專利名稱：一種偶發分枝桿菌及在微生物轉化生產睪酮中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物轉化技術領域，具體涉及一種偶發分枝桿菌及在微生物轉化生產睪酮中的應用。
背景技術：
甾體類藥物是一大類在臨床上具有特殊治療作用，且其他藥物無法替代的極其重要的藥物。其中，睪酮(17β-羥基雄甾-4-烯-3-酮，Testosterone，TS；具下述式I結構) 作為一種雄激素藥物，可以促進雄性動物第二性征的發育和性器官的成熟，近年來作為替代療法被用于治療男性患者的原發性或繼發性性腺功能減退癥。國外對此已有大量研究。另外，睪酮是蛋白同化激素的重要前體物質，蛋白同化激素的主要作用在于改善蛋白代謝，促進蛋白質合成和減少蛋白質異生，減少鈣、磷排泄，減輕骨髓抑制，恢復和增強體力、利尿降壓等。由于其具有顯著的抗衰老和抗癌作用，應用范圍日益擴大。
生產睪酮傳統工藝是以來自天然植物資源的甾體皂苷作為原料進行一系列的化學合成。其中不僅涉及到天然資源的消耗，還由于大量化學反應步驟的參與而造成嚴重的環境污染。
微生物轉化技術的應用使甾體類藥物的制備工藝研究得到了長足的進步。特別是二十世紀八十年代以來，將微生物轉化技術應用于甾體關鍵中間體制備的研究取得突破性的進展。世界醫藥強國，尤其是美國和日本，利用本國的農副產品——植物甾醇為原料經微生物轉化獲得關鍵中間體，以此合成甾體藥物，從而不僅解決了植物資源有限而帶來的原料瓶頸問題，且大大地降低了制造成本和減少了環境污染。
對于睪酮而言，國外也相應進行了微生物轉化方法方面的研究。目前報道的主要是使用雄甾烯二酮(androst-4-ene-3，17-dione，4AD；見下述式II結構)作為底物進行一步微生物氫化轉化成睪酮；或者使用單一甾醇如谷甾醇進行微生物轉化得到睪酮。
由于前者牽涉到制備4AD底物本身還需經過一系列反應步驟，故相比之下后者更為優越。如能獲得轉化能力足夠高、而且易于大規模培養的微生物菌種，則可大大提升該線路的工業化應用價值。
發明內容
本發明的目的在于通過菌種選育手段結合轉化條件的優化，獲得可實現睪酮高轉化率、具產業化應用價值的突變菌株。
本發明公開的高轉化率的睪酮生產菌株為偶發分枝桿菌(Mycobacterium foruitum)突變株，該菌種微生物保藏號為CGMCCNo.1241。該菌株以偶發分枝桿菌(Mycobacterium foruitum)DSMZ2966為出發菌種，經自然選育、化學物理誘變等處理而獲得。具體誘變、篩選步驟包括1、出發菌株偶發分枝桿菌(Mycobacterium foruitum)DSMZ 29662、培養基斜面/平板培養基含適量葡萄糖、酵母粉、蛋白胨及瓊脂。此培養基用于出發菌株的培養、菌種的自然分離、菌種常規傳代等目的。
轉化培養基葡萄糖4.0％，酵母浸出粉1.0％，磷酸二氫鉀0.7％，谷甾醇0.5％，吐溫80 0.1％。
3、轉化產物的分析方法-HPLC試樣制備轉化液2ml中定量加入丙酮8ml，振蕩混勻后放置過夜。取上層清液1ml于15000rpm離心10分鐘，上清液供HPLC檢測。
色譜柱C18，ODS，4.6mm×250mm，5μm檢測器Agilent 1100檢測波長242nm柱溫50℃流動相甲醇∶水＝80∶20(體積比)流速0.8ml/min4、自然分離取菌種的新鮮斜面一支加入少量無菌水，輕輕刮下菌苔倒入裝有無菌玻璃珠和無菌水的三角瓶中，充分振搖10分鐘，用塞有脫脂棉的無菌漏斗過濾，得到菌懸液。菌懸液梯度稀釋后涂布于平板培養基上，培養到長出單菌落。
5、紫外誘變(1)長波紫外誘變按上述自然分離中同樣方法獲取菌懸液，以380nm的輻射波長對菌種進行誘變處理。處理后梯度稀釋并涂布于平板培養基，于28℃避光培養。
(2)短波紫外誘變按上述自然分離中同樣方法獲取菌懸液，以260nm的輻射波長對菌種進行誘變處理。處理后梯度稀釋并涂布于平板培養基，于28℃避光培養。
6、γ-射線(60Co)誘變按上述自然分離中同樣方法獲取菌懸液，取出2ml置于容量為10ml的無菌加塞三角瓶中。將三角瓶置于60Co輻射源照射。處理后梯度稀釋并涂布于篩選平板，于28℃培養。
7、NTG誘變在由磷酸緩沖液制備的菌懸液系統中加入NTG于28℃搖床上培養處理后，取樣梯度稀釋涂布篩選平板，28℃培養。
8、搖瓶篩選將經選育處理得到的單菌落接種斜面28℃培養成熟后，接種到含轉化培養基的搖瓶中進行液體培養轉化，HPLC檢測轉化產物。
經過反復篩選最終得到一株轉化率是出發菌株10倍以上的突變菌株，該突變菌株經傳代考察證明其遺傳穩定，經合理的傳代次數后轉化生成睪酮的能力可保持在同等水平。該微生物菌種公開保藏號為CGMCC 1241。菌株選育系譜見圖1；出發菌株和篩得的突變菌株各自轉化產物的HPLC圖譜見圖2和圖3。
采用本發明誘變、篩選獲得的CGMCC 1241菌株進行睪酮制備時，可以4AD、動植物甾醇為底物直接轉化生成睪酮；其中動植物甾醇選白膽甾醇、谷甾醇、菜油甾醇或它們的混合物。底物甾醇的添加濃度為0.1％-3.0％。
采用本發明菌株進行睪酮制備時，其培養基中可利用的碳源選自糊精、檸檬酸鹽、甘油、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉，含量為1.0％-6.0％；氮源可選自酵母粉、復合氨基酸、蛋白胨、玉米漿、尿素、硝酸鹽、銨鹽，含量0.2％-5.0％；轉化中可添加磷酸鹽、鎂鹽、納鹽等微量元素；還可添加吐溫80等表面活性劑，以促使固體甾醇更好地溶解，有利于轉化率提高。
本發明采用CGMCC 1241菌株進行睪酮制備時，優選的轉化培養基為葡萄糖1.0％-6.0％、酵母粉0.2％-2.0％、磷酸二氫鉀0.5％-1.5％、動植物甾醇0.1％-3.0％，吐溫80 0-0.5％；轉化溫度為20℃-40℃，優選25℃-30℃；轉化pH為4-9，優選pH5-7；轉化時間5-9天。
采用上述條件優化組合制備睪酮，在從250ml三角搖瓶到10噸發酵罐上最終可實現80％以上的轉化率。轉化產物經萃取、柱層析等步驟可獲得純度高于90％的睪酮產品。
本發明獲得的突變菌株達到了高轉化率生成睪酮的目的，具有產業化應用價值。
圖1.偶發分枝桿菌(Mycobacterium foruitum)CGMCC 1241菌種選育系譜其中NS表示自然分離，UV380表示380nm波長的紫外線處理，UV260表示260nm波長的紫外線處理，NTG表示亞硝基胍處理。
圖2.出發菌株轉化產物的HPLC圖譜圖3.菌株CGMCC 1241轉化產物的HPLC圖譜具體實施方式
實施例1 菌種穩定性考察---傳代對轉化的影響斜面培養基葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，聚蛋白胨0.8％，瓊脂粉1.5％。
種子培養基葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，磷酸二氫鉀0.2％。
轉化培養基葡萄糖4.0％，酵母浸出粉1.0％，磷酸二氫鉀0.7％，谷甾醇0.5％，吐溫80 0.1％；消前pH6.5。
培養條件斜面培養溫度28℃，培養時間5天；種子液培養溫度28℃，培養時間2天；轉化培養溫度28℃，培養時間5天。搖瓶轉速220rpm/min，旋轉式搖床振蕩培養。
實施例2 突變株與出發菌株轉化率的比較培養基及培養條件同實施例1。
突變株與出發菌株的對照試驗結果如下
實施例3 搖瓶轉化試驗斜面培養基、種子培養基和各階段培養條件同實施例1。
轉化培養基糊精5.0％，蛋白胨1.2％，硝酸鉀0.1％，磷酸二氫鉀0.5％，膽甾醇1.0％，吐溫80 0.2％；消前pH 5.8。
培養條件同實施例1。
轉化率為80.2％。
實施例4 搖瓶轉化試驗斜面培養基、種子培養基和各階段培養條件同實施例1。
轉化培養基可溶性淀粉3.5％，葡萄糖1.0％，玉米漿2.0％，磷酸二氫鉀0.8％，混合植物甾醇(谷甾醇∶菜油甾醇＝2∶1)2.0％，吐溫80 0.1％。
轉化培養時間7天，其余培養條件同實施例1。
轉化率為83％。
實施例5 7噸發酵罐轉化試驗斜面培養基、種子培養基、轉化培養基、斜面和種子培養條件同實施例4。7噸發酵罐條件控制如下溫度25℃，通氣量1∶1(vol∶vol)，攪拌轉速300rpm，周期7天。生成睪酮轉化率為81.7％。
實施例6按實施例5得到的轉化液經過丙酮浸泡，用乙酸乙酯萃取，萃取液濃縮，經過硅膠柱層析(洗脫液環己烷∶乙酸乙酯＝7∶1)得到純度為92％的睪酮產品。
權利要求
1.一種偶發分枝桿菌(Mycobacterium foruitum)突變株，微生物菌種保藏號為CGMCC No.1241
2.根據權利要求1所述的偶發分枝桿菌突變株CGMCC No.1241在制備睪酮中的應用。
3.一種采用權利要求1偶發分枝桿菌突變株CGMCC No.1241制備睪酮的方法，其特征在于該方法采用的轉化培養基碳源選自糊精、檸檬酸鹽、甘油、蔗糖、麥芽糖、甘露醇、葡萄糖、可溶性淀粉，含量為1.0％-6.0％；氮源選自酵母粉、復合氨基酸、蛋白胨、玉米漿、尿素、硝酸鹽、銨鹽，含量0.2％-5.0％；轉化溫度為20℃-40℃，轉化pH為4-9；轉化時間5-9天。
4.根據權利要求3所述的偶發分枝桿菌突變株CGMCC No.1241制備睪酮的方法，其特征在于其中所述的轉化培養基為葡萄糖1.0％-6.0％、酵母粉0.2％-2.0％、磷酸二氫鉀0.5％-1.5％、動植物甾醇0.1％-3.0％，吐溫80 0-0.5％。
5.根據權利要求3所述的偶發分枝桿菌突變株CGMCC No.1241制備睪酮的方法，其特征在于其中所述的轉化溫度為25℃-30℃，轉化pH為5-7。
全文摘要
本發明涉及偶發分枝桿菌(Mycobacterium foru－itum)突變株CGMCC1241及在微生物轉化生產睪酮中的應用。該菌株能以高轉化率實現底物動植物甾醇到產物睪酮的轉化，具備產業化應用價值。
文檔編號C12N1/20GK1670185SQ20051002419
公開日2005年9月21日 申請日期2005年3月3日 優先權日2005年3月3日
發明者戈梅, 付磊, 凌良飛, 陳代杰, 夏興 申請人:上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司, 浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠