>17<211>42<212>DNA<213>引物<400>17
gataaaacgc cgcagacaca tccccaacct cttgtcctcc aa 42<210>18<211>44<212>DNA<213>引物<400>18cctgctgcta tgcctcatct tctgacaaac gggcaacata cctt44<210>19<211>20<212>DNA<213>引物<400>19ccaaaattcg cagtccccaa 20<210>20<211>18<212>DNA<213>引物<400>20gcaggttttg catggtcc 18<210>21<211>18<212>DNA<213>引物<400>21cagcgataac caggacaa 18
<210>22<211>16<212>DNA<213>引物<400>22tgttggttct tctgga 16<210>23<211>41<212>DNA<213>引物<400>23gattggaggt tggggactgc gaattttcta gggggagcac c 41<210>24<211>42<212>DNA<213>引物<400>24tggctatcgc tggatgtgtc tgatgaggca tagcagcagg at 42<210>25<211>20<212>DNA<213>引物<400>25agagtctaga ctcgtggtgg 20<210>26<211>20<212>DNA
<213>引物<400>26gggcaacata ccttggtagt 20<210>27<211>41<212>DNA<213>引物<400>27tgattggagg ttggggactg caattttcta gggggagcac c 41<210>28<211>42<212>DNA<213>引物<400>28tggctatcgc tggatgtgtc tgatgaggca tagcagcagg at 42<210>29<211>20<212>DNA<213>引物<400>29agagtctaga ctcgtggtgg 20<210>30<211>20<212>DNA<213>引物<400>30
gggcaacata ccttggtagt 20<210>31<211>42<212>DNA<213>引物<400>31gtgattggag gttggggact gcaattttct agggggagca cc 42<210>32<211>42<212>DNA<213>引物<400>32ggctatcgct ggatgtgtct gcatgaggca tagcagcagg at 42<210>33<211>20<212>DNA<213>引物<400>33agagtctaga ctcgtggtgg 20<210>34<211>20<212>DNA<213>引物<400>34gggcaacata ccttggtagt 20<210>35
<211>20<212>DNA<213>引物<400>35gaattttggc caggacacgt 20<210>36<211>42<212>DNA<213>引物<400>36aggacaaacg ggcaacatac cttcttcatc ctgctgctat gc 42<210>37<211>42<212>DNA<213>引物<400>37tccaggaaca tcaaccacca gcaggttcct tgagcaggaa tc 42<210>38<211>20<212>DNA<213>引物<400>38gctatcgctg gatgtgtctg 20<210>39<211>20<212>DNA<213>引物
<400>39acagcaacaa gagggaaaca 20<210>40<211>25<212>DNA<213>引物<400>40gtccagaaga accaacaaga agatg 25<210>41<211>42<212>DNA<213>引物<400>41aggacaaacg ggcaacatac cttcttcatc ctgctgctat gc 42<210>42<211>42<212>DNA<213>引物<400>42tccaggaaca tcaaccacca gcaggttcct tgagcaggaa tc 42<210>43<211>20<212>DNA<213>引物<400>43gctatcgctg gatgtgtctg 20
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<213>引物<400>48gctatcgctg gatgtgtctg 20<210>49<211>20<212>DNA<213>引物<400>49acagcaacaa gagggaaaca 20<210>50<211>25<212>DNA<213>引物<400>50ggtagtccag aagaaccaac aagaa 25<210>51<211>43<212>DNA<213>引物<400>51ggttkatcca agaaaggacc cagtcgccat agtggtctgc gga 43<210>52<211>38<212>DNA<213>引物<400>52
ccgcaagact gctagccgag gcaagcaccc tatcaggc 38<210>53<211>22<212>DNA<213>引物<400>53ggcgttagta tgagtgtcgt ac22<210>54<211>18<212>DNA<213>引物<400>54catggtgcac ggtctacg 18<210>55<211>15<212>DNA<213>引物<400>55ttgggttgcg aaagg15<210>56<211>38<212>DNA<213>引物<400>56caccctatca ggcagtacca agactgctag ccgagtag 38<210>57
<211>39<212>DNA<213>引物<400>57gggaggtctc gtagaccgtc gtttggtttt tctttgagg 39<210>58<211>22<212>DNA<213>引物<400>58ggcgttagta tgagtgtcgt ac22<210>59<211>18<212>DNA<213>引物<400>59ctccaccaac gatctgac 18<210>60<211>14<212>DNA<213>引物<400>60caaggccttt cgcg 14<210>61<211>19<212>DNA<213>引物
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<210>66<211>13<212>DNA<213>引物<400>66caaggccttt cgc 13<210>67<211>19<212>DNA<213>引物<400>67catgagcacg aatcctaaa19<210>68<211>40<212>DNA<213>引物<400>68tggaggctgc acgacactca actgtcttca cgcagaaagc 40<210>69<211>40<212>DNA<213>引物<400>69ggaaccggtg agtacaccgg cccaaatctc caggcattga 40<210>70<211>19<212>DNA
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<212>DNA<213>引物<400>79cctcccggga gagccatagt gtcgtcctgg caattccg 38<210>80<211>19<212>DNA<213>引物<400>80cactcccctg tgaggaact19<210>81<211>20<212>DNA<213>引物<400>81cgggttgatc caagaaagga 20<210>82<211>40<212>DNA<213>引物<400>82tggaggctgc acgacactca actgtcttca cgcagaaagc 40<210>83<211>39<212>DNA<213>引物<400>83
ggaaccggtg agtacaccgg agcccaaatc tccaggcat 39<210>84<211>19<212>DNA<213>引物<400>84cactcccctg tgaggaact19<210>85<211>18<212>DNA<213>引物<400>85actcggctag cagtctcg 18<210>86<211>18<212>DNA<213>引物<400>86gacgaccggg tcctttct 18<210>87<211>38<212>DNA<213>引物<400>87actatggctc tcccgggagg acgcagaaag cgtctagc 38<210>88
<211>40<212>DNA<213>引物<400>88accggtgagt acaccggaat tggcacgccc aaatctccag 40<210>89<211>20<212>DNA<213>引物<400>89cccctgtgag gaactactgt 20<210>90<211>20<212>DNA<213>引物<400>90acccaacact actcggctag 20<210>91<211>21<212>DNA<213>引物<400>91cacgacactc atactaacgc c 21<210>92<211>19<212>DNA<213>引物
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<212>DNA<213>引物<400>110tttgctggtc ctttccaa 18<210>111<211>17<212>DNA<213>引物<400>111tggatgaata ctgccat 17<210>112<211>26<212>DNA<213>引物<400>112aacagacata caaactagag aat tac 26<210>113<211>40<212>DNA<213>引物<400>113ccccaatccc cccttttctt agacagcagt acaaatggca 40<210>114<211>47<212>DNA<213>引物<400>114
agtgcagggg aaagaatagt agacgctgtc cctgtaataa acccgaa 47<210>115<211>23<212>DNA<213>引物<400>115ggtaagagat caggctgaac atc 23<210>116<211>20<212>DNA<213>引物<400>116gctggtcctt tccaaagtgg 20<210>117<211>18<212>DNA<213>引物<400>117ttaaaattgt ggatgaat 18<210>118<211>22<212>DNA<213>引物<400>118gcaacagaca tacaaactaa ag22<210>119
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<400>123ttaaaattgt ggatgaat 18<210>124<211>22<212>DNA<213>引物<400>124gcaacagaca tacaaactaa ag22<210>125<211>46<212>DNA<213>引物<400>125cgtaacacta ggcaaaggtg gcttctctac aatacttggc actagc 46<210>126<211>42<212>DNA<213>引物<400>126ccagaagacc aagggccaca acagcttcat tcttaagctc ct 42<210>127<211>23<212>DNA<213>引物<400>127ggtgtgaata tcaagcagga cat 23
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ggtgtgaata tcaagcagga ca22<210>137<211>23<212>DNA<213>引物<400>137gagccaaatc ctaggaaaat gtc 23<210>138<211>46<212>DNA<213>引物<400>138cgtaacacta ggcaaaggtg gcttctacaa tacttggcac tagcag 46<210>139<211>46<212>DNA<213>引物<400>139agatggaaca agccccagaa gactctagtg tccattcatt gtgtgg 46<210>140<211>23<212>DNA<213>引物<400>140gcaggacata acaaggtagg atc 23<210>141
<211>23<212>DNA<213>引物<400>141cagcttcatt cttaagctcc tct 23<210>142<211>45<212>DNA<213>引物<400>142gtcttctggg gcttgttcca tctaaaagat aaagccacct ttgcc 45<210>143<211>46<212>DNA<213>引物<400>143gggagccaca caatgaatgg acagagccaa atcctaggaa aatgtc 46<210>144<211>23<212>DNA<213>引物<400>144gcactagcag cat taataac acc 23<210>145<211>22<212>DNA<213>引物
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<210>150<211>23<212>DNA<213>引物<400>150gcactagcag cattaataac acc 23<210>151<211>22<212>DNA<213>引物<400>151agatatgttg ccctaagcca tg22<210>152<211>23<212>DNA<213>引物<400>152tcctctgtca gtttcgtaac act 23<210>153<211>25<212>DNA<213>引物<400>153gaggagctta agaatgaagc tgtta 25<210>154<211>42<212>DNA
<213>引物<400>154acgagcggct tccatctttg atacgactct tttggccaaa cc 42<210>155<211>42<212>DNA<213>引物<400>155cacaatccgt tgatgtcgct gcaaagagcg gtatccccat ga 42<210>156<211>20<212>DNA<213>引物<400>156cggagttgct tcaatctgct 20<210>157<211>20<212>DNA<213>引物<400>157gcgcatttct ttgcaccatt 20<210>158<211>25<212>DNA<213>引物<400>158agaagaagct aataatgcga tgtgg 25
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gcgcatttct ttgcaccatt 20<210>168<211>25<212>DNA<213>引物<400>168agaagaagct aataatgcga tgtgg 25<210>169<211>42<212>DNA<213>引物<400>169acgagcggct tccatctttg attcttttgg ccaaaccgtc tt 42<210>170<211>42<212>DNA<213>引物<400>170cacaatccgt tgatgtcgct gcatcaaaag agcggtatcc cc 42<210>171<211>20<212>DNA<213>引物<400>171cggagttgct tcaatctgct 20<210>172
<211>20<212>DNA<213>引物<400>172gcgcatttct ttgcaccatt 20<210>173<211>25<212>DNA<213>引物<400>173agaagaagct aataatgcga tgtgg 25<210>174<211>34<212>DNA<213>引物<400>174taacgagcgg cttccccaaa ccgtctttca ccac 34<210>175<211>34<212>DNA<213>引物<400>175gcaacacaat ccgttgaaag agcggtatcc ccat 34<210>176<211>20<212>DNA<213>引物
<400>176gctatctgca tgaacgactc 20<210>177<211>18<212>DNA<213>引物<400>177gcgcatttct ttgcacca 18<210>178<211>24<212>DNA<213>引物<400>178gatttagaag aagctaataa tgcg 24<210>179<211>22<212>DNA<213>引物<400>179gtcgctgccc aaattataaa cc2
權利要求
1.一種應用于血液篩查的病毒核酸檢測方法，利用環介導的等溫擴增技術LAMP來進行，其特征在于，通過使用特異性引物，利用LMAP技術平臺擴增靶基因的特定區域，在陽性和陰性質控和內對照檢測體系的輔助下，從分子水平對血液病毒進行核酸篩查或檢測。
2.根據權利要求1所述的用于血液篩查的病毒核酸檢測方法，其特征在于利用LAMP技術擴增HBV、HCV、HIV和res-1的特定靶核酸序列區域。
3.根據權利要求2所述的用于血液篩查的病毒核酸檢測方法，其特征在于所述的內對照檢測體系中，內對照質控品為不同于擴增病毒靶基因的res-1 DNA或RNA，并使用時間分辨濁度法同時檢測內對照和病毒靶基因擴增產物。
4.根據權利要求1、2、3任一所述的用于血液篩查的病毒核酸檢測方法，其特征在于，所述的特異性引物選自HBV引物SEQ ID NO1-SEQ ID NO50；HCV引物SEQ ID NO51-SEQ ID NO101；HIV引物SEQ ID NO102-SEQ ID NO153；Res-1引物SEQ ID NO154-SEQ ID NO179。
5.根據權利要求4所述的用于血液篩查的病毒核酸檢測方法，特征在于將HBV、HCV和HIV合并進行雙聯或三聯檢測。
全文摘要
本發明屬于臨床醫學領域，公開了一種基于環介導的等溫擴增技術原理對血液進行篩查的病毒核酸檢測方法，通過使用特異性引物，利用LMAP技術平臺擴增靶基因的特定區域，在一系列質控和內對照檢測體系的輔助下，從分子水平對包括HBV、HCV和HV在內的血液病毒核酸進行篩查或檢測。本發明的方法具有簡便、經濟、快速、靈敏和特異的特點，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK1687454SQ20051002454
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月23日 優先權日2005年3月23日
發明者王迅, 易進華, 鄭嵐, 伍曉菲, 裴愛琳 申請人:上海市血液中心, 上海復旦張江生物醫藥股份有限公司